マルチプレックスPCRおよび逆ラインブロットハイブリダイゼーションアッセイ（mPCR / RLB）

要約

43分子標的までの同時検出のための安価な、高スループットの方法が記載されている。 mPCR / RLBのアプリケーションでは、微生物のタイピングと臨床検体から複数の病原体の検出を含む。

要約

マルチプレックスPCR /リバースラインブロットハイブリダイゼーションアッセイは、再使用可能なナイロンメンブレン上のプローブのハイブリダイゼーションの前に1つのマルチプレックスPCR反応を用いて43試料の43分子標的までの検出を可能にする。プローブは、膜に固定できるように手を加えた5'アミンです。プライマーは、ストレプトアビジン - ペルオキシダーゼと感光膜を介して化学発光基質を用いてハイブリダイズしたPCR産物の検出を可能にする5'ビオチン変更されている。低設定と消耗品のコストで、この技術は安価です（約2米ドルサンプルあたり）、高スループット（複数の膜を同時に処理することができます）と短いターンアラウンドタイム（約10時間）があります。

手法はいくつかの方法で利用することができる。複数のプローブは、単一の増幅産物の中で配列変異を検出するように設計することができる、または複数の製品は、その後の検出に使用するもの（またはそれ以上）のプローブで、同時に増幅することができる。両方のアプローチの組み合わせは、単一のアッセイ内でも使用することができます。単一の標的配列に対して複数のプローブを含める機能は、アッセイの特異性の高いです。

mPCR / RLBの公開アプリケーションは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌 ^3-5およびサルモネラ SP ^6、 肺炎球菌 ^7,8、 連鎖球菌agalactiae ⁹およびエンテロウイルス^10、11、識別の分子血清型別を入力し、抗生物質耐性遺伝子の^1,2の検出を含むマイコバクテリウム属^12、性器^13-15および気道¹⁶と他の¹⁷病原体と検出とmollicutes ¹⁸の識別の検出。しかし、技術の汎用性は、アプリケーションが事実上無限と微生物の分子解析に限定されるものではないことを意味します。

mPCR / RLBの5つのステップは）プライマーとプローブの設計、b）のDNA抽出とPCR増幅C）膜の調製、d）のハイブリダイゼーションと検出であり、膜のe）の再生。

プロトコル

慎重な検討がプライマーとプローブの設計を考慮する必要があります。 、GenBank等のデータベースから目的のターゲットのすべての利用可能な配列は、適切なターゲットとなって保存された領域を識別するために利用されるべきである。膨大な数のターゲットは、単一のmPCRアッセイで増幅されている場所、それぞれ増幅された配列は、同じような長さでなければならない、との競争を避けるために、300塩基対を超えてはいけません。方法の別のアプリケーションが保存された領域に対するプライマーを使用して1つのより長いターゲットを増幅するとアンプリコン内配列変異を識別するために、複数のプローブを使用することです。このインスタンスでは、増幅されたPCR産物は、長くなることがあります。プライマーのアニーリング温度はすべてそれに応じて調整のPCR条件で、同様にする必要があります。強い二次構造やプライマーダイマーを形成するプライマーは避ける必要があります。シグマアルドリッチDNA計算機（ http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.aspは ）確実にこれらの機能を予測するために使用することができます。

DNAプローブは、60に近い温度℃をアニーリングしているように設計する必要があります特異性を最大にするには、関心の各ターゲットの2つのプローブは、アッセイでリバースプライマー結合部位に隣接する前方にDNA鎖にハイブリダイズするものを含まれており、フォワードプライマー結合部位に隣接する逆鎖に他のことができます。この場合、両方のフォワードおよびリバースプライマーは、ビオチン修飾でなければなりません。増幅された標的ごとに1つのプローブが使用されている場合は、その唯一の一方のプライマーは、ビオチンを変更する必要が。

mPCR / RLBアッセイ用のプライマーとプローブを設計するときそれを強くin vitroでの結果と相関することがPCR産物とプローブのハイブリダイゼーションを予測するインシリコメソッドで使用することをお勧めします。理想的には、これは全ゲノム配列が提供されている分離株を用いて行われます。このようなFastPCR（http://primerdigital.com/fastpcr.htmlで入手可能）などのソフトウェアは、この目的のために使用することができます。 インシリコ解析の低いプローブアニーリング温度で生じる塩基対のミスマッチを示してどこが弱いか存在しないプローブの信号を予測することができます。

