エンハンサートラップフリッパーゼの幼虫における発現と成人のマッピングとその応用ショウジョウバエ CNS

要約

我々は、Gal80発現パターンを決定するために組織特異的なFLPを可能にする、フリッパーゼ誘発性横切るGal80/Gal4弾圧（F​​INGR）メソッドを説明します。どこGal4のとFLPのオーバーラップは、Gal4の発現がオンになっています（Gal80アウト反転）またはオフ（Gal80がに反転）。 FINGRメソッドは、クローンの解析と神経回路のマッピングのための汎用性があります。

要約

Gal4の/ UASバイナリ法では、 ショウジョウバエの遺伝子と神経回路の操作のための強力です。ほとんどの神経生物学研究のために、しかし、Gal4の発現はほとんど行動リードアウトと回路の正確な相関関係を可能にするために十分な組織特異的ではありません。この大きなハードルを克服するために、我々は最近、関心の組織でより制限Gal4の発現を達成するためにFINGR方法を開発した。 FLP / FRTを介するGal80変換するツールの2）のセット;伝統的なGal4/UASシステム1）と3）エンハンサートラップFLP（ET - FLP）：FINGRメソッドは、3つのコンポーネントがあります。 Gal4のは、関心の主要な神経回路を定義するために使用されます。このようなUAS - MJD78QまたはUAS市^TSとして、UAS -エフェクターとGal4のペアリング、順番にハエの行動の変化によって明示される神経活動を調節する。このようなUAS - GFPなどの追加UAS -レポーターで、特定の動作に関わる神経回路を同時に形態素解析のためにマッピングすることができます。浴槽^P> Gal80>（'外フリップ'）と浴槽^P>停止> Gal80（'に反転"）：広範な発現とGal4の行については、Gal4の発現は、二つの相補Gal80 -変換ツールを使うことで制限できます。最後に、捜査官が組織特異的ET - FLPの助けを借りて、それぞれ、Gal80をオンまたはオフにすることができます。 Gal4のとET - FLPが交差する場所にフリップのモードでは、Gal80はGal4の発現を抑制します。フリップアウトモードでは、Gal80はGal4のとFLP重複している細胞でGal4の抑圧を軽減します。どちらのアプローチは、GAL4 -定義された回路内のセル数の制限を有効にし、その逆パターンで。 FINGRメソッドは、Gal4のハエのコミュニティ内の行と伝統的なクローン分析のためにと神経回路のマッピングのための、汎用性の高い膨大なコレクションと互換性があります。このプロトコルでは、我々は選択ET - FLPx2線と視細胞におけるFINGR法の有効性のFLP発現パターンのマ​​ッピングを示しています。 FINGR法の原理はまた、Gal80 Gal4/UAS内の他の遺伝的モデル生物にも適用できるものです、とFLP / FRTが使用されます。

プロトコル

（1） ショウジョウバエ系統

1. GAL4ドライバー：
   視細胞でGal4のを表現するGMR - GAL4、。
2. UAS行
   Gal4の発現細胞の神経変性を引き起こすUAS - MJD78Q（またはUAS - polyQ）、。
   Gal4の発現細胞でGFPを発現するUAS - GFP、。
3. FLP行
   光受容体と脳領域のサブセットでFLPを発現しEY - FLP、。
   FLPの2つのコピー（FLP - IRES - FLP）を含むエンハンサートラップ系統であるET - FLPx2ライン、。我々は、その発現パターンは特徴付けされていない項目〜1,000 ET - FLPの行を（ボームら、2010）、生成されている。ここで、我々は、幼虫と大人のフライ中枢神経系（CNS）における選択ET - FLPx2の発現パターンの特性を説明します。
4. FLPレポーター
   YW、アクチン^P> CD2> Gal4の、UAS - GFP（Pignoni＆Zipursky、1997）、アクチン^Pを介してET - FLPx2の発現パターンを報告する> Gal4の、UAS - GFP> CD2のFLPを介した組換え切除時に。
5. 二つの相補Gal80、変換ツール
   浴槽^P> Gal80>（ゴードン＆スコット、2009）、構成的に強力なチューブリンのプロモーターによって駆動される全ての組織でGal80を表現フリップアウト構造、。 FLPを介した組換え時には、> Gal80はグレーに反転され、Gal80式は、ET - FLPx2発現組織で終端されています。
   浴槽^P>停止> Gal80（ボームら、2010）、通常の条件下でGal80を表現していない構造、内蔵フリップ。 Gal80式は、FLPが>停止を引き抜こうとGal80で反転したET - FLPx2発現組織でチューブリンプロモーターで有効になっています。
6. 複眼でFLPの活性を試験するためのハエ
   GMR - GAL4、UAS - polyQ、浴槽^P>>縮退しているGal80（ボームら、2010）、およびdepigmented目を止める。 FLP発現視細胞では、polyQの発現はGal80フリップで次のオフになっています。
   GMR - GAL4、UAS - polyQ、正常な目をしている浴槽^P> Gal80>（ボームら、2010）、。にFLP発現視細胞を、polyQの発現は、Gal80をフリップアウトは、次のオンになっています。

