計測線虫（Caenorhabditis elegans）寿命

要約

このプロトコルでは、測定する手法を提案線虫（Caenorhabditis elegans）寿命。

要約

寿命はいくつかの遺伝的経路により調節生物学的なプロセスです。老化の生物学を調査する一つの戦略は、年齢、調節経路の成分の港の変異その動物を研究することです。これらの変異は摂動年齢規制経路の機能を、したがって全体の生物の寿命を変更する場合、彼らは^1-3の重要なメカニズムの洞察を提供しています。

寿命の規制を調査するために別の戦略は、摂動年齢調節経路に小分子を使用することです。日付に、分子の数は、様々なモデル生物の寿命を延ばすことが知られていると^4-16を老化の生物学を研究するためのツールとして使用されます。これまでに同定された分子の数は、高齢化の生物学を研究するために利用できる遺伝"ツールセット"に比べて小さいです。

線虫（Caenorhabditis elegans）は 、その優れた遺伝学と三週間の短い寿命のため経年変化を研究するために使用される原理のモデルの一つです。最近では、 線虫は、その小さなサイズとマイクロタイタープレート中で成長する能力の表現型に基づく薬剤の画面^5,7,16-20のためのモデル生物として注目されています。

ここでは、96ウェルマイクロタイタープレート中で線虫の寿命を測定するアッセイを提示する。アッセイを開発し、成功した線虫の寿命^7を拡張する分子のために大規模なライブラリーをスクリーニングするために使用されていました。アッセイの信頼性は、複数の試験で評価した：最初に、異なる温度で成長野生型動物の寿命を測定することによって、第二、変更された寿命を持つ変異体の寿命を測定することによって、第三に、異なる濃度に反応して寿命の変化を測定することにより、抗うつMirtazepineの。 Mirtazepineは、以前に虫 ⁷の寿命を延ばすことが示されている。これらのテストの結果は、アッセイは、他のアッセイから、以前の結果を再現することができると定量的であることを示している。マイクロフォーマットは、自動液体ハンドリングシステムとこの寿命アッセイの互換性が高まりますし、自動化されたプラットフォームへの統合を可能にします。

プロトコル

概要：プロトコルは4つの部分に分割されています。第1部では、摂食バクテリアを準備する方法について説明します。第2部では、ワームの文化を準備する方法について説明します。パート3は、寿命を獲得する方法について説明します。パート4は、いくつかの代表的な結果を示し、そして第5は、必要なソリューションを準備する方法について説明します。寿命の実験が完了するまでに数週間かかる。各プロトコルの週のステップ、一日、一日の時間の計画を容易にするために含まれています。 L4段階（0日）は全体のプロトコルのための基準点として使用されます。

1。摂食菌の調製

このセクションでは、摂食細菌の準備について説明します。特定のE.大腸菌は線虫を供給するために使用菌株OP50と呼ばれています。他の細菌とワームの文化の交差汚染を防ぐために、このプロトコルに先立ち、OP50菌株をカルベニシリン/アンピシリン耐性²¹なされている。事前にOP50 4〜5日を準備します。 OP50と接触するすべての材料は無菌でなければならない。

-7日：木曜日（週1）：接種で、37夜にわたってシングルOP50コロニーとインキュベートします細菌のシェーカーでCと100μg/ mlのアンピシリンおよび0.1μg/ mLのアムホテリシンBを含むTBの5 mLの。

日-6：金曜日（週1）。

朝8時半。文化のための十分な時間が飽和状態に到達できるように早期に接種する

1. 50μg/ mlのアンピシリンを含む300mLのTBでOP50 1:2000の一晩培養を希釈する。飽和状態に達するまで37℃で8-12時間のための細菌シェーカー° Cで培養液を、。文化が14時間よりも長く成長するようにしてください。
2. 滅菌、事前に加重遠心分離管にOP50を移す。ペレットテーブルトップ遠心機3500回転（2200 × g）で10分間の遠心分離によってOP50。
3. 上清を捨て、遠心分離によって滅菌水及び再ペレットのOP50ペレットを再懸濁する。二回洗浄を繰り返します。
4. 回目の洗浄後、残りのすべての水を慎重に取り外します。ない水がチューブ内に残っていない必要があります。ペレットを含む遠心管の重量を測定し、ペレットの重量を決定するために、空の遠心管の重量を引く。
5. 徹底的には100 mg / mLの濃度にS -完全にペレットを再懸濁する。いいえ塊が残ってはいけません。
6. 100 mg / mLのOP50の濃度は2 × 10 ¹⁰細菌/ mlに対応している必要があります。 mL当たり細菌の光学密度と数との関係が知られている場合mL当たりの細菌数を決定するために写真の分光器を使用してください。必要に応じて、2 × 10 ¹⁰細菌/ mlにOP50栄養溶液の濃度を調整する。
7. それはワームの培養に使用されるまで4℃でOP50solution保管してください。

