ウイルス性病原体のために臨床サンプルをスクリーニングするためにパンウイルスマイクロアレイアッセイ（Virochip）を使用して、

要約

Virochipは同時に保存された配列の相同性に基づいてすべての既知のウイルスだけでなく、新たなウイルスを検出するように設計されたパンウ​​イルスマイクロアレイです。ここでは、既知および未知のウイルスの存在のために臨床サンプルを解析するVirochipアッセイを実行する方法を示しています。

要約

多くの感染症のウイルスの原因の診断は、ウイルスの本来の配列の多様性だけでなく、従来の方法で検出できないSARSコロナウイルスと2009年のパンデミックH1N1インフルエンザウイルス、などの新しいウイルス性病原体、の継続的な進展に伴い、困難です。これらの課題に対処するために、我々が以前に開発され、汎ウイルスのマイクロアレイプラットフォームを検証して保存された配列の相同性¹のベースですべての既知のウイルスだけでなく、小説のバリエーションを検出する能力とVirochipと呼ばれる。 Virochipを使用して、我々は、同等または従来の臨床試験^2-5に優れた感度を持つ入院患者、原因不明の重症疾患の場合を含む呼吸器感染症、関連付けられているウイルスの完全なスペクトルを同定した。 Virochipは、SARSコロナウイルス^6,7、小説ライノウイルスのクレード^5、XMRV（前立腺癌にリンクされているレトロウイルス^）8、鳥bornavirus（オウムの消耗性疾患の原因^）9、を含む、新規のウイルスを識別するために使用されています呼吸器と下痢¹⁰の子供のと小説cardiovirus。 Virochipの現在のバージョンは、アジレントのマイクロアレイプラットフォームに移植され、2009年12月のようにGenBankの以上〜1,500ウイルス由来〜36000のプローブで構成されている。ここでは、サンプル核酸の抽出、ランダムプライマーを用いたPCR増幅、蛍光色素の取り込み、及びマイクロアレイのハイブリダイゼーション、スキャニング、及び分析を含む、（〜24時間のターンアラウンドタイム）を最初から最後までVirochipアッセイの処理に必要なステップを示しています。

プロトコル

Virochipアッセイの手順は、臨床サンプルから（1）核酸の抽出、抽出したRNAの（2）逆転写および第²鎖cDNA合成、ランダムプライミングcDNAの（3）PCR増幅、（3）Cy3の蛍光色素の取り込みを含む、（4）Virochipマイクロアレイの標識物質のハイブリダイゼーション、及び（5）スキャンおよび分析（図1）。以下に示すプロトコルは、インフルエンザ様疾患を持つ子どもから鼻腔スワブサンプルのVirochipアッセイの使いかたを説明します。

プライマー配列

プライマー5' - GTTTCCCAGTCACGATA -（N _9）-3'

プライマーB 5' - GTTTCCCAGTCACGATA - 3'

1。核酸抽出

1. これらのサンプルは潜在的に感染であるため、臨床検体からの核酸の抽出は、バイオセーフティレベル2（BSL - 2）以上の条件の下で実行する必要があります。
2. 鼻腔スワブサンプルは、ウイルス保持媒体で転送されます。 1.5mlのエッペンドルフマイクロ遠心チューブに試料のアリコート200μLの。
3. オプション：0.22μmフィルター（ウイルス粒子のために精製するために）を通過サンプル
4. オプション：製造業者の指示に従って、ターボDNアーゼキット（Ambion社）を用いてDNaseで前処理サンプル（ホストのゲノムDNAを分解すると、保護された、capsidに包まれたウイルス核酸のために精製するために）
5. Zymo ZRウイルスRNA抽出キットまたは、製造元の指示に従ってキアゲンUltrasensウイルスキットを使用してサンプルを抽出する。

