ヒト人工多能性幹細胞をトランスフェクトしNucleofecting

要約

遺伝子組み換えの最近の進歩にもかかわらず、ヒト胚性幹細胞（hESC）のトランスフェクションは、気まぐれなプロセスのままです。我々の知る限りでは、人間の人工多能性幹細胞（性IPSC）トランスフェクトする体系的かつ効率的な方法が報告されていない。ここでは、効率的にトランスフェクトし、人間性IPSCをnucleofectするための堅牢なプロトコルを記述。

要約

遺伝子改変は、幹細胞生物学を研究することにし、ヒト胚性幹細胞^（hESC）1の電位の臨床応用を定めたに不可欠なツールであることを続けています。いくつかの遺伝子送達方法の改善は^2-9を説明してきたが、トランスフェクションは、ヒトES細胞のための気まぐれなプロセスのままで、まだ人間の人工多能性幹細胞（性IPSC）に報告されていません。このビデオでは、我々の研究室では日常的に増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP）レポータープラスミドを用いてヒトの性IPSCをtransfectsとnucleofects方法をデモンストレーションします。人間性IPSCが適用され、フィーダー細胞のトランスフェクションの可能性を排除し、トランスフェクション後の安定したトランスジェニックIPSCクローンの効率的な選択を可能にするためにフィーダーフリー培養として維持されています。クレオは、人間性IPSCは、細胞馴化フィーダ内フィーダー上nucleofectedと再播種ROCK阻害剤^11、細胞の小さな塊にトリプシン処理で前処理される細胞の回収を強化するための媒体である。導入遺伝子を発現している人間性IPSCは、6時間後に取得できます。抗生物質の選択は、24時間後に適用され、安定したトランスジェニック系統は、1週間以内に表示されます。我々のプロトコルはこれらの細胞の多能性を変えることなく、人間のIPSC行するための堅牢で再現性がある。

プロトコル

我々のプロトコルはGeneJuice（EMD）とAMAXA nuclefector装置を用いてヒトの性IPSCのクレオを用いてヒトの性IPSCをトランスフェクトするためのプロトコルが続くフィーダーフリー培養に人間性IPSCを適応させる方法で始まります。

注：以下の手順は、無菌層流フード内で実行されます。すべてのメディアおよびソリューションは、37℃以上、特に断らない限り起動する前に室温に戻しています。

1。フィーダーフリーシステムに人間性IPSCの確立

以前にフィーダー細胞上で維持人間性IPSCは、分割Geltrexコーティングされた皿に移して、フィーダーフリートランスフェクションの前に2つの通路を維持することができる。

1. 4℃で一晩Geltrexを解凍Geltrexコーティングを準備するには、冷たいDMEM中で解凍Geltrex 1:50に希釈します。優しくソリューションを混ぜる。

注：Geltrex、マトリゲルなどが基底膜MATRの可溶性形態であるixはネズミEngelbreth·ホルム·スウォーム（EHS）腫瘍細胞から精製した。あるいは、マトリゲルをフィーダーフリー人間IPSC文化を確立するために細胞外マトリックスとして使用することができます。

2. Geltrex溶液（35-mmの1ミリリットルウェル）で培養ウェルの表面全体を覆​​う。 37℃Geltrex付きコート井戸℃で1時間インキュベーター。
3. ほとんどの細胞が剥離し始めるまで通路人間性IPSCに、ウェル当たりaccutaseの1ミリリットルを加え、1分間37℃でインキュベートする。

ほとんどの細胞が剥離し始めるまで通路人間性IPSCに、ウェル当たりaccutaseの1ミリリットルを加え、1分間37℃でインキュベートする。

4. 細胞がゆっくりと渦プレートを10から15にガラスビーズを追加します。ノックアウトDMEM / F12の2ミリリットルを加え、穏やかにひいて粉にする。 10 mlの遠心チューブに細胞懸濁液を移す。
5. 室温で3分間800rpmで細胞をスピン。
6. 人間IPSCペレットはそのままにして、チューブから上清を吸引します。優しくチューブをフリック細胞ペレットを分散させる。
7. コー​​ティングされた井戸からGeltrexを削除します。
8. 優しくSTEMPROの適切な音量で人間IPSCペレットを再懸濁します。 ）増殖速度に応じて、フィーダーのウェル間で配布しています。人間性IPSCは、1:2〜1:6の分割比で継代することができる。
9. 慎重に所定の位置5％CO ₂インキュベーター、慎重にスワールプレートのウェルを越えた細胞の均一な分布を確実にするために。
10. 細胞まで、毎日のフィード細胞は（細胞が80％コンフルエントに達したとき）を再度分割する準備が整いました。
11. 1:2の分割比で新しいGeltrexコーティングされた井戸の上に通路人間性IPSC（ステップ1.3から1.9）。小さなコロニーが形成され、よくGeltrexコーティングされたトランスフェクションの前に均等に分配されるべきである。

