成人肝細胞の混合初代培養からマクロファージを分離するためにシンプルかつ効率的な方法

要約

ラット肝細胞の初代培養からマクロファージを取得するための新しい方法が記載されている。このメソッドは、プラスチック製の皿に選択的付着によって培養フラスコ及び精製の揺れが続く文化におけるマクロファージの増殖を、利用しています。この手法は、効率的に複雑な装置やスキルがなくても肝臓のマクロファージを提供します。

要約

クッパー細胞は肝臓特異常駐マクロファージであると^1-3肝臓の生理学的および病理学的機能において重要な役割を果たしている。肝臓のマクロファージの単離方法は^4-6をよく説明されてきたが、これらのメソッドのほとんどは、遠心水簸機や技能などの高度な機器を、必要とする。模式的に図1に示すように、ここで、我々は、成体ラットの肝細胞の混合一次培養物から十分な数と純度で肝臓のマクロファージを取得するための新しい方法を提供する。

二段階灌流法^7,8により肝細胞の解離した後、主に肝実質細胞で構成される画分を調製し、DMEM、10％FCS.Parenchymal肝細胞で構成される培地とT75組織培養フラスコに播種されると、上皮細胞の形態を失う文化の中で数日以内に、変性または線維芽細胞様細胞（図2）に変換する。位相コントラスト - 明るい6日目の周りの文化が進む、、として、ラウンドマクロファージ様細胞は、線維芽細胞シート（図2）で増殖し始める。マクロファージ様細胞の増殖は、フラスコの表面上に細胞シートをカバーする、継続すると一日約12最大レベルに達する。培養フラスコを振とうすることにより、マクロファージは、容易に培養培地中に懸濁させる。のような他の汚染細胞が中断されたままマクロファージ（図3）、の選択的接着のプラスチック製の皿の結果でその後の転送と短いインキュベーション。 PBSでいくつかのリンスした後、添付されたマクロファージが収穫されます。 10以上の^6個の細胞が二週間以上（図3）をそれぞれ2〜3日間隔で同じT75組織培養フラスコから繰り返し収穫することができる。フローサイトメトリーにより評価として孤立マクロファージの純度は、95〜99パーセントだったかラットマクロファージ特異的抗体（図4）と免疫細胞化学は。分離した細胞は、LPSで刺激、との形成時にポリスチレンビーズのアクティブな食作用（図5）、組換えGM - CSFに対する増殖応答、​​炎症/抗炎症性サイトカインの分泌を示す多核巨細胞^9。

結論として、我々は複雑な装置なしで十分な数と純度で肝臓のマクロファージを得るために簡単かつ効率的な方法を提供し、skills.This方法は、他の哺乳動物種に適用できるかもしれない。

プロトコル

1。肝臓の灌流

1. ペントバルビタールナトリウム溶液（50 mgのナトリウムペントバルビタール/ kg体重）の腹腔内注射によって、成体雄Sprague - Dawleyラットを（体重150〜200グラム週齢の10〜15時）麻酔。
2. ステンレス鍋に動物を配置し、腹部と胸部の上に70％エタノールをスプレー。
3. 皮膚の小さなカットして皮を作る。ハサミでカットで腹部を開きます。
4. 門脈の位置を確認し、門脈と疎塊の下に外科的スレッドを渡します。
5. クランプ下大静脈と肝に血液の逆流を防ぐために、腸間膜静脈の遠位部分。はさみで横隔膜をカットして胸腔を開き、そして心を公開。
6. 門脈にプラスチック製のカテーテル（直径2mm）を挿入し、カテーテルの周囲にしっかりとスレッドを締めます。
7. 37温めた℃、洗濯液（pH7.2のCa ^{2 +}とMg ^{2 +} 0.5mMのEGTA、10mMのHEPES、4.2 mMのNaHCO _3を含む無料のHBSSが）でロードされる灌流システムにカテーテルを接続する
8. 10ml /分の速度でその場で灌流を開始する。それと同時に、右心房の壁にカットを行います。 10分間の灌流を続ける。
9. 速度で20分- 、および10の浸み込ませる。[pH7.5の10mMのHEPESおよび4.2mM NaHCO _3を含むHBSSはI型コラゲナーゼ（0.05％）とトリプシン阻害剤（50μg/ ml）を補充した]コラゲナーゼ溶液への灌流液を切り替える10 ml /分、肝臓が少し腫れて漿膜下の肝臓の構造の崩壊のための符号を示すまで。