2。逆転写および第²鎖cDNA合成（"ラウンドA"）

1. RNAを抽出した4ユニットに1 uLの40μL/ pmolのプライマーを追加。 65〜熱が° Cクラー（例：ジーンアンプPCRシステム9700）とその後の5分間室温温度× 5分で冷ます。
2. 2μL5X RTバッファー、1μL12.5mmのdNTPを、1μL水、0.5μL0.1M DTT、および0.5μLSSIII RT（Invitrogen社）で構成されたマスターミックスの5μLを追加。 42℃でインキュベート℃× 60分。
3. プログラム可能なサーマルサイクラーで、94〜熱10℃まで冷却C × 2分（中止に逆転写酵素反応）、° C、パルス遠心分離し、1μL5Xシークエナーゼのバッファで構成される5μLシークエナーゼミックスを追加し、3.8μL水、および0.15μLシーケナーゼ（USB社）。第²鎖合成の場合は、° C〜37 ° Cから8分、8分を保持し、94への熱は、° C × 2分（シークエナーゼを不活性化する）と10 ° C（保持）へのクールな上の10から立ち上がる。
4. 省略可能 ：RD cDNAサンプルは-20℃で、この時点で保存することができます。

3。ランダムプライミングcDNAのPCR増幅（"ラウンドB"）

1. 5μL10X PCRバッファー、1μL12.5mmのdNTPを 、1μLは100pmol /μLプライマーB、1μLKlenTaq LA（Sigma社）、および37μLの水から成るマスターミックス45μLにRdの5μlのサンプルを追加。
2. 次のようにPCRプロトコール実行：94 ° C、2分→（94の25サイクル° C、30秒/ 50℃、45秒/ 72℃、1分）→72℃、5分→10℃（ホールド）
3. 1.5％アガロース電気泳動ゲル上のRD Bのサンプルを確認してください。約200から塗抹標本 - 1000 BPは可視でなければなりません（図2A）

4。 Cy3の蛍光色素の取り込み

1. オプション ：別のサンプルは、Cy5の蛍光色素で標識し、同じマイクロアレイにハイブリダイズすることができます。
2. AA - dNTPを組み込むには、5μlの10 × PCRバッファー、1μlの12.5mmのAA - dNTPを （Invitrogen社製）、1μlのは100pmol / ULプライマーB、1から成るマスターミックスの45 ULに路Bのサンプルを5 ULを追加する1μlのKlenTaq LA（Si​​gma社）、および37 uLの水。 PCRプロトコールを以下のように実行する：94 ° C、2分→（94の15サイクル° C、30秒/ 50℃、45秒/ 72℃、1分）→72℃、5分→10℃（ホールド）
3. メーカーの指示ごとにクリーンとコンセントレータ- 5キット（Zymo研究）DNAと路Cのサンプルを清掃してください。 10μLで溶出します。
4. 路Cのサンプルに1M炭酸水素1 UL（Sigma社）および1μlのCy5と（GE Healthcare）を追加します。
5. 暗所でインキュベート× 1時間。
6. メーカーの指示に従ってDNAクリーンとコンセントレータ- 5キット（Zymo研究）とCy3標識サンプルを清掃してください。 12μLで溶出します。

5。 Virochipマイクロアレイへのハイブリダイゼーション

1. オプション：（サンプルの正規化のための）光度計分光光度計に組み込まれたcDNA濃度と色素の量をチェックするために1.5μLを使用してください
2. PCRストリップチューブに25μLの全体積（アジレント）に1μL25Xフラグメンテーションバッファ、5μL5Xブロッキング緩衝液、Cy3標識サンプルの9.5μL（または正規化する量）、及び水を加える
3. 2X GEXのハイブリダイゼーションバッファー（アジレント）の25μLを追加。気泡を除去するために一時的にスピンダウン。
4. ガスケットスライド上にサンプル40μLをロードする。
5. 場所アジレント印刷さVirochipの配列（Californi大学、サンフランシスコ/アジレント）（ダウン"アジレント"マーク側）ガスケットのスライドの上とは、しっかりとネジを締めます。
6. 65で一晩ハイブリダイズ℃のオーブン、10 rpmで速度設定。
7. 37℃に配列、予熱バッファ2（アジレント）を洗浄するバッファ1（アジレント）のガスケットのスライド/配列サンドイッチ水中を離れてください。バッファ1 × 1分を洗ってください。予熱されたバッファ2 × 1分で洗浄する。徐々に（直接配列のアクティブな側面に触れないように注意しながら余分な水分を逃がすためにキムワイプを使用）気泡に注意しながら、バッファ2からスライドを削除する
8. スライドホルダーにス​​ライドを配置し、アレイスキャナーに挿入。