2。同期ワームの文化の調製

このセクションでは、ワームの文化の準備について説明します。その目標は、ワームの年齢同期人口を生成することです。手順5の漂白剤治療後の線虫との接触のすべての材料は無菌でなければならない。特に断らない限り、プレートを20℃に保たれている。

日-6：金曜日（週1）、16:00に： 新鮮なプレートに動物を転送

1. ワームの人口の大多数が飢餓のL1幼虫から構成される5〜10日齢のNGMプレートを取る。
2. まもなくブンゼンバーナーの上に加熱することによって、金属へらを滅菌する。それが冷ます。飢えたワームを含むプレートから寒天の塊を切り出すために冷却ヘラを使用してください。 OP50を接種した新鮮な10cmのNGMプレート上に、これらのチャンクのいくつかを移す。約インキュベート。ワームの人口の大半が妊娠成人で構成されています° Cまで20℃65時間。それは妊娠大人に成長するために飢えたL1の動物のために要する時間は、菌株から菌株によって異なる場合があります。

デイ-3：月曜日（週2）午前10:00は： 同期人口を確立

3. 50〜10 mLの滅菌水でプレートを離れてそれらを洗浄して10 cmのプレートからワームを収集する。 15 mLコニカルチューブにワーム/水溶液を移す。
4. 1200rpmで（280 × g）で卓上遠心機で2分間の遠心分離することによって、ワームを洗ってください。上清を捨て、10mlの水を加える。繰り返します。
5. 上清を除去し、作りたての漂白剤/ NaOH溶液（2.5 mLの家庭用漂白剤、1mLの10N水酸化ナトリウム、6.5 mLのH ₂ O）5 mLを加える。ワームが開いて中断するまで、室温で5分間インキュベートする。穏やかにボルテックス毎分にしてください。解剖顕微鏡下で反応の進行状況を監視します。
6. とすぐにすべての大人の反応を中和するために追加、M9バッファー5 mLを溶かす。
7. （2500rpmで2分を遠心分離することによって10mLのM9バッファーで卵を3回洗浄1100 × g）で。
8. 2500 RPM（1100 × g）で2分を遠心分離することによって10mlのS -完全で一度卵を洗ってください。
9. 上清を除去、10mLの新鮮な50 mLコニカルチューブに解決策をS -完了し、転送する追加します。 40mlの最終容量にS -完全30mLを追加します。優しくnutatorまたは類似のデバイス上で、室温で一晩チューブを振る。

日-2：火曜日（週2）、12:00： プレートにシード動物を

10. 解剖範囲の下で、ワームは夜の間に孵化したかどうかを確認してください。解剖スコープを使用して10μL滴のワームの数をカウントすることでS -完全なソリューションで、ワームの濃度を決定する。各サンプルの少なくとも10滴を数える。
11. S -完全に80から100ワーム/ mLの濃度でワームを再び一時停止。は0.1μg/ mlの最終濃度50μg/ mLとし、アムホテリシンB（株式250μg/ mlの）の最終濃度にカルベニシリンを（株式は100 mg / mL）を追加。 nutatorに振る。ワームの大規模な量を準備している場合、フィルタキャップで600mlのnunclonのフラスコを使用してください。
12. 午後2時30分に6 mg / mLの（= 1.2 × 10 ⁹細菌/ ml）の最終濃度になるようにパート1で調製したOP50を追加。 OP50〜4℃を返す
13. 96ウェルプレートの各ウェルにworm/OP50ソリューションの120μLを転送する。透明な底部を96ウェルプレートを使用してください。ピペッティングしながら懸濁液中にワームを維持することを確認してください。
14. 汚染や蒸発を避けるために、テープシーラーを使用してプレートをシール。 2分間のマイクロタイタープレートシェーカー上でプレートをシェイクし、動物がL4段階に達するまで20℃で2日間Cインキュベートする。