DNAの抽出技術は、テストされているサンプルに応じて異なり、PCRの条件は、プライマーの設計に依存することになります。読者は、DNA抽出とPCRの試薬 ​​および条件^1-19に関する詳細については、個々のアッセイに関する出版物と呼ばれています。

各アッセイは、少なくとも1つの正と負のプローブ膜上の各プローブの信号だけでなく、DNAフリーのコントロールを提供するために、適切なコントロールで実行されます。さらに、それはすべてのサンプル（：微生物の場合には、種や属特異的プローブなど）が陽性になることが予想される膜の上部にあるプローブを含めることが有益です。これは、ポジティブコントロールプローブとして機能するだけでなく、結果の簡単なオリエンテーションを許可します。

1。膜の調製

1. 以下のソリューションを準備します。
   • 100ミリリットル0.5M NaHCO3水溶液（pHは8.4）
   • 100ミリリットル0.5M NaHCO _3を
   • 20ミリリットル16％EDAC
   • 250ミリリットルの0.1 M NaOHを
   • 250ミリリットル2xSSPE
   • 250ミリリットル2xSSPE/0.1％SDS - 60℃水浴中での場所
   • 250ミリリットルの20mM EDTA。
2. 60℃に予熱オーブン
3. 70％エタノールでMiniblotter Immuneticsを清掃してください。
4. 2 pmolの/μlと200μlのの容積の最終濃度0.5 M _炭酸水素ナトリウムのオリゴヌクレオチドプローブを希釈する。
5. 15x15 cmまでBiodyneCナイロンメンブレンをカット。鉛筆と定規を用いて、膜の上部に0.5センチメートルスペースをオフに支配し、ここに詳細を記述します。
6. 20mlでビニール袋のシール膜は、新鮮な10分間室温で16％のEDACのソリューションと岩を作った。
7. 30秒間脱イオン水でメンブレンを洗浄してください。
8. 膜（鉛筆の線に平行）を介して実行されているチャンネルとminiblotterのメンブレン。場所と密接なブロッターにサポートクッションを置く。チャネルから流体を吸引除去する。
9. 150μlの0.5 M NaHCO ₃でレーン1と45を埋める。気泡に注意しながら、シーケンスのレーン2-44を埋めるために、各プローブ溶液150μlを使用する。気泡が所定の位置にピペットを維持、チャンネルに表示されない場合は、速やかに空気の泡が再試行して、ピペットの上に浮くようにするソリューションを吸引除去する。室温で5分間インキュベートする。
10. プローブ溶液を吸引、膜を除去し、9分、室温で250 mlの0.1 M NaOH中で洗う。
11. 30秒間の250 mlの2xSSPEで膜を洗浄してください。
12. 60℃のオーブンで250ミリリットル予め温めておいた2xSSPE/0.1％SDS中でメンブレンを洗浄℃で5分間。
13. 20分（残りの10ミリリットルを予約）を、室温で240ミリリットルの20mM EDTAでメンブレンを洗浄、直ちにハイブリダイゼーションに使用されていない場合は、残りの10ミリリットルの20mM EDTAおよびSTORとビニール袋の膜をシール4で冷蔵庫内の電子℃に
14. 洗剤とブラシをPyronegでminiblotterを洗ってください。すすぎ、乾燥させます。

