細胞ネットワークの作成のためのプラズマのリソグラフィ表面パターニング

要約

汎用性の高いプラズマのリソグラフィ技術は、細胞付着を導くための安定した表面のパターンを生成するために開発されました。この手法は、自然の組織を模倣する、いくつかの、異なる細胞タイプを研究するために使用されているものを含め、携帯ネットワークを作成するために適用することができます。

要約

マイクロおよびナノスケールの分解能で細胞の微小環境の体系的な操作は、しばしば種々の細胞および分子の現象を解読するために必要です。この要件に対処するために、我々は100nmからミリメートルまでのフィーチャサイズでパターン化表面を作成することにより、細胞の微小環境を操作するためにプラズマのリソグラフィ技術を開発した。この技法の目的は、制御された方法で、個々の細胞だけでなく、細胞とそれらの相互作用のグループの行動を研究できるようにすることです。

このプラズマのリソグラフィ法は、物理的な金型と低温プラズマの接触を遮蔽による基板上の表面化学の選択的修飾に基づいています。この選択的なシールドは、細胞接着と運動を導くことができる化学物質のパターンを残します。このパターン、または表面のテンプレートは、その後の構造自然界に見られることを模倣し、実験調査のための制御可能な環境を作り出すことができる細胞のネットワークを作成するために使用することができます。それは生体適合性の方法で透明な高分子基板上に安定した表面のパターンを生成するように技術はよく生物学的現象を研究するのに適しています。数週間から数カ月の間の最後と表面のパターンは、このようにこのような分化や適応などの長期的な細胞プロセス、の研究を容易に長い期間のための細胞との相互作用を導くことができる。表面の改質は、自然の中で主に化学物質であり、したがって結果の解釈のための地形や物理的干渉を導入していません。また、パターン形成を達成するためにどんな過酷なまたは有害物質を含んでおり、組織培養のために互換性がありますされません。さらに、それは理想的ですし、広く生物学的用途で使用されているそれらのプロパティを調整することができることによるポリマー基板、様々なタイプを変更するために適用することができます。このような移行、接着、またはバインディングなど、特定のプロセスの分離は、マルチセルレベルにシングルで離散的な、明確な観測を可能にするように達成可能な解像度は、また有益である。

このメソッドは、マイグレーション、シグナリング、組織形成、および動作を伴う調査のために、異なる細胞タイプの多様なネットワークを形成するために採用されており、神経細胞の相互作用は、ネットワークにarraigned。

プロトコル

1。パターニングに使用される金型の作成

1. パターンの概念設計。パターンは、コントロール細胞接触を細胞のネットワークを形成する細胞を単離、自然な構造を模倣、またはその他の細胞接着及び配置を導くために用意されて作成されます。
2. フォトマスクのパターンと創造のコンピュータ支援設計またはCADベースの作成。所望のパターンは、AutoCADなどのCADソフトウェアで設計されているし、フォトマスクを製造するために外部の会社に送信されます。
3. マスターパターンを生成するためにフォトリソグラフィー。ガラススライドのいずれかに抵抗薄い正または作成される構造体のサイズに応じて、レジスト厚さの負でパターン化されています。ガラスのスライドは、低コストであることの彼らの利益のために使用されるシリコンウェーハよりも強いと壊れたときに限り埃を生産されていません。また、このような回折格子のような他の便利な構造は、マスターのパターンとして使用することができます。
4. パターン化されたスライドは、パターン化されていないスライドのスタックに付加されます。すべてのステップは、粉塵を最小限に抑えるためにクリーンな流フード内で実行されます。
5. マスター金型の作成。スライドのスタックよりも少し大きいアルミホイルの容器は、初期の金型を作成するためにフォトリソグラフィによりパターン化表面の上に注がれているポリジメチルシロキサンを30g（PDMS）を保持するために作成されます。 PDMSを脱気し、1〜2日間硬化させています。
6. 一度硬化PDMSは、マスターパターンから剥離し、次のステップのための金型を形成する。
7. 6 2部のエポキシ（gのDevConの＃14310（6 g）を1分間混合し、マスター金型に流し込み、脱気し、硬化させている。エポキシ樹脂を脱気は、多くの気泡破壊のサイクルを使用して（<8分）をすばやく行う必要がありますとその前にのみ薄層を用いたエポキシセットと気泡除去は、気泡を除去することは不可能になります。使用さ6グラムは、迅速な気泡除去を容易に薄層を生成する。
8. 一時間後に、2つの部分のエポキシは、部分的に硬化され、より多くのエポキシは後半の手順で処理するeaserである厚い構造を生成するために脱ガスすることなく上に追加することができます。エポキシは、その後1〜2日間硬化させています。
9. 一度硬化、エポキシは、PDMSのマスターモールドとテープが容器を形成するエポキシモールドの周りにラップされてから削除されます。作業金型は、その後、エポキシモールドの上にPDMSを流し込みPDMSを脱気し、1〜2日間硬化させることによって作成されます。
10. 一度硬化、作業金型は、エポキシ樹脂から剥離し、清浄度を維持するために格納されています。