2。試薬

リン酸緩衝生理食塩水（PBS、1X）、pHは7.4。
16％からPBSで希釈した4％パラホルムアルデヒド（PFA）、PFA、EMグレード（カタログ番号15710、電子顕微鏡学、ハットフィールド、ペンシルバニア州）
PBT、0.1％トリトン- X 100（Sigma）を含む1XPBS
抗Elav（モノクローナル抗体、9F8A9、発達研究ハイブリドーマバンク、アイオワ大学）、汚れショウジョウバエのすべてのニューロン。
抗レポ（モノクローナル抗体8D12、発達研究ハイブリドーマバンク、アイオワ大学）ショウジョウバエの染色グリア細胞。
マウス二次抗体（Invitrogen社）に対して、アレクサ594チキン

3。エンハンサートラップFLPx2線（*重要なステップ）の発現パターンのマ​​ッピング

1. YWから処女の女性は、アクチン^P> CD2> Gal4の収集、UAS - GFPのラインを、個々のET - FLPx2行の男性に渡ります。前者は、ET - FLPの組織発現のためのGFPレポーターとして機能します。
2. *第₃齢幼虫のF1幼虫を彷徨解剖、氷冷PBSで3倍の洗浄、氷上で4％PFAで1時間固定、CNS（すなわち、脳と腹側神経索、VNC）と体壁の保持が続くPBTと3X洗浄。
   解剖
   1. 放浪の第³齢F1幼虫を取り出して、きれいなSylgard皿（Sylgardの2グラムで満たされた35ミリメートルx 10 mmのペトリ皿-混合の指示を製造するのに応じて）に入れます。
      1. 絵筆で食べ物のかすを取り除く
   2. 幼虫を麻酔するために氷の上に氷冷1XPBSと場所で皿を埋める
   3. ピンセットで幼虫の口のフックを押しながら、鉗子の別のペアとし、後端に向かって表皮の皮延長前部気門の近くにキューティクルをつかむ。 CNSは、口の唾液腺、腸、および成虫ディスクと一緒にフックに添付されます。
   4. 過剰な組織と中枢神経系を取り巻く成虫ディスクを取り外します。
   5. PBSで満たされた3もパイレックスの皿にCNSを移す。
      1. シリコーンP200ピペットチップは、組織の乾燥を避けるために使用することができます。
   6. 氷上で4％PFA液200μlで1時間を修正しました。
      1. CNSが完全にPFAで水没されていることを確認します。
         1. CNSが浮く場合、これは通常、中枢神経系が適切に周囲の組織からクリーンアップされないことを示唆している。
   7. PBTと3X洗浄に続いて氷冷PBSで3倍洗浄する。
3. *大人F1ハエの中枢神経系を解剖。
   1. CO ₂でハエを麻酔または10分間氷上で空の瓶の内部に含まれているハエを置きます。
   2. 場所の成人は30秒間、氷の95％EtOHを充填ガラス皿に飛ぶ。
   3. 氷の上にガラス皿を埋め1XPBSに大人のハエを移す。
      1. 残留エタノールを除去するために氷冷した1 × PBSで3倍洗う
   4. 35ミリメートルSylgaにフライを置き氷冷した1 × PBSで満たされたRD皿
   5. 上に向けて腹側を置き、腹部から小さな虫のペン（minutiensピン0.1mm）を途中に挿入する。
      1. ピンセットを使用すると、足の基盤を保持し、鉗子の別のペアで脚を取り外します。
   6. 頭の表皮を削除します。
      1. 鉗子の一組で長い鼻をつかんでいる間、眼の下やフライの頭部の背側正中に向かって表皮の皮の別を置きます。
      2. 他の目をつかみ、反対側の残りのキューティクルを削除します。
      3. 鋭い鉗子及び/または尖ったタングステン針を使用して、脳を取り巻く気管組織を取り除く
         1. 気管の不適切なクリーニングは、GFPの発現を妨害し、自家蛍光の強いにつながる、と脳が修復中にフロートすることができます
   7. VNCの解剖
      1. 胸部キューティクルを削除します。
         1. 第³ preepisternumの両側の2つの鉗子（すなわち、後脚のベースをつかんで）場所、胸部の後端から始まる。
         2. ゆっくりと、離れて腹側正中線からキューティクルを区切るには首の付け根に到達するまでこれを繰り返す。
         3. 静かにVNCを公開胸部キューティクルの両半分を広げ
      2. 次の胸部から腹部を削除します。番目のレグベースで胸部を保持するためにピンセットを使用しながら、第一腹部腹板の近くに腹部をつかむために鉗子の別のペアを使用し、腹部をやってのける。
      3. 周囲の胸部組織からVNCを削除する。ピンセットを持つと胸部枝肉の部分を離れて引き裂く穏やかな鉗子の別のペアと上腕骨の面積を持ちます。
      4. この時点で子宮頸部の結合（首）を周囲の結合組織のリングがあるはずです。 two鉗子を使用すると、離れてリングを引き裂く。
      5. VNCを囲む余分な胸部組織を削除します。
   8. 氷上で1 × PBSを含む9もパイレックスの皿に脳やVNCを転送する
      1. シリコーンP200ピペットチップは、組織の乾燥を避けるために使用することができます。
4. *氷上で4％PFAで1時間大人CNSを修正し、PBTとの氷冷PBSで3倍と3倍洗う。
5. 4で成体中枢神経系の準備や幼虫中枢神経系と体壁をインキュベート° Cのどちらかの神経細胞（抗Elav、1:10）やグリア（anti-Repo. 1:10）に対する抗体と一晩。 PBTで5倍の準備を洗ってください。
6. 2時間室温でマウス二次抗体（1:100）に対してアレクサ594鶏肉と大人や幼虫の準備でインキュベートし、PBSで準備を洗う。
7. スライド上の幼虫、大人のCNSをマウントします。 CNSの自然な形状を維持するために、カバースリップを一時停止するミニブリッジとしてスライドでO字型のプラスチックリング（クリア補強ラベル、エイブリィデニソン、オフィス製品、ブレア、カリフォルニア州）を使用します。
8. 蛍光顕微鏡下でGFPとElav（またはレポ）発現パターンのための準備を調べます。