0日目：正午前の木曜日（週2）：Fluorodeoxyuridine（FUDR）を追加することによって、動物を滅菌

15. 動物を滅菌するために各ウェルに0.6 mMのFUDRストック溶液30μLを加える。このステップでは、150μLを各ウエルに最終的なボリュームをもたらし、5 mg / mLの（1 × 10 ⁹細菌/ ml）に6mgを/ mLからOP50の最終濃度を低減します。テープシーラーを使用してプレートをシールし、マイクロタイタープレートシェーカー上で2〜3分間、それを振る。 OP50は、日-2の2時30分追加されている場合、それはFUDRは正午前に追加されていることが重要です。 20℃インキュベーターにプレートを返す

1日目：金曜日（週2）： 文化に薬を追加

16. 9時までの動物のほとんどが妊娠し、それぞれいくつかの卵が含まれていることが必要です。その効果は寿命に所望の濃度で試験される薬剤を追加。 DMSO中で薬物を溶解する場合、DMSOの最終濃度は0.6％が線虫の寿命を短くするよりもDMSOの濃度が高いとして、0.6％を超えないようにしてください。薬剤の添加後、テープシーラーでプレートをシールし、マイクロタイタープレートシェーカー上で2〜3分間、それを振る。 20℃インキュベーターにプレートを返す
17. 薬を追加すると、時々水以外の溶媒を使用する場合は特に、プレート当たり少数の動物を殺すことができる。動物の死骸を確認するために倒立顕微鏡を使用してください。一般的に、96ウェルプレートあたり10未満の動物の死骸があるはずです。 20℃インキュベーターにプレートを返します。

4日目：月曜日（週3）： 変更シーラー

18. シーラーを削除する文化を入力するように新鮮な酸素を許可するには、1分間待ってからプレートを再シール。マイクロタイタープレートシェーカー上で2〜3分間プレートを振る。毎週一回繰り返します。

第5日：火曜日（第3週）： 飢餓を防ぐために、新しいOP50を追加する

19. 飢餓を防ぐために、96のウェルの各々にパート1で作製した100 mg / mLのOP50溶液5μLを追加。

3。寿命のスコアリング。

このセクションでは、動物が死ぬまでパート2の同期ワームの人口の生存率が監視されている方法について説明します。 96ウェルプレートで動物を観察するには、2倍または2.5倍を目的とした倒立顕微鏡を使用してください。週3回、生存データを記録し、月曜日、水曜日と金曜日。動物が生きているか死んでいるかどうかを判断する動きを使用してください。強い光、特に青色光は、移動する動物を誘導する。アッセイから動物の死骸を削除しないでください。時折、移動していないと、前のカウントには死んで決定された動物は、後で移動する場合があります。

1. 0日目に、実験の開始時に各ウェルにワームの総数を数えます。これらの井戸の動物としての分析から、18以上の動物が含まれている井戸の検閲は、十分なOP50を持っていないし、食事制限の効果が表示されます。
2. 動物は2分間のマイクロタイタープレートシェーカー上で96ウェルプレートを振る移動する機会を増やすために。カウントの前に。
3. 各カウントセッション、基準日と動物の数になる生きた動物のように移動する。液体の動きは、固形培地上でよりもはるかに簡単ですし、強力なライトで誘導することができる。より高い倍率の使用は、咽頭の先端のそれらのような非常に微妙な動きを見つけるのに役立つことがあります。そのような微妙な動きは、しばしば非常に古い動物で観察された唯一の運動です。
4. 20℃インキュベーターにプレートを返す
5. すべての動物が死んでいるまで2〜3日ごとに2-4を繰り返します。

4。代表的な結果。

このセクションでは、このアッセイといくつかの代表的な結果によって生成された寿命のデータの記録を保持する方法の例を示しています。

図1Aは、このアッセイ中に寿命のデータを記録する方法の例を示しています。 Excelシートは、各ウェルにおける集団の生存を追跡するために使用されます。各ウェルは、プレート、ひずみ、薬剤、薬剤の濃度と0日で生きている動物の総数（X0）で調整しているため、実験の開始時に記録されます。レコードの日付だけでなく、生者と死者の動物の数は三回、各ウェル内の様々な集団の生存率を追跡するために週。グラフの結果をするために、それぞれの日の生きている動物の割合を計算し、日数、時間の関数としてプロットします。 P -値は、STATAまたは類似のソフトウェアのような統計パッケージを使用して計算する必要があります。

線虫の培地の寿命は温度に依存しています。図1Bは、寿命の温度依存性の変化が正確に寿命アッセイ^22をベースにマイクロタイターで再現されていることを示しています。同様に、マイクロタイタープレートアッセイは、野生型N2の動物^{23〜24 25（}図1C）とは異なる寿命を持つことが報告された変異体からの寿命の変化を再現。