2。ハイブリダイゼーションと検出

1. 以下のソリューションを準備します。
   • 250ミリリットル2xSSPE/0.1％SDS - 60水浴で店舗℃に
   • 500ミリリットル2xSSPE/0.5％SDS - 60の水浴中で店舗° C
   • 500ミリリットル2xSSPE/0.5％SDS - 42℃のオーブンで店舗° C
   • 500ミリリットル2xSSPE - 室温に保つ
   • 500ミリリットル1％SDS - 60の水浴中でストア° C最初に（ステップ3）
   • 250ミリリットルの20mM EDTA - 室温で保管（ステップ3）。
2. ° Cと42対1℃のオーブンで60に一つオーブンの電源を入れホットプレート上で大きなビーカーに水を沸騰させる。
3. 70％エタノールでMiniblotter Immuneticsを清掃してください。
4. 小さな容器に2xSSPE/0.1％SDSのアリコートを10ミリリットル。番号付きのチューブに150μlの2xSSPE/0.1％SDSに各PCR産物の20μlを添加する。
5. 100 10分間のPCR産物を沸かし° C発泡スチロールホルダーを使用して。少なくとも5分間、直ちに氷上に置きます。
6. 60で240ミリリットル2xSSPE/0.1％SDSを残りで膜を洗う℃で5分間オーブン。
7. バッキングクッション付きminiblotterのメンブレン。親しませるためのチャンネルは（垂直鉛筆の線に）垂直に実行。
8. miniblotterチャネルから吸引過剰の液体。
9. 最初と最後のチャンネルに、残りの150μlを2xSSPE/0.1％SDSを追加。気泡に注意しながら、シーケンスの残りのチャンネル（2-44）にゆでPCR産物を追加。
10. 60の平坦な場所のminiblotterハイブリダイゼーションが行われるように1時間℃のオーブン。
11. その後miniblotterから膜を除去する、各チャンネルから液体を吸引除去する。
12. 10分間60℃のオーブンで温めておいた250ミリリットル2xSSPE/0.5％SDSで2回洗浄する。
13. ° C、42で2xSSPE/0.5％SDSとナイロン分離メッシュを湿らせ、膜をロールアップするために使用します。
14. 場所は、ローラーのチューブに膜をロールアップ、および膜の内面に当接することを確認するために繰り広げる。 ° Cとローラチューブに追加42で15ミリリットル2xSSPE/0.5％SDSに3μlのストレプトアビジン - ペルオキシダーゼ複合体（ロシュダイアグノスティックス）を追加します。蓋をきちんと締めると42でローラーのオーブンでインキュベート° Cで60分間。ロールの方向が膜が締めしないようになっていることを確認します。漏れがないか定期的に確認してください。
15. 洗剤と水をPyronegでminiblotterを洗い、すすぎ、乾燥させてください。
16. ローラーチューブから膜を取り外します。 42で2xSSPE/0.5％SDSを残り° Cで1​​0分間で2回洗浄する。
17. 5分間室温で2xSSPEで2回洗浄する。
18. 80 ° Cとプリ暖かいのオーブンの場所500ミリリットル1％SDSをオーブン回し。
19. 15ミリリットルアマシャムのECL検出液（溶液の7.5 mlと溶液Bの7.5 ml）を構成しています。 2xSSPEを破棄し、検出ソリューションを追加します。ソリューションと膜の完全なカバレッジを確保する2分間手で軽く揺すり。化学発光液を捨て。
20. 露出のカートリッジに合わせてプラスチック製の透明性の二枚をカット。露出のカートリッジに2つのシートと場所の間に膜を置きます。
21. 暗室に進んでください。赤色光のもとで、カートリッジにECL検出フィルムを追加し、5分間さらす。表示するときに正しい向きを可能にするために取り外し時にフィルムの犬の耳の右下隅。
22. あたりの製造者の指示のような自動化された開発者や化学風呂付きフィルムを開発する。
23. 必要に応じてより長いまたはより短い露光時間で露光を繰り返します。

3。膜の再生

1. ° Cで30分間二回80で250 mlの1％SDSで洗浄します。
2. 室温で15分間240ミリリットルの20mM EDTAで細胞膜を洗浄してください。
3. 10ミリリットルの20mM EDTAとビニール袋の膜をシールし、4℃℃に冷却将来の再利用のためにCを。

