マルチ連絡ラミナーの電極の録音を使用してローカルネットワークの処理を検討

要約

皮質回路の理解に根本的な問題は、ネットワークが異なる皮質層に感覚情報をエンコードする方法です。ここでは、皮質の層を識別するために、単一のユニットと局所電場電位と現在の分析を記録するマルチコンタクト層電極を利用した電気生理学的手法を説明します。

要約

皮質層は、新皮質の高い再発ローカルネットワークで構成される^{1から4まで}を通してユビキタス構造です。近年では、大きな進展は異なる皮質層^5-8のニューロンの応答特性の違いの理解に行われ、まだかどうかについて学習し、固有層内の情報をどのように神経細胞集団をエンコードするために残さ多大はまだあるされています方法。

既存のマルチ電極アレイ技術は、皮質表面に沿って皮質空間の何ミリ全体の応答を測定するための有益なものの、層状皮質回路の問題にアプローチするには不向きである。ここでは、セットアップおよび多接点層電極活用した一次視覚野（V1）の皮質層で個々のニューロンと局所電場電位（LFPs）記録のため私たちの手法を提案する（図1; Plextrode U -プローブ、Plexon株式会社）。

含まれるメソッドは、デバイス構造、皮質層の同定、および個々のニューロンの受容野の同定を記録している。皮質層を識別するには、我々は、フルフィールドフラッシュ刺激を用いた時系列LFPの誘発反応の電位（ERPの）を測定する。私たちは、その後、レイヤ4の基部にあるシンクソースの設定（シンクレイヤ4の内部にある、続いて^9月12日顆粒層と呼ばれる）を伴う極性の反転を識別するための電流源密度（CSD）の分析を行う。それは貫通電流の流れの位置のインデックス、方向、および密度を提供するため、電流源密度は、私たちは正確に一つの浸透⁶のすべてのレイヤ^、11、12から記録するために電極を配置することができます、便利です。

プロトコル

1。 NANマイクロドライブの構造

我々は、NANの電極の駆動方式との組み合わせで、U -プローブを使用してください。このシステムを構築するには2-3時間を必要としますが、一度構築された、それは変更することは非常に簡単です。我々は、4チャンネルのベースを（図2a）を含むNANタワーを、組み立てることから始め、NANチャンバー（図2b）、1mmの間隔（図2c）、1-4ネジのマイクロドライブ（図2d）、1とグリッド-4ガイド管（図2eを、500μmの直径と約5〜7 cmにカット）、および1-4マイクロドライブの塔（図2F）。簡単のために、私達は一方塔と一つのU -プローブとNANのシステムを構築するための手順を説明します。すべての材料が使用可能な場合、いくつかの訓練の後、この手順は、通常2-3時間かかります。

1. NANの電極のドライブアセンブリを構築するために、最初のメジャーアセンブリ、必要なすべてのツールと​​の作品（例えば、ガイドチューブ、ガイドワイヤ、完全なdremilセット、NANの工具および部品とU -プローブ）。彼らは長い間それを損傷することなく硬膜の上に置くのに十分な記録デバイスに接続されているので、ガイドチューブを測定します。
2. NANの電極のドライブアセンブリを構築するには、最初のレコーディング室の深さを測定する。その後、約5〜7 cmの測定長ガイドチューブをカット。ガイドチューブをカットしながら、一つは金属片がチューブの内側に入らないように注意して確認する必要があります。チューブ内部の金属片を除去するためのガイドチューブの内径よりも小さく硬いワイヤを使用してください。
3. 次に、NANベースにNANのグリッドを配置します。クランプねじとグリッドのネジを締めます。ベースとグリッドが確保されれば、関心の記録領域を識別し、NANのグリッドの底部からガイドチューブを進める。
4. それはNAN室の外側約1〜2 mmであるまで、グリッドを介してガイドチューブを渡します。ガイドチューブは、所望の位置になると、NANマイクロドライブタワーを組み立てる開始。
5. 各NANマイクロタワーに2個のクランプがある - モーターはボトムクランプのどちらかの場所またはルーズに固定することができますが、トップクランプを駆動します。 U -プローブの補強管に上部クランプを取り付けます。ガイドチューブにボトムクランプを添付して所定の位置にガイドチューブを保護するために瞬間接着剤を少量。このシステムはより安定とにより、U - Probeの補強管に接続されている2個のクランプに、より正確でもあります。
6. 慎重にガイドチューブの上部にU -プローブの先端を合わせ、あなたがNANベースに塔を確保できるようになるまでのガイド管を通ってU -プローブを渡します。 U - Probeまたはガイドチューブ上に追加された緊張がないようにネジで塔の位置を調整します。