4。光受容体の抑圧Gal4の内の2つの補完的なGal80コンバートツールの応用

1. 浴槽を経由して^Pを Gal80を反 ​​転> Gal80>（ 図5A）。
   1. 浴槽^P> Gal80>ライン、GMR - GAL4、UAS - polyQから男性を集める。複眼は、これらのハエに正常であることに注意してください。
   2. EY - FLPの処女とメイト。
   3. F1ハエを収集し、目の表現型を調べる。
2. を経由して浴槽にGal80を反 ​​転^P>> Gal80（ 図5B）を停止。
   1. GMR - GAL4、UAS - polyQを収集し、浴槽^Pは >> Gal80男性のハエを停止し、目の表現型を調べる。野生型株（カントン- S）に比べて退化し、これらのハエでdepigmented目の点に注意してください。
   2. EY - FLPの処女とメイト。
   3. F1ハエを収集し、目の表現型を調べる。
3. 視細胞における発現とET - FLPx2行を選択します

ステップ4.1と4.2は、視細胞のサブセットに発現するFLPそのET - FLPx2線を用いて繰り返すことができます。また、いずれのGMR - GAL4、UAS - polyQ、浴槽^P>停止> Gal80ハエまたはGMR - GAL4、UAS - polyQ、浴槽^P> Gal80>ハエは、その急行線の画面に、個々のET - FLPx2線に交差することができます。視細胞におけるFLP。貴重なET - FLPx2行はサブセットまたは、単一の光受容細胞（ 図6）でのみ発現するのFLPのことです。

5。代表的な結果

特定のET - FLPx2ラインの発現パターンは容易に検討し、YW、アクチン^P間のクロスから派生したF1幼虫、大人のハエに記載することができます> CD2> Gal4の、UAS - GFPの処女とET - FLPx2男性（ 図1） 。通常は3〜5は、F1動物の複製FLPの発現パターン（ボームら、2010）の再現性を決定するために解剖して調べられます。 図2は、幼虫と成体中枢神経系におけるET - FLPx2ライン173AにおいてFLPの発現パターンを示しています。 FLPパターンは、さらに神経細胞やグリアマーカー（ 図3＆4）を用いて解析することができます。

