複数のマウスの神経解剖学的磁気共鳴イメージング

要約

磁気共鳴イメージング（MRI）は、遺伝子組み換えマウスの表現型を調べるために、ますますよく使われる道具となっている。この記事では、複数のマウスMRIを用いて遺伝子組み換えマウスのハイスループット表現型解析を実現するために必要なメソッドを示しています。

要約

磁気共鳴画像（MRI）によるマウスの表現型のフィールドは急速にヒト疾患のマウスモデルを特徴付けると評価するための改良されたツールの必要性によって動機づけ、成長している。 MRIは、遺伝子組み換え動物を調査するための優れたモダリティである。それは、脳全体をカバーすることが可能ですin vivoで使用することができる、とneuranatomyと生理学のさまざまな側面を調査するための複数のコントラストメカニズムを提供します。複数のマウスをスキャンする機能とともに、高磁場スキャナーの登場は同時に小説変異の迅速な表現型解析が可能になります。

効果的なマウスMRIの研究は、実験の設計の多くの側面に注意が必要です。この記事では、シールドの送信/受信電波の周波数で同時に画像をマウス（RF）の一般的な磁石のコイル（ボックら 、2003）そのシステムを使用してマウスの表現型解析のために品質の画像を取得する一般的な方法を説明します。我々は、特に解剖学的表現型、私たちのイメージングセンターで多くのマウスモデルでの影響の可能性が高い示されていることが重要とアクセス可能なアプリケーションに焦点を当てる。我々はそのような画像を取得するために詳細な手順を提供する前に、 生体の脳イメージング（太宰治ら 、2004）と注意すべきex vivoでの脳イメージング（春ら 、2007） の両方のための重要な実用的な考慮事項があります。これらについて以下に説明します。

プロトコル

1。 生体脳イメージングのマルチマウス：

イメージング生きた動物、いくつかの重要な機能は、イメージングのセッション全体を通じて存在している必要があります：麻酔、2の1）安全な方法）、環境制御、3）生理学的モニタリング。また、同時に時のイメージング複数のサブジェクト、準備および画像の登録を容易にするために動物の位置の再現性の容易さと速度に関する複雑さをそこに追加されます。その結果、三大カスタムコンポーネントの設計および作製した：ローディングシステムをMRI内のRFコイルにマウスを挿入するために、組み込み監視に準備してプラットフォームを容易にするために誘導チャンバーは、位置を標準化につながります。

ローディングシステム：

"マウスハイブ"と"ロード配列"：マウスの​​ローディングシステムは2つの主要部分で構成されています。マウスハイブの主な機能は、7つのヤスデのRFコイル（バリアンNMRシステム、パロアルト、カリフォルニア州）マグネット内部に六角形の配列に穴を配置するためです。ローディング配列は、麻酔ガスのエントリを可能にするために、そのヒントによってあけられた穴で50ミリリットルの遠心管に収容された複数のマウスを保持して輸送するように設計されています。マウスは磁石の付近に準備領域における麻酔と監視装置とのインタフェースになったら、それらは修正された遠心管に挿入し、負荷のアレイ上にマウントされています。レールシステム上のすべてのマウスをマウントした後、ロードする配列が転送され、磁石に挿入して配置されます。磁石のボアをプッシュダウンするときにレールシステムは、マウスのハイブを持つカップルに配列することができます。完全に磁石、RFコイル内麻酔デリバリーシステムに遠心チューブのドックに挿入する場合。酸素と混合イソフルランは、個々のコイルの軸に沿ってチューブを通してマウスのハイブの端から試料が供給される。この麻酔ガスの混合物は、マウスを過ぎて、チューブ内に流入し負荷の配列（図1）の背面に接続されたアクティブな清掃装置によって収集されます。

誘導商工会議所：

イメージング時間は3時間程度かかることができるので、動物の準備時間を最小限に抑えることが、麻酔にマウスの露出を制限することが重要です。したがって、我々は、準備プロセス（図2）合理化するためのカスタム誘導チャンバーを開発しました。カスタム誘導室は複数のマウスの誘導および処理の両方を単一の環境を作成します。透明なアクリルから構築、誘導室の麻酔漏れを最小限に抑えるためにシリコンアイリスポートをselfclosing機能とは、ユーザーが特別な手袋を必要とせずに内部環境にアクセスすることができます。単一のマウスのための従来のマスクと回路に比べて、誘導室は二十マウスを収容するのに十分な大きさであり、扱いにくいチューブとマスクの付着することなくマウスの自由な操作が可能になります。ユニットはパッシブ掃気システムを使用して収集される麻酔ガスの一定流量で供給されます。抵抗加熱要素は、準備中に動物の体温を維持するために、チャンバーの床面を加熱するために使用されています。