2。 GeneJuiceと人間性IPSCのトランスフェクション

細胞（6ウェルプレート上で増殖）最適なトランスフェクション効率を達成するために、トランスフェクションの日に合流、約40〜50％であるべきである。それは翌日まで細胞培地を変更する必要はありません。

1. 滅菌済み1.5mlエッペンドルフチュー​​ブに100μlのKO-DMEM/F12を準備します。 27μlのGeneJuiceトランスフェクション試薬を追加します。よく混ぜる。 5分間室温でインキュベートする。
2. 4μgのプラスミドDNAを追加。 15分間室温でチューブをインキュベートする。プラスミドの選択が最適なトランスフェクション効率のために重要です。我々はプロモーター^{5（pCAG-EGFP）}をCAGによって駆動増強された緑色蛍光タンパク質（EGFP）を有するプラスミドを使用しています。 CAGプロモーターと人間性IPSCにおける転写活性であり、したがって、これらの細胞に導入遺伝子の発現を駆動するために使用することができる強力なプロモーターである。我々の手では、プラスミドの線形化は、トランスフェクション効率に影響を与えていないようでした。
3. 細胞やスワールプレートにGeneJuice-DNA混合物を追加します。十分に人間性IPSCでトランスフェクション混合物の接触を高めるために5分間1200rpmで（ 'spinoculation'メソッド）でプレートを回転させる。
4. 37＆で細胞をインキュベート度、Cで一晩。
5. 翌日、トランスフェクション効率を監視する。
6. 安定したトランスフェクションのために、新鮮なSTEMPROで翌日培地を変更してください。 48時間 - 24の後に適切な抗菌薬の選択を追加します。

3。人間性IPSCのヌクレオ

フィーダまたはGeltrex上に成長させた人間性IPSCはクレオのために使用することができます。しかし、我々は強く高い細胞生存率と回復を確実にするために、マウス胚線維芽細胞（MEF）またはヒト包皮線維芽細胞（HFF）のフィーダにnucleofected人間性IPSCを再播種をお勧めします。少なくとも2万個の細胞は、ヌクレオ以下の高い細胞生存率を達成するために使用されるべきである。

1. 一夜フィーダー細胞を用いてヒトIPSCノックアウト血清代替（KOSR）メディアをインキュベートすることにより、フィーダー細胞馴化培地（CM）を準備します。 CMを24時間ごとに収集します。

注：フィーダー層を製造するために使用される任意のマウス系統（例えば、BLK6、CF1とMF1など）foを使用するのに適していますrはCMを作る。

2. クレオの日には、少なくとも1時間、10μMROCK阻害剤との人間性IPSCを事前に処理します。
3. 滅菌済み1.5mlエッペンドルフチュー​​ブにヒト幹細胞ヌクレオ液の82μlを準備します。 18μlのサプリメント（1）を加える。よく混ぜる。 5分間37℃で溶液をインキュベートする。
4. プリ暖かいフィーダー細胞馴化培地（CM）および0.25％トリプシン/ EDTAを37℃ボンネットの下に、prelabel 1滅菌15 mlコニカルチューブ。
5. 慎重nucleofectedする人間IPSC文化からメディアを削除します。優しくウェル当たり2ミリリットル1Xリン酸緩衝液（PBS）で細胞を洗浄する。 PBSを吸引除去。ウェルあたりの0.25％トリプシンを1mlを加える。 3分37℃で細胞をインキュベートします。
6. そっと千ミリリットルピペットチップを用いて細胞をひいて粉にする。すべての人間性IPSCが完全に切り離されていることを確認するために井戸の底を洗います。ラベルの付いた15mlコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。

注：単一のcにトリプシン処理ellsは厳密に避けるべきである。細胞の約三つ子から成っていた細胞が唯一の細胞の小さな塊に外れなければなりません。細胞の小さな塊（セルトリプル）は、細胞のその後の取扱い中に単細胞に解離することになります。

7. トリプシンを不活性化するために9ミリリットルMEFのメディアを追加します。 3分間800rpmで細胞をスピン。注意深く上清を吸引し、細胞ペレットをそのままにしておく。
8. ステップ3.3からヒト幹細胞ヌクレオソリューションの温めておいた100μlの細胞を再懸濁する。
9. 1ミリリットルピペットチップを用いてヌクレオキュベットにセルを転送します。
10. キュベット内の細胞懸濁液にプラスミドDNA4μgのを追加します。穏やかな旋回により細胞とDNAを混ぜます。ボンネットの表面に二回キュベットをタップします。
11. ヌクレオホルダーにキュベットを挿入します。プログラムは、B-016を使用しています。ボタンXを押すことによって、細胞をNucleofect

< クレオプロセスがあるときのcomplet>が表示されますED（通常は1〜5秒しかかかりません）。他のヌク​​レオプログラムの使用（-023-033とU-023）は、人間性IPSCからEGFP陽性細胞の10％未満が得られた。