4。代表的な結果：

結果は、最高の印刷されたグリッド上にフィルムを置くこと、または他の画像をスキャンし、そのようなBioNumerics（応用数学、シントマルテン- Latemの、ベルギー）などのソフトウェアにインポートして表示されています。各プローブの結果は、ポジティブとネガティブコントロールプローブを参照して解釈されるべきである。結果は最高の、負の弱いまたは正として評定されます。信号が同じくらい強いまたは陽性対照プローブよりも強いです肯定的な結果は次のとおりです。信号が存在しないか、ネガティブコントロール（バックグラウンド信号の場合）に等しくなる負の結果は次のとおりです。弱い結果は、信号がポジティブコントロールプローブより暗いが、陰性対照よりも強いているところです。弱い結果は弱いプローブの結合、またはプライマーダイマーの形成から、非特異的シグナルのためにつながる点突然変異の結果である可能性があります。興味の対象ごとに2つのプローブを使用すると、単一の弱い結果が安全に非特異的なシグナルとして解釈することができる特異性を、向上させることができます。何か疑問が残っている場合は、シングルプレックスPCRの反応はどんなアンプのゲルベースの​​検出およびシークエンシングを行うことができます。結果は真に正であるかどうかを判断するために製品をlified。代表的な結果は図2に示します。

図1。mPCR / RLB原則（P1）は、ステップ1.9。アミン修飾されたプローブは、ナイロンメンブレンに共有結合されています。 （P2）ステップ2.10。ビオチン修飾したPCR産物はプローブにハイブリダイズさせる。 （P3）ステップ2.14。パーオキシダーゼ標識ストレプトアビジンは、膜をインキュベートし、ビオチンに結合する。 （P4）2.19から2.21までを繰り返します。ペルオキシダーゼは、光感応膜が露出しているため光を生成する、ECL検出試薬の反応を触媒する。メンブレンを再利用のために洗浄する。

図2。代表mPCR / RLB結果。 〜6サンプル1はポジティブコントロールを表します - それらの間に43のプローブごとに少なくとも1つの正プローブ信号があります。各標的配列は、（U経由で）特異性を最大化するために二つの異なるプローブで検出される。プローブA1とA2は、それぞれのサンプルが陽性になるとフィルムの向きを支援すると予想される種特異的プローブを表しています。プローブA1は、膜の下部に繰り返されます。サンプル7と8はネガティブコントロールです。プローブのQ1は、Q2、T1とT2は、プライマーまたはプライマーダイマーの製品の可能性非特異的結合を示し、ネガティブコントロールのシグナルを持っていることに注意してください。これらのプローブまたはプライマーの再設計が必要になります。プローブC1、D1およびストレプトアビジン - ペルオキシダーゼ複合体や化学発光基質のいくつかの非特異​​的取り込みに起因する可能性が膜を横切ってストリーキングF1ショーが、しかしこれは容易に真陽性プローブ​​信号と区別される。プローブのD1とD2は、他のプローブに比べて相対的に弱い信号を持っている、これはあまり効率的な増幅につながる大きなアンプリコンが原因である可能性があります。プローブJ2は負であり、プローブJ1が正のいくつかのサンプル（1、3、4、6、39）です。これは、多くの場合、これらのサンプルのJ2結合部位に変異を表します。

ディスカッション

mPCR / RLB方法は、PCRアンプリコンの多数の同時検出を可能にする。ために化学発光プローブベースの検出の高感度で、プライマーペアの数が多い単一のマルチプレックスPCR反応はDNAテンプレートを増幅するために使用することができます。

は、プローブ信号が一つ以上のサンプルで得れていない場合は、残りのPCR産物をゲル電気泳動を行うと、問題はPCR増幅やプローブのハイブリダイゼーションになっているかどうかを区別することができます。膜上のすべてのプローブ信号が弱いか存在しないが、ゲル電気泳動が成功したPCR増幅を示す場所、可能性は膜の標識の問題、前使用後の膜の不正確な再生、ハイブリダイゼーションまたはストレプトアビジンのインキュベーション時に間違った温度、または不良品が含まれストレプトアビジンをペルオキシダーゼ結合体または検出試薬。

