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Method Article
このプロトコルは、逆行性に網膜神経節細胞、およびどのように続いて網膜神経節細胞の生存とアポトーシスを分析するために視神経挫滅するためにラベルを付ける方法を示しています。それは、緑内障を含む視神経障害の様々なタイプ、のための実験的疾患モデルです。
視神経への損傷は不可逆的な視力喪失につながる網膜神経節細胞(RGCs)、の緩やかな死が続く、軸索変性につながることができます。人間のような疾患の例としては、外傷性視神経障害、緑内障の視神経の変性などがあります。それは、視力低下や失明につながる視神経の頭の中で典型的な変化、進歩的な視神経の変性、および網膜神経節細胞の消失、制御されていない場合、によって特徴付けられる。
視神経クラッシュ(ONC)傷害のマウスモデルでは、外傷性視神経障害のための重要な実験的な疾患モデル、このモデルでは緑内障など、視神経が徐々に網膜神経節細胞のアポトーシスに導くに圧挫です。この疾患モデル、治療手段の開発に不可欠な神経細胞死と生存、の一般的なプロセスとメカニズムを研究するために使用することができます。さらに、薬理学的および分子的アプローチは、異なるタイプの視神経障害の治療に潜在的な治療薬を特定し、テストするには、このモデルで使用することができます。
ここでは、1日目における網膜神経節細胞のベースライン逆行性標識法(RGCs)、4日目(II)視神経挫滅、(III)網膜を収穫し、一日でRGC生存率を分析(I)のステップのデモンストレーションでステップを提供する11、および(IV)代表の結果。
使用されるすべての機器や試薬は無菌である。全ての動物実験は、動物のケアによって承認され、NEI / NIH(動物実験のプロトコルのNEI - 570)で委員会(ACUC)を使用して、NIHのガイドラインと規則に従って行ったれました。
1。 1日目に網膜神経節細胞のベースライン逆行性標識法(RGCs)
この手順の目的は、三日間視神経挫滅の前にマウスの上丘に神経トレーサー色素を注入することにより逆行性に網膜神経節細胞を標識することです。染料は逆行網膜神経節細胞に取り込まれ、生きているRGCs(図1)のマーカーを提供する。このアプローチは、ほとんど変化1-5実行可能なRGCsの再現可能なラベルが得られます。
2。 4日目の視神経挫滅
この手順では、我々は、網膜神経節細胞の緩やかな死につながる軸索(図2)、の主要な損傷を引き起こすことが視神経に挫滅が適用されます。
3。網膜を収穫し、11日目でRGC生存率を分析する
この手順の目的は、retinaetoは、網膜神経節細胞の生存率を分析し収穫することです。
4。代表的な結果:
七日視神経挫滅後の網膜神経節細胞の生存を、分析するために、網膜は、収穫固定し、平らにし、マウントされた。網膜像は、蛍光顕微鏡を用いて撮影した。無傷通常のRとの比較etina(ノーマル、左)、実行可能なRGCsの数は(緑、逆行上丘に注入FluoroGold神経トレーサー色素で標識された)視神経挫滅(右、ONC)(図3)と網膜で有意に低いです。 。
図1。網膜神経節細胞のベースライン逆行性標識法
視神経挫滅後の異なる時点で実行可能な網膜神経節細胞をカウントするためには、網膜神経節細胞(視神経前に脳三日間の上丘に神経トレーサー色素(緑色)を注入して逆行性に標識される赤)圧挫。網膜神経節細胞の軸索は上丘に存在するので、トレーサーの染料は逆行RGCsで取り上げられ、生活RGCs用マーカーを提供する。
図2。視神経挫滅損傷
網膜神経節細胞の生存率の状況を分析するために、圧挫は、軸索への一次損傷を引き起こすために視神経(赤)に適用されます。これは、網膜神経節細胞の緩やかな死につながる。トレーサー色素(緑)注射の3日後には、マウスは麻酔です。片眼の結膜を切開される。軌道筋肉をそらし、それを脇に置く。目の世界からの出口で視神経を公開。クロスアクションのピンセットを使用して約3秒間眼球から約2 mmに視神経に挫滅を適用します。
図3。視神経挫滅の有無に蛍光標識された網膜神経節細胞
七日視神経挫滅後の網膜神経節細胞の生存を、分析するために、網膜は、収穫固定し、平らにし、マウントされた。網膜像は、蛍光顕微鏡を用いて撮影した。無傷正常網膜(左、ノーマル)、実行可能なRGCsの数(緑、逆行上丘に注入FluoroGold神経トレーサー色素で標識された)と比較して視神経挫滅(右、ONCと網膜で有意に低かった)(図3)。スケールバー:50μm以下
視神経挫滅モデルマウスは、RGC死と生存の過程を研究するのに便利です。このモデルはまた、しばしばRGCアポトーシスと生存の異なる試薬と遺伝子の影響を調査するために使用されます。このモデルの利点の1つは、最小限のバリエーションを持つ再現性の高い学位を持っているということです。
しかし、特別な注意はこのモデルではいくつかのステップが必要です。彼?...
我々の研究は、NIH、国立眼研究所の学内研究プログラムによってサポートされています。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Stereotaxic apparatus | ASI Instruments | SAS-4100 | |
Dissecting microscope | World Precision Instruments, Inc. | PZMIV-BS | |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Scalpel Blades #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
Microdrill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
Suture needle | Fine Science Tools | 12050-03 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 16144-13 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11252-50 | |
Hamilton syringe | Hamilton Co | 88400 | |
Gauze sponges | Office Depot | 674889 | |
Fluorochrome | Sigma-Aldrich | 39286 | |
Alcohol | Sigma-Aldrich | 459844 | 70% |
H2O2 | Sigma-Aldrich | H3410 | 3% |
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