アッセイはまた、より定量的な文を作るために使用することができます。 Fig1Dの平均値での寿命はMirtazepine濃度⁷の関数としてプロットされます。各データポイントは7-12人口の平均寿命は、別の井戸でそれぞれの生活を表しています。ウェル当たりの動物数は、（5-15動物）が比較的低くてもエラーバーから見られるようにウェル間のばらつきは比較的小さいです。

図1寿命アッセイに基づいてマイクロタイタープレートには、正確に寿命の変化は文献で ​​報告されて再現。
（A）サンプルデータはExcelスプレッドシートに収集。各カウントセッションの日付の間に、うまく座標とのライブや死んだ動物の数を記録した。実験の開始時に、各ウェル中の動物の合計数を測定した。 （B）20℃で成長させた野生型（N2）の動物の生存曲線° Cと25℃寿命に影響を与える変異を持つ菌株の（C）の生存曲線。すべての4つの株は20℃で並行して検定したMirtazepine扱わN2の動物の（D）の用量反応曲線。平均寿命はMirtazepine濃度の関数としてプロットされます。エラーバーは、条件ごとに8連のSEMを示す。

5。材料。

M9バッファー、1000mLの

• 6グラムのNa ₂ HPO ₄
• 3グラムのKH ₂ PO ₄
• 5gのNaCl
• 0.25グラムのMgSO _{4∙7H 2} O
• 1000mLの脱イオン水を追加します。
• オートクレーブ

Potassiumphosphate緩衝液pH6.0、1000mLの

• 136グラムのKH ₂ PO ₄
• 900mLの脱イオン水を追加します。
• 5M KOHでpHを6.0に調整する
• 1000mLの脱イオン水を追加します。
• オートクレーブ

微量金属溶液

• 1.86グラムのNa ₂ EDTA
• 0.69グラムのFeSO _{4∙7H 2} O
• 0.20グラムMnCl _2を ∙4H ₂ O
• 0.29グラムZnSO _{4∙7H 2} O
• 0.016グラムのCuSO ₄
• 1000mLの脱イオン水
• オートクレーブと暗闇の中で保管。

S -基礎培地、1000mLの

• 5.9グラムのNaCl
• 1Mリン酸カリウム、pH6.0の50 mLの
• 1000mLの脱イオン水
• オートクレーブ
• 5mgの/ mLのコレステロール（ET - OHに溶解）を1 mLを追加して解決策を冷ますと。

クエン酸カリウムの1M、1000mLの

• 268.8グラムのカリウムのクエン酸
• 26.3クエン酸一水和物
• 900mLの脱イオン水を追加します。
• 5M KOHでpHを6.0に調整する
• 1000mLの脱イオン水を追加します。
• オートクレーブ

S -完全培地、1000mLの

• 977 mLのS -基底
• 10mLの1Mクエン酸カリウムのpHは6（無菌）
• 10mLの微量金属溶液（滅菌）
• 3ミリリットル1MのCaCl _2（無菌）
• 3 mLの1M MgSO _4を （無菌）

NGM寒天培地

• 3.0グラムのNaCl
• 2.5グラムペプトン（カゼインから、膵臓ダイジェスト）
• 17グラム寒天
• 脱イオン水975 mLとし、攪拌バーを追加する
• オートクレーブ
• 55クールダウンオートクレーブ後° Cと、次のコンポーネントを追加します。
  • 1MのCaCl _2（無菌）の0.5 mLを
  • エタノールで5mgの/ mLのコレステロールを1 mL
  • 1M MgSO _4を （滅菌）1mLの
  • 25mLのPotassiumphosphate緩衝液、pH6.0（無菌）

TB、1000mLの

• 12グラムバクトトリプトン
• 24グラムの酵母エキス
• 4 mLのグリセロール
• 900mLの脱イオン水を追加します。
• オートクレーブ
• 55クールダウンオートクレーブ後° Cと、以下のコンポーネントを追加します。
  • 0.17M KH ₂ PO ₄ / 0.72MK ₂ HPO ₄の100 mLを加え

0.6mmのFluorodeoxyuridine（FUDR、Sigmaカタログ＃F0503）、1000mLの

• 100mgのFUDR
• S -完全な滅菌670 mLに溶かし、10 mLまたは45 mLのアリコートを行います。
• -20℃で保存

は100 mg / mlカルベニシリン、10 mLの

• 1グラムカルベニシリン
• 10mLの滅菌脱イオン水
• 無菌ろ過し、分注し
• -20℃で保存
• 濃度50μg/ mlの最終濃度で使用

250ug / mLのアムホテリシンB、4 mLの

• 1mgのアムホテリシンB
• 4 mLのET - OH
• -20℃で保存
• は0.1μg/ mlの最終濃度で使用

ディスカッション

提示プロトコルは、96ウェルマイクロタイタープレート中の線虫の寿命を測定することができます。代表的な結果に示すようにセクションには、確実にこれまでの知見を複製し、定量的な情報を提供します。このアッセイを使用して我々が正常に線虫の寿命に与える影響については89000の分子を介してスクリーニングしている。