コントロールサンプルは、個々のプローブは偽陰性の信号を生成できることを示している場合は、ゲルベースの​​検出とそれに続くシーケンスを持つ単一のPCRは、PCR産物の増幅を確認するために、プローブ結合部位での配列変化を探すために実行することができます。弱いか存在しないプローブの信号は、大型アンプリコンの大きさに起因する可能性があります：可能であればすべてのアンプリコンは、同様の長さ未満の300bpのはずです。アンプリコンの二次的なDNA構造はまた、貧しい人々のプローブの結合が生じ​​ることがありますし、プライマーの再設計を必要になる場合があります。個々のプライマーまたはプローブ濃度は、信号強度を最適化するために変えることができる。

nonamplifiedプライマーやプライマーダイマーの生成物の結合プローブに起因する偽陽性シグナルは、ゲルベースの​​検出とそれに続くシークエンスで、単一のPCRを行うことにより調べることができます。この問題が発生した場合は、プローブの再設計を余儀なくされることがあります。プローブ結合部位の点変異が弱いか、または存在しない信号につながる可能性があります。各増幅産物のための2つのプローブを許可することで検出するためにこの簡単に行うことができます。この特性は、ターゲットDNAのわずかな配列の変化を検出するために慎重なプライマーとプローブの設計と悪用される可能性があります。

利用可能な製品の検出以下のマルチプレックスPCRの反応の多くのメソッドが存在する間は、要約すると、、mPCR / RLBは、高スループットと低設定、コストと安価であるという利点を持っています。メソッドの柔軟性は、幅広い用途にその使用を許可します。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬	会社	カタログ番号	コメント
5'アミンC6は、オリゴヌクレオチドプローブを修正	シグマアルドリッチ
NaHCO 3の	シグマアルドリッチ	S - 8875	0.5M溶液は、pHを8.4にアップしました
NaOHで	シグマアルドリッチ	S5881	0.1Mソリューション
20xSSPEバッファ	Amresco	0810 - 4L
ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）	シグマアルドリッチ	L - 4390	10％ストック溶液を構成する、オートクレーブしないで、使用前に1週間の最大のために維持する必要があります
エチレンジアミン四酢酸（EDTA）	シグマアルドリッチ	E9884	pHは8.0とオートクレーブに調整0.5M溶液を作る
N -（3 - ジメチルアミノプロピル）- N' - エチルカルボジイミド塩酸塩（EDAC）	シグマアルドリッチ	E7750	3.2グラムのEDACと18ミリリットルミリポア水を使用して、使用直前に20ミリリットル、16％のソリューションを構成する
BiodyneC0.45μmのナイロンメンブレン20 × 20センチメートル	PALLライフサイエンス	74480C
脱イオン、精製水
液体Pyronegの洗剤	ジョンソンダイバー	HH12291
ストレプトアビジン - ペルオキシダーゼ複合体	ロッシュ	11 089 153 001
アマシャムのECL検出試薬	GEヘルスケア	RPN2105
アマシャムのECL検出試薬	GEヘルスケア	RPN2105
OHPの透明フィルム	コー​​ポレートエクスプレス	EXP 504 OHP
アマシャムhyperfilm ECL高性能化学発光のフィルム18x24センチ	GEヘルスケア	28906837
アイス

機器	会社	カタログ番号	コメント
Hybaid Shake'n'Stackオーブン（2）圧延ボトルやナイロン分離メッシュ	サーモサイエンティフィック	HBSNSRS220	メソッドは、42でソリューションを維持するための施設がある限り、単一のオーブンで行うことができます° Cと60を使用する° C前
ベリーダンサーのロッキングプラットフォーム	ストーバル生命科学	ユーロBDbo
Miniblotter	Immunetics	MN100 - 45
ウォーターバス
吸引
ホットプレート
露出カートリッジ	シグマアルドリッチ	Z36 ,009 - 0
X線フィルムの開発			また、暗い部屋ではなく、自動化のトレイに開発、定着液と水を使用することができます開発者。ルミノ-イメージャは、X線フィルムの代わりに使用することができます