2。 U -プローブ滅菌

層電極またはPlextrode U -プローブはPlexon社から購入し、約$ 2000の価格で入手可能です - 4000ドル。接触部位の数、サイトの構成、および各サイトの直径：価格には3つの主要な側面に依存する。我々は現在、リニア構成と25μmの接触直径と16チャネルのバージョンを使用しています。重要なのは、U - Probeの厚さは、直接接触の直径に関係しています。我々の実験では、我々は常に360μmの厚さに等しい25μmの直径の連絡先を、使用している。私たちのバージョンのモデルの現在のコストは約3500ドルドルです。 U -プローブは、ジャンパと接地線と約4-6週間です購入から納品までのリードタイムを持つ極ケースに詰めています。

1. シリンダーベースのNANのシステムを配置し、対応する塔にモータケーブルを接続します。複数のタワーを使用している場合は、色分けされたZIPの関係は、モータケーブルと塔とを区別するために使用されます。
2. その場所にその自動的に表示対象の位置U -プローブを設定するか、U - Probeを進め始める、NANのソフトウェアプログラムの使用またはNANのソフトウェアのインタフェース上で"ダウン"をクリックして、。先端の最低10 mmのNANチャンバーの最後を超えてガイドチューブを介しているようにU -プローブを進める。
3. U -プローブ、前に注入された録音室にNANのベースの取り付けに20〜30分間MetriCide活性アルデヒドの溶液中で場所を消毒する。その後、滅菌水でU -プローブとNANベースをすすぐ。
4. U -プローブので、先端がちょうどガイドチューブの内部にあることを後退させることによりNANのソフトウェアの場所をゼロにする。 NANのソフトウェアでは、すべてのポジションをゼロにします。
5. 移植された録音室にNANのベースを取り付け、4本のネジをすべて締めます。その後、録音室の側にあるピンに応じて、ベースの位置を合わせます。すべての4本のネジを締めて、NANのベースがしっかりと録音室に接続されていることを確認してください。

3。録音のためにU -プローブを進め

硬膜の強度と厚さは被験者間で大きく変動であることを考えると、我々は、U - Proを推進するための一般的な手順を実施しているNANマイクロドライブシステムを使用してください。重要なのは、各U - Probeは、各接点のインピーダンスとU -プローブの全体的なレンジャーの詳細な分析が付属しています。我々は、その接点インピーダンスMΩ0.3から0.5の範囲であったの電極を使用していました。現在Plexonから購入できるインピーダンスはテスターがあるが、残念ながら、私たちのレコーディングの時にこのデバイスは利用できませんでした。その結果、我々は、インピーダンスの詳細な分析を実行することはできませんされている。