図7に示した結果は、Gal80フリップでの有効性を示し、Gal4の以下のFLPを介した組換えの共通部分の抑制にシステムをアウトフリップ。浴槽は^、P>停止> Gal80構造はGal80（光受容体の均一な変性と色素脱失に基づく）のいずれかの漏出表現を持つように表示されず、まだそれはGMRを抑制するeyFLPの助けを借りてでGal80を反 ​​転の効果100％保証されています。 GAL4と通常の外観（ 図7A）に目を戻す。逆に、浴槽^Pは > Gal80>完全に前eyFLPの導入にGMR - Gal4のを抑制する。縮退とdepigmented目（ 図7B）につながるUAS - polyQの発現Gal80フリップアウトに続いて、GMR - Gal4のドライブ、。この例では、我々は、感光体"回路"をマップするために汎photorecetorのFLPを使用したが、行動の結果を調べていませんでした。行動関連Gal4の行で同様のアプローチを用いて、我々は成人ハエの翅の拡大（ボームら、2010）規制CCAP - Gal4の回路の一部をマッピング。我々はFINGRメソッドが行動の神経基盤の理解を助けるには価値があると考えている。

図1。 ET - FLPx2ラインの発現パターンを検討 FLPの発現パターン（青い楕円）は、ET - FLPx2ラインがアクチン^P> CD2> Gal4のとET - FLPx2オス（左上）交差によって決定することができるから、。UASをGFP処女（右上）。ユビキタスアクチン^P親の雌で> Gal4の発現は、FRT（グレーの三角形）に挟まれたCD2の配列の挿入によって妨げられている。 F1子孫で、FLPには消費税CD2のシーケンスを、UAS - GFPの発現を駆動するアクチン^P> Gal4の許可なります。

図2。幼生と成体中枢神経系におけるET - FLPx2ラインの発現パターン 。これらのイメージは、YW、アクチン^P> CD2> Gal4のとの交配から生産子孫から解剖CNS（脳と腹側神経索、VNC）を描く、UAS - GFPの親ET - FLPx2 173Aラインに。 > CD2>カセットを再結合することによって、FLPはアクチン^P> GAL4発現（UAS - GFPの結果として発現）を活性化。したがって、GFPのパターンは、FLP発現細胞を報告します。パネルBはライン173Aにおいて成人発現パターンを示すのに対し、パネルは、幼虫のFLPの発現パターンを示しています。

図3。 ET - FLPx2ライン＃688Aでフリッパーゼを発現する細胞の種類の特性評価。、ET - FLPx2ライン＃688AとGFPフリッパーゼの報告ライン間のクロスから抗REPOで染色固定F1第³齢幼虫の合成画像。第³齢幼虫からVNCの後端から取られたBD、高倍率（ツァイスプラン-アポクロマート63xオイル）ビュー。

図4。 ET - FLPx2ライン＃150のキノコ体の中の細胞型の特性評価。AC、抗REPOで染色固定F1 3齢幼虫からキノコ体の高倍率の画像（63x油浸）。

図5。 Gal80フリップのとフリップアウト戦略のイラスト。フリップアウト戦略でA.、チューブリンプロモーター駆動Gal80（バスタブ^P> Gal80>）GMR - GAL4の弾圧と野生型の眼の表現型（赤眼）で、その結果、構成的に活性である。この弾圧は、Gal80を反転（中央、赤）とUAS - polyQの発現を駆動するGMR - Gal4のを可能にするFLP（紫）の導入、によって除去される。光受容体細胞変性のこの結果（目の白い点で示される）。B。以前の戦略の逆数で、チューブリンプロモーター駆動Gal80式が"ストップ"コドンに挟まれたFRT（グレーの三角形）によって中断される。 Gal80がない場合には、GMR - Gal4のは、光受容体の神経変性を（目の白い点で示される）原因とUAS - polyQに結合する。視細胞でFLPを表現処女雌と浴槽^Pは >停止> GAL80男性、FLP（紫）は、"ストップ"コドン（真ん中を切り出す、FRT部位で組換えを触媒する、GMR - GAL4、UAS - polyQを交配することによってしたがって、Gal80表現とGMR - GAL4の弾圧を可能に赤）、。これが（wの欠如によって示される視細胞に神経変性を留保目のハイトドット）。