2。実質の肝細胞が豊富な細胞分画の調製

1. 取り外し、慎重にコラゲナーゼ溶液の25mlを含む滅菌ビーカーに肝臓を移す。はさみで細かくミンチ。
2. その結果、細胞懸濁液中に冷たいMEMの75 mlを加え。穏やかなピペッティングした後、ろ液は、セルストレーナー（100μm以下）を介して結合組織および未消化の組織片を除去する。
3. 4℃（ブレーキオフ）で1分に50 × gで50 mlコニカルチューブと遠心分離機にろ液を移す。
4. 注意深く上清を捨てる。冷たいMEMでペレットを再懸濁します。
5. ）三回2.4を繰り返します。

3。肝細胞の混合初代培養

1. に10％熱不活性化100μMのβ-メルカプトエタノールを添加したFCS、、10μg/ mlのインスリン、100μg/ mlのストレプトマイシンおよび100 U / mlペニシリンを含むDMEMで構成される成長培地に2.5で得られた細胞）を一時停止、および種子6.7 × 10 ⁴細胞/ cm ^2（培地の5 × 10 ⁶細胞/フラスコ/ 12-15 ml）の密度で：五から十組織培養フラスコ（75 cm ^2と表面積）。
2. 文化のflasksat 37インキュベート℃、5％CO ₂の大気中のC - 95％の空気。
3. 増殖培地2〜3日おきの間隔を交換してください。

4。マクロファージの選択的分離

1. 文化の12日後に、マクロファージは、細胞シートで増殖する。これらの細胞は80℃培養フラスコの揺れ逆数で中断している - 30分間毎分120ストロークを37℃
2. 100ミリメートルの非組織培養グレードのプラスチック製の皿に培養液を移す。 1つのプラスチックの皿に2つのT75フラスコから培地をプール。成長培地を補充培養フラスコをインキュベーターに戻す。
3. 37℃で30分間プラスチック皿をインキュベート℃、5％CO ₂の大気中のC - 95％の空気。他の混入細胞はそうではないマクロファージが容易に、このインキュベーションのプロセスの下で、非組織培養グレードのプラスチックの皿に取り付けます。
4. 培地を吸引し、穏やかにPBSでプラスチック製の皿を洗う。このステップを3回繰り返します。
5. 皿にTrypLE Expressソリューションの1 mlを加え、そして37℃で10分間インキュベート℃、5％CO ₂の大気中のC - 95％の空気。
6. 増殖培地9mlのを追加。優しくセルスクレイパーで接続されているマクロファージを削り取る。
7. 25 ° C（上ブレーキ）で5分で180 × gで15 mlコニカルチューブと遠心分離機に細胞懸濁液を移す。
8. 上清を捨て、増殖培地1 mlを加える。活発なピペッティングによって単一細胞に解離する。血球計計数することにより、細胞数を列挙する。
9. 分離ステップは、二週間以上の2〜3日間隔で同一の培養フラスコで繰り返すことができます。
10. 分離されたマクロファージは、3.1で説明されている増殖培地で培養することができる。

5。代表的な結果

成体ラット肝細胞の混合初代培養の例を図2に示されています。肝実質細胞は培養中の数日以内に上皮細胞の形態を失い、変性または線維芽細胞様細胞に変身。その後、一日中6〜12段階、コントラスト、明るい、ラウンドマクロファージ様細胞はvigourouly線維芽細胞シートで増殖する。培養フラスコを振とうすることにより、マクロファージは、容易に培養培地に懸濁させ、そしてマクロファージの選択的接着（図3）のプラスチック製の皿の結果でその後の転送とインキュベーション。マクロファージ様細胞は、8日目には早くも収穫され、数字は12〜14日に最大レベルに到達することができます。以上の10 ⁶の細胞をT75培養フラスコあたり10 ^7（図3）のフラスコあたりの総細胞収率を可能にする、以上の二週間に2〜3日間隔で繰り返しT75培養フラスコから収穫することができる。分離されたマクロファージの純度は次のようなED - 1（図4）、ED - 3、OX - 41（図4）とIba1 ⁹などのラットマクロファージ特異的抗体、とフローサイトメトリーまたは免疫細胞化学により評価、95から99パーセントでした。分離した細胞は、ポリスチレンビーズのアクティブな食作用（図5）、組換えGM - CSF、LPSで刺激し、多核巨細胞⁹の形成時に炎症/抗炎症性サイトカインの分泌に対する増殖応答としてマクロファージの典型的な特徴を、示す。