1. U -プローブは、（底部コネクタの一方の導線に接続されたジャンパーを持っている）フローティングのままです。ヘッドステージはU -プローブのコネクタに固定されており、アンプのケーブルが接続され、接地されています。
2. 約1〜2 mmの初期の進歩は速く、強いものにすべきです。 0.2ミリメートル/秒と0.2〜深歩 - - 0.3ミリメートル0.1の範囲の速度パラメータを設定します。これらの値は、U - Probeがきれいに穿刺硬膜をすることができ、記録の重要な第一歩であることを保証します。
3. 一度硬膜を介して、0.050 -0.1 mm /秒に速度を低減し、0.05に深さの段階を減らす - 0.1 mmです。目標は組織が損傷されていない可能性のような滑らかで、遅いとしてU -プローブを推進することです。プローブは、脳に入ったことを指摘の一つは、ノイズレベルの低減（：ローカルフィールドポテンシャルテキストオーバーレイ）を伴うLFPの振幅の変化である。
4. 電極は、すべての皮質の層に​​またがるていることを確認するには、フルフィールドの白いフラッシュ刺激に対する応答の振幅の変化を測定する。時間にわたってLFPの振幅の変化は誘発反応の潜在的な分析を基礎になっています。この分析では、皮質の層を識別するための基礎を提供する。

4。皮質層の同定と検証

我々は、誘発反応の電位（ERP）パラダイムと電流源密度（CSD）解析を用いて皮質の層を識別するための手順を実施している。それは、私たちは正確に、単一の浸透の全ての層から記録するために電極を配置することができます、場所、方向、および貫通電流の流れの密度のインデックスを提供するため、我々は、CSDに依存していました。確かに、チャールズシュレーダーと同僚は、以前は層記録、微細な病変、と^9-12 V1の皮質層の機能的同定におけるERP / CSD法の有効性を検証するために組織学的再建を組み合わせている。自発的に生成された振動を使って他の方法は、皮質スピンドルとアップ/ダウンの状態^13から15のような皮質の深さを識別するために使用されています。

この分析では、我々はU -プローブ（の等間隔の接点間のLFPの時系列の2番目の空間微分によるとCSDを計算するMATLAB用のICSDツールボックスを利用http://software.incf.org/~~Vソフトウェア/ csdplotter /自宅 ^{）9,10,16,17。}

1. 皮質層を識別するには、黒に戻ってから100ミリ秒のために白に点滅して、フルフィールド黒い画面に被写体を露出させる受動的な固定のタスクの間に誘発反応の電位を測定し、。このシーケンスは、200回も繰り返される1試験を構成している。
2. Plexonマルチチャンネルの取得プロセッサは、ナショナルインスツルメンツのPCIボードを介して記録を直接コンピュータにすべての連続した​​データ信号を保存します。データが保存された後、電流源密度解析のための信号処理を開始。
3. ヘッドステージのフィルターとプレ増幅がボードによって誘導さLFPの信号の時間遅れを補正するPlexonが提供するFPAlignソフトウェア補正を使用してください。
4. この時点でデータはNeuroexplorerを使ってMATLABに転送されます。各LFPのチャネルは、0.5 Hzから100 Hzのカットオフ周波数をもつ標準的なハイとローパスフィルタを用いて濾過する。各電極の接触がフィルタリングされた後、各電極の接触の平均LFP時系列を得るために臨床試験全体の各試験と平均を識別する。その後、時間の関数としてLFPの振幅を持つ行列に各連絡先を整理する。
5. ワークスペースでCSDplotterを入力して、MATLABのツールボックス：ICSD（電流源密度テキストオーバーレイ）を実行します。サンプリング周波数は連続的なデータは1 kHzであることを考えると、DTのパラメータを1ミリ秒に設定します。次に、0.4 S / M（これは、立方ミリメートルあたりナノアンペアの単位で電流源密度を近似）する皮質導電率の値を設定し、連絡先の数を反映するために[0.1:0.1:1.6]のベクトルとしての電極の位置を変更。すべてのパラメータが挿入されたときに'この実行"をクリックします。
6. CSDplotterインターフェイスでCSDのプロフィールを表示し、新しい図に貼り付けます。このようなimagescとしてMATLABで一般的な機能は、レイヤのプロファイルをプロットするために使用することができます、そして、さまざまな平滑化アルゴリズムと正規化のルーチンは、CSDのデータを表現し、時間を越え層の識別を比較するために適用することができます。とのセッション。
7. レイヤ4の基部にあるシンクソースの設定に伴う極性の反転を識別するには、まず、層状CSDのプロファイルを使用して顆粒層における主要なシンクの存在を確認してください。 CSDプロットに負極性の駆動シンクを見つけます。その後、粒状のシンクの重心を計算する。
8. 重心は、連絡先の番号とシンクが最大だった時間から成る解析から得られる。シンクの重心との接触は、0μmの顆粒層の参照として機能します。 、supragranular粒状、とinfragranular：すべての連絡先上記と参照してグループ化可能な3つの層の一つに以下を分析する。
9. 時間的なドメインを変更せずに、電極の位置をシャッフルで粒状のシンクを検証する。 CSD行列をシャッフルした後、再び重心解析を計算する。皮質の深さの関数として電極のコンタクトをシャッフルしても、層流の特異性を破棄する必要があります。