12. 提供されるパスツールプラスチック製のピペットを使用してキュベットからnucleofectedセルを取得。滅菌済み1.5mlエッペンドルフチュー​​ブに温めておいたCMと、ROCK阻害剤でそれらを再懸濁することにより細胞を回収する。細胞が回復するように10分間37℃で細胞をインキュベートします。
13. 1ミリリットルピペットチップを用いてフィーダー層上に滴下転送細胞。 37℃で一晩細胞をインキュベートします。
14. 翌日、トランスフェクション効率を監視する。に安定して導入遺伝子を発現するトランスジェニック人間性IPSCの安定したクローンを導出し、CMとROCK阻害剤で翌日培地を変更してください。 48時間 - 24の後に適切な抗菌薬の選択を追加します。

4。代表的な結果：

図1。pCAG-EGFPでトランスフェRiv1人間性IPSCの顕微鏡写真。 （A）のEGFP発現細胞がRiv1 Geltrex 12時間トランスフェクション後にGeneJuiceを使用してトランスフェクションした。 Riv1人間性IPSCのコロニーは、B-016（B）と-023（C）のプログラムを使用してヌクレオ以下フィーダー上で平板培養し、形成された。 （D）はユビキタスeGFP発現で安定EGFP発現人間IPSCコロニーがGeneJuice由来。 （E）を安定的にトランスフェクトRiv1人間性IPSCは、胚様体の分化過程で恒常eGFP発現を保持した。

ディスカッション

顕著な毒性作用と細胞死せずに人間性IPSCに導入遺伝子を導入するための、シンプルで堅牢で再現性の高い技術で提案されたプロトコルの結果。人間性IPSCは、多数の小さなコロニーで最適なトランスフェクション効率を確保するために（1:2）は、細胞の小さな塊（5-10セル）に継代し、高密度でGeltrex上にめっきされるべきである。分化および細胞死を起こしやすい人間IPSCの行では、人間性IPSCの数が多い（最大4×10 ⁶細胞）を単ヌクレオ実験に使用されるべきである。一過性トランスフェクションアッセイは、1日以内に導入遺伝子を発現している人間性IPSCの大きい数字を生成します。安定にトランスフェクトされたIPSCのクローンは、通常7日以内に表示され、これらのトランスジェニックコロニーは3週間以内に取りに行く準備ができているはずです。ここで説明するCAGプロモーターの使用は、EGFPレポーターのユビキタスな発現を確実にします。このような改善の下では、我々のプロトコルは、過剰発現、cを含む、他のアプリケーションに供給することができますonditional誘導、系統特異的レポーターラインの導出、shRNAまたはsiRNAノックダウン、遺伝子ターゲティングと相同組換え。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	注釈
EDTAを0.25％トリプシン	インビトロジェン	25200056
2 - メルカプトエタノール	インビトロジェン	21985-023
3ミリのガラスビーズ	フィッシャー·サイエンティフィック	11-312A	ガラスビーズは、一晩塩酸（HCl）で洗浄し、水酸化ナトリウム（NaOH）と蒸留水で洗い流し、使用前にオートクレーブ滅菌する必要があります。
Accutase細胞解離試薬	インビトロジェン	A11105-01
塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）	インビトロジェン	PHG0263
DMEM（高グルコース）	ロンザ	12から741、F
ウシ胎仔血清	インビトロジェン	16000044
Geltrex	インビトロジェン	12760013	成長因子低減
GeneJuiceトランスフェクション試薬	EMD Biosciences社	70967
グルタマックス-I（100X）	インビトロジェン	35050061	L-グルタミン（Invitrogen社、25030081）も代わりに使用することができます。
人間IPSC KOSRメディア			500ミリリットルヒトESメディアは390ミリリットルノックアウトDMEM / F12、100ミリリットルのノックアウト血清代替、5ミリリットルグルタマックス-I（100X）、5ミリリットルNEAA（100X）、500μlの2 - メルカプトエタノール（55ミリメートル）で構成され、10 ng / mlのbFGFを補っ。
ノックアウトDMEM/F12	インビトロジェン	12660-012
ノックアウト血清代替（KOSR）	インビトロジェン	10828-028
マウス胚性線維芽細胞培地			MEFのメディアは、90％のFBS、1X NEAA、1Xグルタマックス-IとDMEM中1Xピルビン酸ナトリウム（高グルコース）で構成されています
非必須アミノ酸、NEAA？（100X）	インビトロジェン	11140050
ヒト幹細胞ヌクレオ液1サプリメントで	ロンザ	VAPH-5012
リン酸塩は、Ca 2 +およびMg 2せずに緩衝生理食塩水+	インビトロジェン	10010023
ピルビン酸ナトリウム（100X）	インビトロジェン	11360070
STEMPRO培地キット	インビトロジェン	A1000701	500ミリリットルSTEMPROメディアは454ミリリットルノックで構成されていますDMEM / F12、10ミリリットルSTEMPRO無血清増殖サプリメント（50X）、5ミリリットルグルタマックス-I（100X）、5ミリリットルNEAA（100X）、36 mlのBSA（ウシ血清アルブミン、25％）、909μlの2 - メルカプトエタノール（55mmの外）および10 ng / mlのbFGFを補った。