図6。 。tubP> GAL80男性、ET - FLPx2ライン＃688A ET - FLPx2ライン＃688A処女との間のクロスからGMR - GAL4、UAS - polyQのF1子孫を使用してアウトGal80をフリッピングでFINGR法の適用 。目のommatidiumの複数形の中央にある色素の欠如は、ライン＃688AでFLP式を表します。このエリアではGMR - GAL4のGal80抑制がGal4のは、UAS - polyQを駆動できるようにホッとした。

図7。光受容体におけるGal4の交差するまたは縮小Gal80をフリッピングでFINGR法の適用。 A.浴槽^P>停止> Gal80システムフリップには、FLP -依存的にGAL4の発現を制限する。でGMR - GAL4、UAS - polyQ、浴槽^P>停止> GAL80ハエ、視細胞（左フライ）縮退とdepigmentedされています。 eyFLPの導入後、Gal80は順番に式のpolyQをオフにし、通常の眼（右フライ）でハエを生成するGMR - Gal4の、の完全な抑圧の結果、光受容細胞に発現している。B.浴槽^P> Gal80>フリップは、アウトシステムは、浴槽と反対のやり方で動作する^P>停止> Gal80フリップのシステム。浴槽^Pは > Gal80は>恒常的にGAL4を抑制し、polyQの発現を（左フライ、正常な眼を持つ）を抑制。 eyFLPの導入後、Gal80はGMR - GAL4の抑制を緩和し、表現のpolyQをオンにし、視細胞から反転されます。これは縮退とdepigmented目（右のフライ）とハエにつながります。

ディスカッション

Gal4/UASシステムが広くされ、正常様々な生物学的研究のためのDrosophilists（;ダフィー、2002ブランド＆Perrimon、1993）で使用されています。日付に、ハエのコミュニティは、プロモーター主導とエンハンサートラップGal4の何千行が生成されています。 FINGR法の大きな強みは、それが可能と大幅にショウジョウバエの研究でGAL4の力を拡大すること、Gal4/UASのシステムと互換性があることです。

FINGRの方法の一つの重要なアプリケーションは、Gal4/Gal80交差点通過行動の根底にある微調整する神経回路にすることです。これらの動作が含まれる可能性がありますが、学習と記憶、求愛、睡眠、および概日リズムが、これらに限定されない。 FINGRメソッドはまた、アルツハイマー病などのヒトの神経変性疾患、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、およびパーキンソン病のモデリングにおける神経変性を受けやすい重要なニューロンをマップするために使用することができます。同様に、コカイン、アルコール、および他の物質の中毒を仲介するための重要な神経細胞や神経回路の病巣は、FINGRメソッドを使用してマッピングされる可能性があります。神経回路と行動の時間的な制御を得るためにFINGRメソッドで使用することができる、それは条件付きGal4sが（。。ローマンら、2001オスターヴァルダーら、2001）ことに留意すべきである。温度に敏感なGal80（Gal80 ^TS、マクガイアら、2003）を使用して、Gal80、変換ツールの変更は、生成することができます浴槽^P>停止> Gal80 ^TSまたは浴槽^P> Gal80 ^TS>、回路の操作で、さらに時間的な柔軟性を追加する。神経系を越えて、FINGRメソッドは、翼や足であるかどうか細胞のサブセットでGal4の発現を制限することも同様に適用できる。

ET - FLPx2線はMARCM（リー＆羅、1999）を含むFRT / FLPベースのクローン解析（徐＆ルービン、1993）、に興味があるすべてのショウジョウバエの生物学者にとって貴重なリソースとなります。また、一部のET - FLPx2ラインが再現可能なクローンを生成するため、繰り返し形態学的および行動解析のためのヒートショック- FLPを交換することが期待される。エンハンサートラップGal4の行と同じように、ほとんどのET - FLPx2ラインは自分の興味のある細胞で特異的に発現されることはほとんどありません。ほとんどの行は、目的の細胞と同様に他の細胞や組織のFLPを発現するであろう。しかし、Gal4のとET - FLPx2両方の"組織特異性"の欠如は、長い間彼らの重複領域が特定の実験のための望ましいとしてFINGR方式のための主要な関心事にはなりません。 FINGRは、洗練された一つに二つの"広範な"システムを変えるように設計されています。

これらのプロトコルで示された方法は、かなり標準的であると再現可能でなければなりません。自分の注意を要する主な注意事項の手順では、固定液の選択と使用法です。彼らはGFPのシグナルを消光するため、PFA以外の固定液は避けてください。我々はまた、解剖皿がFLPの発現が確実にGFPによって報告されなくなる可能性を避けるために、PFAで固定のために使用すべきではないことに注意した。