5。個々の神経細胞と受容野のマッピングの同定

我々はU -プローブから複数の単一のユニットを分離して記録して大きな成功を収めている。通常は録音で、我々は6-10よく分離したユニットと14〜16ローカルフィールドポテンシャル信号を持つことを期待することができます。単一のユニットを見つけることは、単一の電極に比べてもU -プローブとより確実です。一つ正確に16の電極を進めるために必要なすべてのハードウェアを使用していた場合であっても、彼らは正確にU -プローブと同様に皮質の層の機能としてネットワーク集団を探索することができないだろう。最後に、我々は通常、30から40まで侵入するためのU -プローブと同じで記録することができます。

1. 受容野を見つけるために、受容野が潜在的に配置されているモニターに逆相関の刺激を提示することから始めます。刺激は0、45、90、135度で4方向の格子で構成されています。
2. 受容野を特定するために発射速度マップのクラスタ解析を実行します。最初に、それぞれの時間遅延の最大発火率の位置とそれらの重心を計算する。その後、重心およびこれらの最大発火率の場所間の距離を計算する。 120ミリ秒を5ミリ秒間隔でそれぞれのニューロンのために独立して - 40との間の伝導遅延のために各空間位置での速度を発射するのマップを計算する。
3. すべての時間遅延での重心と周囲の最大発火率のポイント間の合計距離を見つける。受容野は、その距離を最小に時間遅延になります。
4. 受容野は、セル毎に検出されると、記録された人口内のすべての受容野が重複し、すべての受容野の位置より大きい逆相関の刺激を提示する。リアルタイムの発火率のプロットは、正しい受容野の位置が特定されているかどうかを判断するために使用することができます。
5. 最後に、突然彼らの応答を変更し、唯一のさらなる分析のために安定した発火率と単位を維持する一つのユニットを取り外します。さらに、最高の信号対雑音比と記録部位を選択する。

6。代表的な結果：一次視覚野からの皮質の層に​​またがる単一のユニットとLFPsの録音

層状電極を用いた解析において最も重要なステップの一つは確実に皮質の層を識別し、多くの時間とセッション間でこの識別を確認することです。従って、我々は、フルフィールドフラッシュ刺激（図3a）に対応して層状接点間のLFPsの誘発反応の電位（ERPの）を測定した。図3bは1つが皮質の層を識別するための電流源密度（CSD）を計算するために取得するために必要な情報の種類の例を提供します。私たちは、その後、レイヤ4の基部にあるシンクソースの設定に伴う極性の反転を識別するために、LFPの時系列のCSD解析を採用。 （SG）、粒状（G）とinfragranular（IG）の層がさらに四時間のレコーディングセッションの開始後に安定しているsupragranularの位置 - 図4aは、時間の関数として皮質の深さを越え皮質層のローカライズのCSD解析を示しています。図4bは、所定のレイヤに割り当てられているコンタクトの平均を表すCSDのトレースが含まれている - この例では、顆粒層は〜50 msでCSD振幅の明確な減少を受ける。この分析はそれぞれ、supragranularとinfragranular層への顆粒層の上下電極の接触を割り当てるために参照する（0μmの顆粒層の参照を務めた最大のシンクの重心との接触）を務めていました。