そり：

MRI用マウスを準備の中で最も扱いにくいと時間のかかる側面の一つは、心電図（ECG）電極および直腸温度プローブのアプリケーションです。さらに、このようなカフと針電極として、従来の電極を、、の多くは、それが困難なポジショニングを標準化すること、動物の姿勢を歪めることがわかった。したがって、我々は組み込みECG、呼吸と"そり"（米国特許7146936）（図3）と呼ばれる温度プローブを使用してカスタムフォームフィットポジショニングプラットフォームを考案した。ベルクロファスナーで作られた動きの制約は、頭部の動きを制限するために使用されていました。

in vivoでの脳のイメージングステップで複数のマウス：

1. すべてのマウスの研究は、マウス操作の手順については、地元のACC（アニマルケア委員会）、IACUC（動物実験用の委員会）または同等の承認が必要です。
2. そのような動物の識別、計量などのすべての手順は、生物学的安全キャビネット（BSC）の下とMRIユニットで実行する必要があります。動物は、オートクレーブ可能なプラスチックの容器に移し、MRI誘導室に運ばれます。
3. マウスは、酸素の4％イソフルランと4リットル/ minを使用して、あらかじめ温めておいた誘導室で麻酔する。彼らは足のピンチへの応答に失敗した後の動物は完全に麻酔する。胸から毛皮は、ECGとカスタムそりに組み込まれている温度監視装置とのよりよいコンタクトを提供するために必要に応じてヘアリムーバー（Nairさん）を使用して削除されます。イブの軟膏（涙ナトゥPM）が乾燥しないように目に適用され、そして生理食塩水の約0.3 mLの水和を維持するために皮下に投与される。
4. GD - DTPA - BMA（Omniscan）5月コントラスト強調を希望する場合は使用すること。のGd - DTPAを使用する場合、それは生理食塩水（最終容量300uL）中で希釈され、IPを経由して前のMRのセッションに1ミリモル/ kgの単回投与で投与。
5. マウスは、ヘッドストラップとオープンエンド50mLのコニカルチューブ（図3）にスライドして固定化、個々のそりにロードされます。最大7生きたマウスを一度にスキャンすることができます。一度すべての動物は、接続されている生理学的モニタリングを搭載し8 L / minに2％および酸素のレベルにボア磁石のイソフルランレベルを設定されています。
6. コニカルチューブは、磁石穴の中央に位置する各RFコイルに一様に位置マウスに設計されたドッキングシステム（図1）に搭載されている。一度ロードされると、イソフルランは0.9から2パーセントに減らすことができます。 ECGと温度は、スキャンの過程を通じてそれぞれの動物に監視されます。動物は、暖められた空気と、スキャンの過程で保温されています。
7. それぞれの三次元スキャンの期間は約3時間です。詳細は次のとおりです：2300ミリと36ミリのTEeffのTRで高速スピンエコー。 （1）普通に8の列車の長さをエコー。結果として得られる画像の解像度は125ミクロン（図4）です。
8. スキャンが完了すると、動物は、磁石から削除され、100％酸素で満たされた暖かい誘導チャンバ内でアンロードされます。動物は、プラスチック製の密閉容器に移し、BSCの下に輸送される。彼らは暖かいドラフトフリーケージの上に置き、麻酔から回復するために許可されています。

2。複数のマウス生体外での脳のイメージング：

モーションアーチファクトの影響を受けず、固定されたMR画像は、ライブイメージングよりも高い解像度を実現しています。高解像度、三次元データセットは、定量的な情報を抽出することで最大の柔軟性を提供し、自動画像解析が可能になります。カスタムRFコイルの配列は、一晩スキャンセッションの固定で、頭蓋骨のマウスの脳の16の高分解能MRデータセットの並列収集用に開発されました。

16コイルのex vivoでの脳イメージングアレイ：

特注の16コイルのソレノイドの配列は、同時に画像16サンプルを作成されました。この設計は60mmインサート勾配セットで同時に画像つのサンプルに使用される前の試作品を改良したものです。 8ターンのソレノイドコイルは、26ミリメートルの長さにわたって10％以内に均一な感度を提供するために両端の傷を超えていると個別にモジュール式のコンパートメント（IdziakとHaeberlen、1982）内にシールドされています。 16コイルのコンパートメントは、所定の位置で動きを最小限に抑えるために空気圧の膀胱を使用して、グラデーション内でのコイルとクランプを置いたフレーム（図5）、に組み立てられる。