6。 Virochipスキャンと分析

1. スキャンCy3標識測定器の標準のスキャンプロトコル（図2B）によるとは5μmまたは2μm以下で配列。
2. E -予測^11、目視検査、クラスター分析、または自動化されたVirochip解析プログラムによってVirochipマイクロアレイを解析する。これらの3つの方法のそれぞれによって、インフルエンザウイルスは、容易に鼻腔スワブサンプル（インフルエンザ様疾患を持つ子から）（図2C）で検出される

7。代表的な結果：

プロトコルが正しく行われている場合、スミアは、RD Bのステップ（図2A）の後にアガロースゲル電気泳動で見られるべきである。 Agilentのプラットフォーム上でVirochipマイクロアレイは、（図2B）視覚的に分析することは困難になりますが、ウイルスが存在しているなら、それは容易に目視検査、クラスター分析、および/またはE - Predictは（図1C）で識別する必要があります。アッセイの陽性コントロールとして、サンプルは、既知のウイルス（MS2バクテリオファージなどのタバコモザイクウイルス）からの核酸の測定された量で添加することができます。

図1。 Virochipマイクロアレイの処理と分析の概略図。臨床サンプルから核酸を抽出は無作為に、増幅蛍光色素で標識し、Virochipマイクロアレイにハイブリダイズさせる。マイクロアレイは、2μmの解像度でスキャンし、E -予測を含め、計算ツールのさまざまな方法を使って分析されます。

図2。 Virochipアッセイの手順は、ランダムPCR、200の塗抹標本による増幅後- 。1000bpのゲル電気泳動によって可視化することができます（）（B）8アレイ/スライドガラスの三Virochipマイクロアレイアウトは、小さな地域で、示されている。右下の隅に挿入で吹き、最大1マイクロアレイの。臨床検体中のインフルエンザウイルスの存在を明らかにE -予測。使用して（C）自動化されたマイクロアレイウイルス分析高い類似度スコア（S = 0.55）ため、この非常に重要な予測を作る、ゼロに近いp値に対応しています。

ディスカッション

ここで説明するようにVirochipプロトコルは複雑であり、細心と熟練した研究の技術者が必要です。 PCR、ラベリング、ハイブリダイゼーションのための適切な試薬の濃度と条件が非常に​​重要です。 Virochipプロトコルは、簡単にそのような核酸の抽出のためのトリゾール（Invitrogen社）などの組織抽出法を用いて患部組織の分析に対応するように変更することができます。プローブは、適用範囲の所望のスペクトルと幅広さを得るために、必要に応じて追加または削除することができます。例えば、細菌および真菌などの非ウイルス標的の検出のためのプローブは、"オンザフライ"に設計して追加することができます。現在開発中のVirochipアッセイのいくつかのアプリケーションでは、臨床検査、アウトブレイク調査、薬やワクチンの純度のスクリーニング、および新たなウイルスの病原体の発見の広いスペクトルのウイルス診断が含まれています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/材料の名称	試薬/材料の名称
プリメーラ	5' - GTTTCCCAGTCACGATA -（N9）-3'
プライマーB	5' - GTTTCCCAGTCACGATA - 3'
RTマスターミックス（5μL）	2μL5X RTバッファー
	1μL12.5mmのdNTPを（Invitrogen社）
	1μLの水
	0.5μL0.1M DTT
	0.5μLSSIII RT（Invitrogen社）
シークエナーゼミックス（5μL）	1μL5Xシークエナーゼバッファ
	3.8μLの水
	0.15μLシークエナーゼ（USB株式会社）
RD B PCRマスターミックス（45μL）	5μL10X PCRバッファー
	1μL12.5mmのdNTPを（Invitrogen社）
	1μLを100μL/ pmolのプライマーB
	1μLKlenTaq LA（シグマ）
	37μL水
RD C PCRマスターミックス（45μL）	5μlの10 × PCRバッファー
	1μL12.5mmのdNTPを（Invitrogen社）
	1μLを100μL/ pmolのプライマーB
	1μLKlenTaq LA（シグマ）
	37μL水
ハイブリダイゼーション緩衝液（25μL）	1μL25Xフラグメンテーションバッファ（アジレント）
	5μL5Xブロッキング緩衝液（アジレント）
	Cy3標識サンプルの9.5μL（または正常化する量）
	25μLの全体積に水を追加します。
アジレントVirochipマイクロアレイ	ライセンス申請中の、チウ研究所、UCSFから入手可能