二光子顕微鏡を用いたマウス脊髄の in vivoイメージングで

要約

マウス脊柱を安定させ、繰り返し実行するために低侵襲プロトコル in vivoで脊髄の画像が記載されている。このメソッドは、呼吸器誘発性の動きを最小限にしてもアライメントや後処理他を必要としない生の画像データを生成するために脊椎安定化装置と麻酔薬の処方を組み合わせたもの。

要約

in vivoで遺伝的に特定の細胞型^2-3に蛍光タンパク質を発現するように設計されているマウスでは、二光子顕微鏡^1を用いたイメージングでは、大幅にin vivoで ^4-7 の多くの組織で生理的および病理学的プロセスの知識を広げている。中枢神経系（CNS）の研究では、小説などの下でニューロン、アストロサイト、ミクログリア、などの細胞の挙動について、しばしば予想外の所見の茄多を生産している脳内のin vivoイメージングの幅広い応用がなされている生理学的または病理学的条件^8月17日 。しかし、主に技術的な合併症は、生きているマウスの脊髄の研究ではin vivoイメージングの実装を制限してきた。特に、肺と心臓への脊髄の解剖学的接近は、イメージング生体脊髄やりがいのある仕事になる重要な動きのアーティファクトを生成します。 我々は、脊柱を安定させる呼吸器誘発性の動きを減らし、それによってin vivoで画像にマウス脊髄をする二光子顕微鏡の使用を容易にすることによって脊髄のイメージングの固有の限界を克服する新しい方法を開発した。これは、呼吸器誘発性運動の有意な減少をもたらす、深い麻酔の方法でカスタマイズされた脊椎安定化装置を組み合わせることによって実現されます。このビデオプロトコルは、組織の損傷を維持して最小限に出血が長期間にわたって安定した生理的条件下で維持することができる生きている脊髄の小さな領域を公開する方法を示しています。高分解能in vivo で詳細にミクログリアと血管の間の密接な関係を取得した代表的な生のイメージ。タイムラプスシーケンスは、生きたマウスの脊髄でのミクログリアのプロセスの動的な挙動を示しています。また、同じz -フレームの連続スキャンが示すのこのメソッドは画像の位置合わせ後の取得を必要としない画像および/またはタイムラプスムービーのスタックを生成するために達成することができる卓越した安定性。最後に、我々は生体内で進行中の生理学的または病理学的プロセスの縦断的研究を可能にする、このメソッドは、後でタイムポイントでの脊髄の同じ領域を再検討し、再イメージングするために使用できる方法を示します。

プロトコル

1。脊椎安定化装置の構築

1. ナリシゲSTS -コンパクト脊髄クランプとナリシゲMA - 6Nヘッド保持アダプタを注文。
2. カスタム設計とその脊柱と尾部がクランプされている間、動物の頭部がサポートされているように整列二つナリシゲの部分を保持するためにステンレス製の底板を作る。デバイス全体は通常低下顕微鏡のステージ上に顕微鏡レンズの下に入る必要があることに留意してください。

2。動物の手術

1. 空気加熱装置とプレヒート顕微鏡室、37でそれを維持℃に
2. 動物を秤量し、100mgのケタミン、15mgのキシラジンと無菌条件下で0.9％NaCl溶液で希釈した体重1kg当たり2.5mgのアセプロマジンを使用して、麻酔薬のミックスを作る。
3. 麻酔ミックス（KXA）を腹腔内注入することにより、動物を麻酔。定期的なつま先の挟み込みは、全体に深い麻酔を確保するために実行する必要があります実験。毎時または必要に応じて半分の投与量で補う。
4. 外科手術の実行中に熱のサポートを提供するために、小動物の加熱パッドを使用してください。
5. 角膜脱水および損傷を防ぐために目の上に人工涙液軟膏を適用する。
6. トリミング装置とし、完全に切開周辺から髪を削除するには、鋭い刃を持つ最初の動物の背中を剃る。
7. 剃毛を取り除くとアルコールパッドで剃毛、皮膚の表面を消毒する。
8. 希望する脊髄レベル（胸椎がここに示されている）の皮膚の小さな（〜1.5 cm）の長手方向の切開を行います。
9. 慎重に後退による皮下の結合組織を戻す筋肉を公開。
10. 慎重に必要なレベルで脊柱から傍脊柱筋を分離。各棘突起の両側から筋肉をデタッチし、デタッチされた筋肉をこすり取る際には、できるだけ少ない切開を行います層の表面からの方法。
11. すぐに吻側と椎弓切除の尾、削除されるラミナを選択し、脊柱の両側の脊髄クランプ用エントリのサイトを準備。慎重にクランプが挿入される4つのポケットを作るために筋肉組織を置換する。
12. 脊髄に触れることなく粘膜の下に湾曲した鈍先端はさみの安全な挿入を可能にするストレート歯先端の鉗子と脊柱を持ち上げる。ゆっくり片側、次に反対側にある骨を切断することにより椎弓切除を行います。
13. 綿棒を使用するか、少量の出血を制限するために切開隣プレカット小さなgelfoam吸収ゼラチンスポンジの部分を挿入します。必要に応じてさら​​に出血を抑えるために小血管のcauterizerを使用してください。組織を洗浄するために予熱無菌人工脳脊髄液（ACSF）を使用してください。