層状電極を使用して別の重要な分析が正確に識別し、ニューロンの受容野をローカライズすることです。この手順では、ニューロンから最も堅牢なレスポンスを生成するために刺激を位置決めするための非常に重要です。図5aは、一次視覚コートにおけるニューロンの二つ受容野のプロットの例です。EX（V1）。これらのプロットの原点は、黒いコンピュータの画面上に一元的に表示される小さな白い円である凝視点、である。これらのプロットの色は、動的な逆相関の刺激に応答して、各ニューロンの発火率を表します。我々は、与えられた実験（例えば、A正弦波格子）のための刺激を配置するためにこの情報を使用してください。提示される刺激は、すべて同時に記録されたニューロンの受容野の位置を包含するために平均的な受容野のサイズより大きいです。

我々は皮質層と位置最適な受容野の場所に刺激を識別した後、私たちは動物が固定または差別のタスクのいずれかを実行している間、我々は様々な視覚刺激を提示した実験プロトコルに進むことができます。実験の後、我々は同じチャンネルを録画することができた、シングルユニットを分離するために私たちのスパイク波形解析を行う。この手順では、多くの場合、マスターするのに時間がかかり、新しい解析ソフトウェアや手法が提供されるように絶えず改善されています。図5bは1つがPlexonのオフラインソーターを使用した後に予想される出力の種類の例です。このソフトウェアを使用して、単一ユニットの分離は、目視検査を介して実行されます。異なるクラスタは、第1および第2主成分の重量、スパイクの幅、谷、そしてピークのプロパティに基づいて識別されます。

図1。マルチコンタクト層電極を用いた多接触層電極 、我々は、同時にV1の皮質層で分離された個々のニューロンとLFPユニットから活動をスパイク記録した。各U -プローブは、1.6 mmの全長にまたがる16（100μm）に等間隔電極接点で構成されています。各電極の接触は、直径が25μmであると、白金イリジウムで構成されています。

図2。 NANグリッドの建設 NANマイクロドライブシステムは、古典的なスクリュー駆動型マイクロドライブを超えて添加する安定性と精度を提供します。電極の各グループは独立して動作範囲を定義したユーザーの中で、XY平面で操作されます。 。電極の各グループは独立して作業深さ（最大100 mm）と0.001ミリメートル/秒から0.5mm /秒と1マイクロメートルの高分解能への可変速度範囲（4）ユーザ定義の中にZ方向に操作される-チャネルベース、1mmの間隔、（D）1-4スクリューマイクロドライブ、（E）1-4ガイド管（500μmの直径と約5〜7 cmにカット）と（B）NANチャンバー、（c）の格子、（F）1-4マイクロドライブの塔と（g）の完成NANのシステムやシリンダーベース。

図3。サルが100のために白をフラッシュフルフィールド黒い画面（〜1Hzの）にさらされたまま応答潜在的なパラダイムとLFPの時系列は（）皮質の層を識別するには誘発 、我々は受動的な固定のタスクの間に誘発反応の電位（ERP）を測定したミリ秒してから、黒に戻ります。（B）層のU -プローブで記録したLFPの応答は、各連絡先にERPのトレースを取得するために処理された。顆粒層は、ERPのトレースで、およびレイヤ4の基部にあるシンクソースの設定を伴うプレゼンス極性反転による応答の振幅のシンク駆動型の反転を配置することにより、すべてのセッションで決定されたものです。点線のボックスが反転が発生した期間のタイミングを示します。

