ポリイミドベースのマイクロ電極を用いて自由に動くマウスの高密度脳波録音

要約

この記事では、我々は手術の手順を説明し、マウスモデルにおける高密度脳造影法（EEG）の買収のためのマウスの頭蓋骨で、極薄ポリイミドベースの微小電極アレイ（PBM -配列）の移植のためのヒントを処理。

要約

脳波は、脳波計（EEG）大規模なレベルでの神経集団の平均電気的活動を示している。それは広く認知神経科学における非侵襲的脳モニタリングのツールと​​してだけでなく、神経のてんかんと睡眠障害の診断ツールとして利用されている。しかし、脳波リズム生成の基本的なメカニズムは、ベールの下にまだです。 ¹脳波高解像度マウスのための最近導入されたポリイミドベースの微小電極は、（PBM -配列）マウスモデルは、複雑な脳波生成プロセスの分析のために含まれている豊富な遺伝資源に基づいて脳波信号の神経生理学的な質問に答えるために試験の一つです。マウスの頭蓋骨にnanofabricated PBM -配列のこのアプリケーションは、トランスジェニックマウスの大規模な脳活動を収集するための効率的なツールであり、動作と連動して特定の脳波リズムに神経相関を識別するための対応。しかし、その超薄型厚さと二股構造はPBM -配列の処理と移植の問題を引き起こす。紹介ビデオでは、マウスの頭蓋骨でPBM -配列の移植のための準備と手術の手順がステップごとに説明されています。研究者は着床に成功するための処理と手術のヒントも用意されています。

プロトコル

1。まとめ

C57BL/6J - 129S4/SvJaeハイブリッドマウス（12〜15週齢）は、ケタミン（120 mg / kgを腹腔内）とキシラジン（6 mg / kg体重、ip）でカクテルで麻酔する。尾や足指のピンチは、麻酔の深さを検査するために手術の前に。マウスは、定位固定装置（デビッドKopfは楽器、モデル902、カリフ、米国）によって固定されています。頭皮は痛みの軽減のためのリドカインの治療を受けて頭蓋骨を露出さに25mm約正中線で切開しています。頭蓋骨上の任意の破片は、頭蓋骨への電極の密着性を高めるために生理食塩水に浸した綿のヒントではオフに消去されます。ブレグマとラムダ点がマークされ、同一平面上に設定されています。ポリイミドに基づく微小電極アレイは、（PBM -配列）の垂直正中線が頭蓋骨の正中線を満たすように配置されている。ブレグマのポイントは、PBM -配列の前の5 ^番目の層の中間に配置する必要があります。二、三microscrewsは、歯科用セメントで電極の位置を保護するために頭蓋骨の端にヌル空間で使用されています。 PBM -配列のコネクタを支え、私たちは、頭の真ん中に支柱を配置し、歯科用セメントでそれをカバーしています。硬化後は、切開の皮膚を縫合されており、少なくとも5日間は、復旧のために与えられる。リカバリ時には、マウスが食料と水を無料で入手できるように個々のケージに収容されています。回復後は、脳波記録が行われます。動物のケア、手術、そして録音の手順は、韓国実験動物のケアの規制及び関連するガイドラインの法1992以下、動物実験用の委員会のガイドラインに従っていた。崔によって説明されているようにこの原稿のPBM -アレイを作製した。ら。ら^1はビデオで同じPBM -配列を使用するために、著者に連絡してください。