複数のマウス生体外での脳機能イメージングのステップ：

1. ケタミン（150 mg / kg）をとキシラジン（10 mg / kg）の腹腔内注射を介して麻酔マウス（の心臓の左心室に開いて胸腔と挿入針（または安全翼の輸液セット、25G × 3 / 4） 。右心耳をカット。
2. 30mLの部屋温度1〜約100 mLの/ hrの流量でX PBS + 1μL/ mLのヘパリン（1000 USPの単位/ mL）+ 2mMのProHanceと同じ高経心臓的灌流。
3. 100mLの/時間で30 mLの4％PFA（室温）+ 2mMのProHanceと固定パス。
4. 皮膚、下顎、耳、軟骨、鼻の先端を刎ねると削除。
5. 4℃で一晩4％PFA + 2mMのProHanceの場所の残りの頭蓋骨の構造を℃に
6. 1X PBS + 0.02％アジ化ナトリウム+ 2mMのProHanceに転送する。
7. 7テスラでの高分解能三次元MRIスキャンは、灌流後4日ではなく、より長い2.5ヶ月の間に発生します。脳は、16チャンネルのソレノイドコイルの配列（図5）に配置されます。
8. イメージングのパラメータは次のとおりです：高速スピンTR 325 msのエコーと4の平均値との6の30ミリ秒、エコートレイン長のTEeff。最後の画像は32ミクロン（図6）の等方分解能を持っていると、スキャン時間は約12時間です。
9. スキャンした後、10％ホルマリンで頭蓋骨を置き+保存のための2mMのProHanceを。

3。代表的な結果：

図1マウスのローディングシステム。 "ローディング配列"と"マウスハイブは、"一般的なファイバーグラス製のレールシステムと接続。

図2。誘導室。

図3。）そり、埋め込 ​​まれた監視センサーとヘッドレストを示す。 B）ヘッドレスト付きそりで麻酔マウスが接続された。そりアセンブリは、簡単に遠心管にスライド。

図4。 から in vivoの複数の脳の画像で >代表。

図5 16の固定脳標本のスキャンのための16チャンネルのソレノイドコイルの配列。

図6。代表生体外脳画像。

ディスカッション

生体と撮像時間を増やすことなく大幅にイメージング研究のスループットを向上させるために一度にex vivoでのマウスのイメージングシステムの画像を複数の被験者の両方。 生体および生体外で複数のマウスのイメージング技術の両方から脳の画像の品質は高くなりますし、それぞれマウスの脳でメジャーとマイナーの構造を表現型解析に適しています。

複数の検体の動物の準備時間を最小限に抑えるために、プロセスの並列化は最も重要である。例えば、誘導チャンバーの開発は、同時に複数の試料の誘導のために許され、身体の位置を標準化しながらそりは、ECGと温度プローブのアプリケーションを同期しました。さらに、私たちのex vivoでのイメージングシステムは、高スループットの表現型解析の研究に最適です一度に16の固定全体の脳の高解像度の3次元画像を取得することを可能にします。

in vivoイメージングシステムにおける当社の可能な限界は、個別に各マウスの麻酔薬と温度を制御することができないなどがあります。必要に応じて個々の麻酔薬のコントロールは、各マウスに対して排他的な麻酔気化器の追加により実装することができます。 in vivoイメージングシステムでのもう一つの制限は、スキャンが約32グラム未満であるマウスに限定されているということです。しかし、より大きな動物を収容するためにコイルのサイズを大きくするために、現在計画がある。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, USP (AErrane)	Baxter Internationl Inc.	CA2L9108
NAIR	Church & Dwight Co.
Tears Naturale P.M.	Alcon	DIN 02082519
Omniscan (gadodiamide injection USP)	GE Healthcare	J-110A
Custom Sleds	Dazai Research Instruments
PBS w/o Ca and Mg	Wisent Inc.	311-010-CL
Heparin 10000USP/10ml	Pharmaceutical Partners of Canada	DIN 02264315
ProHance (gadoteridol injection USP)	Bracco Diagnostics	11181
Parafolmadehyde (powder)	Sigma-Aldrich	P-6148-500g
Sodium Azide	Fisher Scientific	S227-100
Formalin 10%	Fisher Scientific	SF100-4