3。 in vivoイメージングのための脊柱と準備の安定化

1. PLAC電子脊椎安定化装置のベースプレート上に標高のパッド上に動物とヘッド保持アダプターでヘッドを固定します。
2. STS -椎弓切除に隣接する、事前に用意されたポケットの中の動物（図1）の前後軸に沿ったデバイスの脊髄クランプを置きます。 2個のクランプは〜45 °露出した脊髄（図1）上の水浸レンズを低減するための十分なスペースを可能にするために動物のrostro -尾軸に対しての角度で配置する必要があります。
3. 動物の体をイメージング実験（図1）の期間中、標高のパッドを除去した後、空気中に浮遊することができるように尾の基部にSTS -装置の第3のクランプを置きます。
4. ACSFで脊髄のメンテナンスおよびin vivoイメージングのためのこのソリューションでは顕微鏡のレンズの浸漬を容易にするために、露出した脊髄の周りのGelseal（アマシャムバイオサイエンス社）の小さな井戸を構築する。

jove_title"> 4。二光子顕微鏡によるマウス脊髄のin vivo イメージング

1. 顕微鏡をカバーする予備加熱チャンバ内に脊椎安定化装置に動物を移し、まっすぐレンズ（図1）の下に椎弓切除を置く低下顕微鏡のステージ上に固定。
2. ACSFのソリューション、それが脊髄クランプまたはGelsealに接触しないことを確認することに慎重に水浸レンズを下ろします。
3. 関心のある分野を特定し、それに集中する落射蛍光使用。レーザースキャンモードに切り替え、イメージ化された組織中に存在する蛍光物質のために適切な二光子レーザーの励起波長、dichroicsとバンドパスフィルタを用いた in vivo イメージングで行います。

5。反復的なイメージングと術後ケア

1. イメージング実験の終了時に、脊椎安定化デバイスからマウスを削除し、慎重に椎弓切除周辺からGelsealを拭いてください。エリアをよく清掃してください。
2. 椎弓切除以上の背中の筋肉を復元し、縫合。
3. 椎弓切除の皮膚を復元し、縫合、betadineでそれを綿棒。
4. 1ミリリットル栄養と水分補給補助食品として乳酸リンゲル液（バクスターヘルスケア）、ならびに皮下鎮痛治療を（0.1 mg / kgのブプレノルフィン）を提供。
5. 防腐処理の腹腔内（マウス1匹あたり0.03ミリリットル、2.27％のエンロフロキサシン注射剤抗菌ソリューションを）管理する。
6. 完全な麻酔から回復し、その後個別にそれを収容するまで加熱パッドの上に置いて動物。
7. 術後2〜3日の手術と鎮痛治療ごとに8〜12時間後の最初の3〜5日間毎日消毒剤投与を繰り返す。通常の動作と完全な回復を確実にするには、毎日動物を監視します。
8. 同じ椎弓切除を介しての再イメージングのために、縫合皮膚と筋肉を再度開き、セクション2で説明した手順を繰り返して - 4。
9. 再度見つけるpreviously以前に^10を説明するようにマップのように血液の血管を使用して領域を撮像。

6。代表的な結果

すべての動物の手続きは、カリフォルニア、サンフランシスコの大学の制度的動物実験委員会によって設定されたガイドラインの下で行われ、連邦規則に準拠していますれた。脊椎安定化装置の画像と顕微鏡のレンズの下にデバイス上でマウスの位置を示す模式図を図1に示されています。動物の体の下に呼吸運動に十分なスペースを許可することは、脊髄におけるin vivoイメージングで安定が保証されます。それはCX3CR1 ^{GFP / +}トランスジェニックマウス¹⁸の脊髄に生体内でイメージを作成したとして、 図2は、ミクログリアと血管の間の密接な関係を示し、これでミクログリアが内生的にGFPで標識されています。 図3は、反復の例を示しています。in vivoイメージングでは蛍光脊髄軸索におけるタンパク質（YFP - Hライン^3）とミクログリアを（CX3CR1 ^{GFP / +}マウスで）発現するマウスで同じ脊髄領域で実行されたとして。