2。手順

1. 滅菌手術器具と定位固定装置を準備します。
2. 麻酔（120と60の用量で、例えば、ケタミン/キシラジンmg / kgのIP、repectively）でマウスを麻酔。尾や足指のピンチは、麻酔の深さを検査するために手術の前に。
3. マウスの外耳道に耳のバーを配置し、所定の位置に締めて、定位固定装置の上にマウスをマウントします。目は手術の光によって乾燥から目を維持する生体適合性ゼリー（例えば、石油ゼリー）で覆うことができます。 70％エタノールでマウスの頭部を保湿後、その頭から毛皮を剃る。
4. 頭皮で25 mm程度の頭を切開する。それは頭皮の下に2％リドカイン塩酸塩の少量を適用することが推奨される。切開が広く開いたままにするマイクロクランプ（ファイン科学ツール（米国）、（株）、18052〜03、カリフ、米国）で皮膚をつまんで。
5. 生理食塩水に浸した綿棒を頭蓋骨にPBM -配列の付着性を高めると頭蓋骨上の任意の残りの壊死組織片を拭きます。膜の残留物を除去するための過酸化物を使用するのも効果的です。
6. 頭蓋骨のブレグマとラムダ点を見つけ、そしてオイルベースの​​マーカーペンで印を付けます。その垂直正中線は、図1に示すように、頭蓋骨の正中線を満たすようにPBM -配列を置きます。水道水の1滴でPBM -配列の前の5 ^番目の層の中間にブレグマを置きます。綿棒内側からよりよい遵守のため慎重に横方向への薄膜電極。頭蓋骨に膜電極棒が厳しく助けるために、膜電極は頭蓋骨に完全に乾燥する必要があります。フィルム電極は、ファンデルワールス力によって頭蓋骨上に固定されていない。電極を再配置するときに、水道水の別のドロップは引き裂かれてから電極を防止するために必要です。
   
   図1（左）マウスの頭蓋骨でPBM -配列。 PBM -配列のanterio前後軸はブレグマ（BP）とラムダポイント（LP）との間の行にマッチします。 （右）マウスの脳の表面上に推定される電極位置。マウスの解剖学は、定位測定によるとマークされているブルックヘブン国立研究所と電極の位置に生成された成人C57BL/6Jマウスの脳の3 - D MRIデジタルアトラスのデータベースからセグメント化されています。グラウンド（G）とREF（参照）電極は、右図にマークされています。
7. 頭蓋骨のオープンエリアで、少なくとも3つの位置をマークし、サポートmicroscrewsの位置決めのための歯科用ドリルを使用してこれらの場所の穴を作る。これらmicroscrewsは、支柱の役割を持っており、機械的に頭蓋骨に歯科用セメントをサポートしています。余分な注意が掘削中に必要とされる。マウスの頭蓋骨が薄い層で構成されて以来、出血は、掘削時に容易に発生する可能性があります。出血が起こるとき、掘削を停止し、穴に止血粉を少量。
8. PBM -配列、アンカーのネジ、および頭蓋骨の残りをカバーするために歯科用アクリルセメント（頂点歯科、頂点自己硬化、オランダ）を適用します。ベトベトすると粘性cに歯科用セメントを準備するondition。
9. 強力な接着剤を使用して、ヘッドの中央に（例えば、ロックタイト、ヘンケルロックタイトコーポレーション、ダブリン、アイルランド）で支柱として堅い棒を配置します。コネクタ面の裏面に両面粘着テープを置く。支柱の先端に接続するPBM -配列のコネクタの位置を操作する。頭蓋骨とコネクタとの間の垂直距離は5mm以上にしてください。コネクタ面とより良い接着のために強力な接着剤を使用してスティックの先端を貼る。
10. 歯科用セメントが完全に硬化されていることを確認します。その後、頭蓋骨上に歯科用アクリルセメントと頭蓋骨にコネクタを固定するコネクタ面の裏側を適用する。
11. マイクロクランプを取り外します。縫合糸は滅菌ステッチの糸で皮膚を切開。装置からマウスを取り外します。あなたが露出頭蓋骨を保護するために余分な歯のアクリルセメントを適用される場合があります。セメントと縫合皮膚の周り（fucidin軟膏、東和甲薬局、韓国）抗生物質を適用します。
12. それは元の体重を（約5〜7日）回復するまで滅菌ケージにマウスを置きます。それは、任意のケージメイトを導入しないことをお勧めします。
13. 回復後は、独自のケージで多チャンネルEEGアンプシステム（Synamps ^2、ノースカロライナ州、米国）のヘッドボックスに軽量プリント回路基板（PCB）コネクタによって、マウスを接続してください。それが絡まないしていないので、接続線は、慎重に扱われるべきである。
14. 慣れの1時間後、脳波記録を行います。スキャン4.4。 （ノースカロライナ州、米国）買収のソフトウェアは、この実験に用いた。脳波マウスの典型的な時間トレースのセットを図2に示されています。それは、マウスの動作を関連付けるためにビデオを記録することをお勧めします。
15. 得られた信号は、地形の脳マップを生成するためにMATLAB（MathWorks社、ネイティック、MA、米国）により分析することができる。マウスの脳の脳波パワーマップのサンプルの地形を図3に示されています。