図1ラット肝細胞の混合初代培養からのマクロファージ様細胞の選択的単離および精製の ​​ためのスキーム。

図2。ラット初代肝細胞の培養とマクロファージ様細胞の増殖。矢印は多核巨細胞を示している。スケールバー= 100μmの。エルゼビアから許可を得て免疫学的方法の研究^{、Vol.360、47〜55（2010）9}から転載。

図3。揺れや添付法によるマクロファージ様細胞の選択的分離。細胞は、フラスコを振とうすることにより培養液に懸濁し、その後、非組織培養グレードのプラスチック製の皿に移し、37℃でインキュベートした。他の混入繊維芽細胞が中断されたままながら、めっき後の10分には早くも、マクロファージ様細胞は、皿の表面に付着。 PBSで洗浄した後、高度に精製されたマクロファージの人口が得られた。これらの細胞は、培養の40分後に典型的なマクロファージの形態を獲得し、有糸分裂細胞は、頻繁に（矢印）が観察された。異なる培養期間におけるフラスコから回収した細胞数に変更があった場合、それが表示されます。値は3〜5フラスコに、平均± SDである。実験を3回繰り返していたし、データは別の記号で示されます。スケールバー= 100μmの。エルゼビアから許可を得て免疫学的方法の研究^{、Vol.360、47〜55（2010）9}から転載。

図4ラットマクロファージに対するモノクローナル抗体を用いたマクロファージ様細胞の免疫染色。

図5。マクロファージ様細胞によるFITC標識マイクロビーズの貪食。

ディスカッション

ここで、我々は、成体ラットの肝細胞の混合一次培養物からマクロファージを得るために簡単かつ効率的な方法を報告する。私たちの方法は、マクロファージ⁹として、その生物学的特性に基づいてこれらの細胞のその後の単離および精製してラットの肝細胞の混合培養におけるマクロファージの小説増殖活性に最初に依存しており、。それは、大人の肝臓の細胞の混合初代培養で増殖したマクロファージはクッパーまたは肝実質細胞の画分に汚染された関連する細胞由来のかもしれない可能性があります。マクロファージが混在初代培養における実質肝細胞¹⁰と他の繊維芽細胞の形質転換に起因する特定の環境の変化に対応している場合があります。

結論として、私たちの方法は、高度な機器や技術的なスキルを用いてラット肝臓cellswithoutの初代培養から十分な数と純度のマクロファージ様細胞の分離を提供します。さらに、分離手順は、2週間以上同じ培養フラスコで繰り返すことができます。このメソッドは、他の哺乳動物種に適用できるかもしれない。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント（省略可能）
ペントバルビタールナトリウムソリューション	共立製薬	Somnopentylインジェクション
ハンクス平衡塩溶液（HBSS）	インビトロジェン	14185-052
エチレングリコール四酢酸（EGTA）	シグマアルドリッチ	E - 4378
コラゲナーゼ	和光純薬	032から10534	細胞解離グレード （ロットチェックに必要）
トリプシン阻害剤	シグマアルドリッチ	T - 9128
イーグルの最小必須培地（MEM）	シグマアルドリッチ	M - 4655
ダルベッコは変更されている イーグル培地（DMEM）	シグマアルドリッチ	D - 6459	高グルコース型
ウシ胎児血清（FCS）	HyClone	SH30070.03	56で不活性化熱℃で30分間。 （ロットチェックに必要）
TrypLEエクスプレス	インビトロジェン	12605
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）	インビトロジェン	14190	のCa 2 +とMg 2 +フリー
β-メルカプトエタノール	シグマアルドリッチ	M - 7522	在庫：蒸留水に100mMの
インスリン	シグマアルドリッチ	I - 5500	在庫：0.1N塩酸で10 mg / mlの
ペニシリン/ストレプトマイシン	インビトロジェン	15070
セルストレーナー	BDバイオサイエンス	352360	メッシュサイズ：100μm以下
組織培養フラスコ	住友ベークライト株式会社	MS - 21250	表面積：75 cm 2と
非組織培養プラスチック皿	BDバイオサイエンス	351005
セルスクレイパー	コー​​ニング（株）	3010
逆数シェーカー	タイテック	NR - 1