図4。電流源密度解析を（）電流源密度解析（LFPの時系列の第²空間的な派生物に基づいて） 使用して、レイヤの識別はのベースでシンクソースの設定に伴う極性の反転を識別するために使用され顆粒層。我々は、（左から右へ）時間の経過とともに更新されている様子が安定した皮質層の同定を評価。これらの例では、電流シンク（青）は、顆粒層とスパンを表しています〜400μmのを。（b）各プロット以下のCSDのトレースは、特定のレイヤに割り当てられているコンタクトの平均CSDを表す。これは、私たちはこれらの例で最初のシンク（の正確なタイミングを決定するために許さ〜50から60ミリ秒。CSDトレース封筒は標準偏差と黒いバーを表すフラッシュ刺激（100ミリ秒）の持続時間を示す。

図5。スパイクソーティングと受容野のマッピングは、（）まず、半分のビジュアル度が計算され、倍になります。その後、逆相関の刺激は、CRTモニター、C上のパッチで表示されます0、45、90と135度で配向回折格子のonsisting。刺激がそれぞれの空間的位置のために提示された後、各ニューロンの発火率は40〜120ミリ秒の間に5ミリ秒間隔で独立に計算されます。最大燃焼速度は、それぞれの時間遅延のための重心を計算しています。その後、各遅延で重心と、隣接する発火率の場所間の距離が計算されます。最小距離と時間遅延は、受容野として選択されます。（b）のようなピークの高さ、谷の深さ、谷の時にピーク、ピークまたは谷の時間、などのスパイク波形の特性をオフラインでソートソフトウェアプログラムを使用して分析している（ Plexon）。一つのニューロンからの波形を別のから重複することなく、クラスタ化されるまでのスパイクは、同様の特性に基づいてソートされます。

図6。 CSDのプロファイルは、同じ規則は図3aのように。シャッフルが、我々はランダムに混合された連絡先の場所で新しいCSD行列をコンパイルシャッフルの手順を実行。この分析は、より時間的なドメインを変更することなく電極の位置をシャッフルして粒状のシンクを検証するために使用されます。時間をかけて表示されるこれらの例から、大脳皮質の深さの関数として電極のコンタクトをシャッフルしても、層流の特異性を破壊する。

ディスカッション

マルチユニットレコーディングは、刺激の情報をエンコード皮質でどのようにニューラルネットワークを分析するための標準となっている。電極技術の最近の進歩を考えると、層の電極の実装では、大脳皮質の局所回路の前例のない特性評価を可能にします。マルチ電極記録が神経細胞集団の動態に関する有益な情報を提供していますが、複数層の電極は、高い分解能と神経細胞の特定の場?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
機器の名前	会社	カタログ番号	コメント
ナンマイクロドライブシステム	ナンインスツルメンツ	NAN - S4	図2。カスタムクランプがU -プローブを使用するために必要です。 U -プローブを除き、前述のすべてがNANの楽器によって提供されます。
スクリューマイクロドライブ	MITの機械工場		NANのグリッドへのガイドチューブを確保することができるものは適切なはずです。
ステンレス鋼のガイドチューブ	スモールパーツ	B00137QHNS（1）またはB00137QHO2（5）	これらは、ドレメルのハンドドリルを使用して長いし、実験室でのサイズにカットで60です
Plexon U -プローブ	Plexon株式会社	PLX - UP - 16 - 25ED - 100 - SE - 360 - 25T - 500	で使用可能なU -プローブの仕様を参照してくださいwww.plexon.comはまた、図1を参照してください。

ソフトウェアの名前	会社	ウェブサイト	コメント
NANソフトウェア	NAN	http://www.naninstruments.com/DesignConcept.htm	コンピュータインターフェースはPlexonシステムとNANのハードウェアに対応するために追加のシリアルポートが必要です
オフラインソーター、FPAlign、PlexUtil、MATLABプログラム	Plexon	http://www.plexon.com/downloads.html＃ソフトウェア	下の"インストールパッケージ"
NeuroExplorer	NeuroExplorer	http://www.neuroexplorer.com/	"リソース"の下に
CSDplotterのバージョン0.1.1	KLAS H.ペターソン	http://arken.umb.no/〜klaspe / user_guide.pdf