薬剤スクリーニングの目的のために、96ウェルマイクロタイタープレートフォーマットでの寿命を測定することは古典的な固体培地アッセイに比べていくつかの利点があります。それはメディアの準備、インキュベーションスペースの量、および必要な薬剤の量に要する労力が軽減されます。 96ウェルフォーマットと顕微鏡のセットアップは、ハイスループットスクリーニングのための全体のアッセイの自動化を可能にする。

アッセイの開発中にこれらの各変数との組み合わせに対して複数の値は、 線虫の寿命に与える影響について試験した。これらのテストは、3〜10の範囲の異なるOP50濃度を含めmg / mLの（3、4、6、8、10 mg / mL）は、7〜45（7、10、15、22、45に至るまで、ウェル当たりワームの数が異なるワーム/ウェル）、40から150ウェルあたりμL（40、60、80、100、120、150μL）、および緩衝液組成の変化に至る様々な文化のボリューム。示された濃度のカルベニシリン耐性OP50、カ ​​ルベニシリンもアムホテリシンBのどちらと供給は、 線虫の寿命に影響を及ぼすことが判明した場合。プレートの連続穏やかに振盪しながら、できるだけ頻繁に虫液体培地で推奨されているが、このアッセイで使用されている小さなボリューム用する不要が判明した。大きな井戸とマイクロタイタープレートを使用する場合は穏やかに振盪しながらしかし必要となります。このプロトコールに示された値は、慎重にテストされたさまざまな条件の統計的な比較に基づいて選択されています。

このアッセイの最も驚くべき特徴は、おそらく虫がテープで封印されている96ウェルプレートに保持することができるという事実です。サイドバイサイドの比較はプラスチックシーラーで密封板で、または空気の交換を可能にするシーラーで密閉プレートで、非密閉型プレートで培養した動物の寿命の違いを明らかにしなかった。 3つの条件すべてに、動物はL1から65時間以内に妊娠した大人への非常に均質に開発され、非常に匹敵する寿命を示した。 NGM上で並行して成長の動物は、わずかに速い開発が、この違いは、シーラーの存在または非存在とは無関係であった。

提示プロトコルは、生菌に基づいていますが、死菌に適合させることができる。しかし、液体アッセイで単一の生存細菌が急速に増殖することができると文化を再作成してください。私たちの手で、それらは液体培養に使用できる程度に細菌を殺すために唯一の信頼できる方法では、ガンマ線照射による細菌の長期治療することです。

寿命の実験の計画で考慮すべき重要なポイントの1つは、検出の力です。効果の大きさに依存して、関心の薬剤の効果は、複数のウェルにテストする必要があります。大体40〜50の動物それぞれに対応する典型的なアッセイ4薬物治療と4つの制御井戸で、実験の95％以上の寿命が30％増加を検出するために十分です。 14％の増加は、患者の60％で検出し、従ってより多くの複製井戸が必要とされています。

このアッセイによって生成された寿命のデータの富は、実験を開発したり、特定のパラメトリックゴンペルツモデル¹株に使用することができます。これらのゴンペルツモデルは、検出の電力を決定するために、大規模スクリーンのために偽陽性と陰性の数を推定するために便利です。我々は、ブラインド実験では、これらのモデルの予測を検証し、大画面（未発表の結果）で偽陰性の数を推定するためにそれらを使用する。

要約すると、我々は提示アッセイは、 線虫の寿命を延ばすと根本的なメカニズムを研究する小分子を同定するために大いに役立つと期待しています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Calbiochem	cat# 171375	Also called Fungizone
FUDR	Sigma-Aldrich	cat# F0503	FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water
Mianserin	Sigma-Aldrich	M2525-250MG	Use as positive control at 50μM final concentration
Cyproheptadine	Sigma-Aldrich	cat#C6022-MG	Alternative positive control at 10 μM final concentration
Sealing Tape	Nalge Nunc international	cat# 236370	Polyester, non-sterile
96 well plate	Falcon BD	cat# 351172	Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene
Nunclon flask	Nalge Nunc international	cat# 178883	used for large volumes