3。代表的な結果

上記の外科的処置が正しく行われている場合、40チャンネルのマウス脳波が正常に悪いチャンネルなしで実行されます。次の図は、代表的な脳波のトレースや地形図を示す。

図2γ-ブチロラクトン（GBL、50mg/kg、ip）注射によって誘発される脳波発生欠神発作のサンプルトレース。赤いバーは、欠神発作の間にスパイク波と放電（SWDS）を示します。横軸と縦軸はそれぞれ、時間と電圧を示している。番号は図で定義されたチャネルモンタージュに従います。 1（右）。

図3。地形図は2-6 Hzのパワー分布を示している。カラーバーの値は、パワーマップのカラースケールを表します。 γ-ブチロラクトン（GBL、50mg/kg、IP）によって誘発されるスパイク波と放電（SWDS）の間に、大きなfrontoparietal皮質領域での電力は大幅にGBL注射の前に電源（ベースライン）と比較して増加する。

ディスカッション

ここでは、自由にマウスを移動するには、高密度脳波を取得するために外科手術と録音の手順を報告する。このメソッドは、自発的リズム^1,2またはイベントに関連する脳活動の分子メカニズムを研究するためにマウスモデルから脳機能マップを取得することを可能にします。

PBM -アレイ内のすべてのチャンネルの買収は非常に困難であるしかしすべてのチャネルのための安全な接触を行う、全脳のマッピングを取得するために必要な条件である。頭蓋骨へのチャネルの一貫性のある接触を維持するために、次の手順が重要であることがわかっている。まず第一に、頭蓋骨上の任意の組織の破片は、頭蓋骨から電極を離れて設定することができます。したがってそれは、滅菌綿棒ですべての組織片を除去し、頭蓋骨の表面を乾燥させることは非常に重要です。第二に、頭蓋骨の表面に付着することができますPBM -配列の能力は、ファンデルワールス力です。それは1つの頭蓋骨にPBM -配列を適用する前に、水層を構築するために頭蓋骨で水道水の滴を適用することが提案されている。第三に、歯科用セメントの右側の粘度は非常に重要です。それはあまりにも鼻水の場合、それはPBM -配列の下に絶縁層を構築することができる。それはあまりにも密集している場合、歯科用セメントは、簡単に自重により頭蓋骨​​から離れて分類されます。最後に、少なくとも3つの支持microscrewsはしっかりと頭蓋骨にバインドされている歯科用セメントを作るために頭蓋骨に移植することがあります。サポートmicroscrewsは歯科用セメントをホールドアップし、長期的な研究に不可欠なヘッドステージを、固定します。

PBM -配列のアプリケーションは、そのサイズと重量による成体マウスの慢性的研究に限定されます。我々の経験に基づいて、25グラムよりも重いマウスが使用するのに十分です。さらにアプリケーションとして、私たちのPBM -配列内の枝の間にヌル空間を介して、一つは録音または刺激の目的のために二次電極を導入することがあります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
γbutyrolactone	Sigma-Aldrich	H7629-500G