図1二光子顕微鏡を用いたin vivoイメージングのためのマウス脊柱の安定化。（A）カスタムメイドのスチール製ベースプレートをSTS -ナリシゲコンパクト脊髄クランプとMA - 6Nナリシゲをサポートして整列させるために使用されるここに示されているようにアダプターを保持しているヘッド。脊椎安定化デバイス上にKXA麻酔薬で麻酔成体トランスジェニックマウスの（B）適切なポジショニング。インサートは、直ちに吻方と尾側椎弓切除と露出した脊髄組織に脊髄クランプの配置を示します。

図2。麻酔したマウスの脊髄における高密度小グリア細胞および血管のin vivoイメージング。の投影が、非整列Z -スタック（A）の血管に近接してCX3CR1 ^{GFP / +}マウス（赤、ローダミンデキストランの静脈注射で標識）の脊髄における高密度GFP陽性ミクログリア（緑）。容器の周りに拡張プロセスとし、脊髄実質に向かって血管の壁に接続された単一のミクログリア細胞の（）内のラベル（B）の高倍率画像。スケールバーは、10μmの。

図3。彼らは別の日に移転し、麻酔したマウスの脊髄でイメージを再作成されたのと同じ軸索のセグメントとミクログリアのin vivoイメージングの繰り返し。 （A）YFP -ラボ 0日目と5日のeled軸索。 （B）。それらの周りに同じ血管構造とミクログリア細胞は、日0と1のCX3CR1 ^{GFP / +マウス}の脊髄でのin vivoで画像化。スケールバーは、10μmの。

ムービー1。マウス脊髄から生体内で取得した代表的なタイムラプスシーケンス。このシーケンスは、密に蛍光構造を移入組織内で時間をかけて（赤、ローダミンデキストランの静脈注射で標識）を詳細に細かいミクログリアプロセスダイナミクス（緑）と血管との相互作用を示しています。 RAW画像は、バックグラウンドノイズ、明るさやコントラストを補正したとタイムラプスムービーは、画像の位置合わせ、平均または個々の平面のzを選択することなく、連続して取得した画像スタックをzは、投影することにより構築した。血管は、ミクログリアの画像は、z平面の類似の範囲を通過。 Z面の深さ：38μmの。oad/2760/Davalos_Movie_1.movは">映画を鑑賞するためにはここをクリックしてください。

映画（2）タイムラプスシーケンスは、単一のz -平面のレベルでのイメージング法の生の安定性を実証。 KXA麻酔下で脊髄の安定化デバイス上に配置CX3CR1 ^{GFP / +}マウスの脊髄内の同じ単一のz -平面の高速アクイジションでは、より高速な1フレーム/秒のスキャン速度で連続したフレーム間の最小の画像の変位を示していますマウスの呼吸速度。マイナー残留変位は、おそらくビートによるものです。 映画を見て、ここをクリックしてください。

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ディスカッション

方法は2つの光子顕微鏡を用いて麻酔したマウスの脊髄における人口密度の高い蛍光細胞構造の安定及びin vivoでの反復的なイメージングを可能にするここで説明する。実現性はカスタムメイドの脊椎安定化装置や呼吸器誘発性運動のアーチファクトを減少させる麻酔療法の結果です。脊椎安定化装置は、マウス本体の下に呼吸スペースを可能にし、市販の脊髄クランプとヘッド取付部?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
ローダミンBデキストラン	インビトロジェン	D1841	で希釈した70kDaの、 ACSF（3％w / v）の
ケタミン塩酸	Bionichepharma	NDC番号：67457-001-10	50mg/ml、注射
Anased	ロイド研究所	NADA番号：139から236	キシラジン注射液、 20mg/ml
アセプロマジン	Vedco	NADA番号：117から531	10mg/ml、注射
人工涙液 軟膏	フェニックス 製薬	NDC番号：57319-760 - 25	潤滑油
Betadine	フィッシャー	19-061617
マクファーソン、ウェストコット はさみ	世界の精密 楽器	555500S	湾曲した、鈍チップ はさみ
ストレートピンセット	世界の精密 楽器	555047FT	歯先端の鉗子
小血管は焼灼する	ファイン科学ツール	18000〜00
Gelfoam	ファルマシア、ファイザー社	ミキサーミルMM400
コンパクト脊髄 クランプ	ナリシゲ	STS -
頭部保持アダプタ	ナリシゲ	MA - 6N
Gelseal	アマシャム バイオサイエンス（株）	80-6421-43
乳酸リンゲル	バクスターヘルスケア	2B8609
Buprenex	Reckitキットベンキーザー ティカルズ社	NDC番号：12496 - 6757から1	ブプレノルフィン、 注射可能な
Baytril	バイエル	NADA 140から913	エンロフロキサシン、 抗菌性注射剤 2.27パーセント（20ミリリットル）
加熱パッド - 大	ファイン科学ツール	21060〜10