2。セルの指導のための金型表面のパターニング

1. 作業金型の小さなセクションを切り出し、ポリスチレンペトリ皿の上に配置されます。これらの型のセクションの位置が表示されています。
2. 三脚は、小さなセクションから形成され、作業をカビやペトリ皿の表面との間のコンフォーマル接触を確実にするために重み付けされます。良い配置は、皿の底を見ることで観察することができます。
3. アセンブリは、プラズマチャンバ内に配置されます。プラズマ処理は、空気プラズマを用いて10分間29.6 W（最大電力）で150 Paに開始し、継続しています。
4. プラズマ処理した後、金型と体重の罪状認否が削除されます。
5. ペトリ皿は、バイオセーフティキャビネット内の殺菌の10分間UV光下に置き、細胞を接種するまでそこに格納されています。

3。細胞と表面のシーディング

1. SH - SY5Y CRL - 2266ヒト神経芽細胞腫または他の細胞は、細胞型のための標準プロトコルを用いて培養されています。
2. SH - SY5Yの合流点は、CRL - 2266ヒト神経芽細胞腫細胞はパターン化された表面に播種する前に視覚的に測定されます。
3. 標準のセル分割は、それらのペトリ皿の表面から細胞を除去するために行われる。
4. 細胞、一度フリーフロートは、パターン化表面に置かれたときに所望の合流点を達成するために希釈された後、パターニングされたペトリ皿の表面に播種されています。
5. 細胞が定着し、表面への接続を許可されています。
6. 細胞がプラズマによって作成されたパターンに組み立てながら、パターニングされたペトリ皿は、数日間に数時間インキュベートする。
7. 培養神経芽細胞、レチノイン酸（10μM）は、ニューロンのような状態に分化する細胞を誘導するために毎日追加されている場合。レチノイン酸の添加は、暗闇の中で行われます。
8. レチノイン酸は、分化が観察されるまで、数日間毎日追加されている。
9. メディアは、3〜4日ごとに置換されます。

4。観測と解析

1. 生細胞またはビデオの定期的な画像が時間をかけて細胞の挙動を観察するために取られる。ライブ画像の場合、細胞は37細胞を保持する顕微鏡ステージトップインキュベーター° C、湿度100％、および5％CO ₂で配置されます。細胞はまた、蛍光下で観察するために固定して染色することができます
画像や動画を画像解析システム、測定ごとにインポートされるは、成長率、セルサイズ、移動速度、分化、整列、特定のタンパク質の位置、およびその他を含む実施されています。

5。代表的な結果：

プラズマのリソグラフィ技術を実装するの典型的な結果は、いくつかの任意のまたは自然な構造に似た細胞のパターンの形成である。これは、ニューロンのラインとのネットワークが作成されている図1A - Bに見られる。だけでなく、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）とグリッドを形成するC2C12骨格筋細胞を示す図1c - dは 、に見られるような他の細胞型を使用することができます。ポリ- L -リジンのような材料も、特定の細胞型のや他の用途に添付ファイルを容易にするために、 図1eをパターン化することができます。示すように、ニューロンの場合には、どのように作成されたことは、それらの間の接続を持っている細胞のネットワークです。これは、神経細胞が脳の動作に影響を与える隣接セル間の離散の接続を持っている脳の中で自然発生するものが複製されます。ラボのような構造の作成と、接続の数、位置、周波数やその他の要因は系統的に制御することができます。これらarraignmentsの結果が視覚的に測定することができ、そのような化学的又は電気的刺激などの追加入力は、ネットワークの挙動を調べるために実装することができます。

否定的な結果が生い茂ったまたは不完全なパターンや汚染されたサンプルとなります。不完全または草に覆われたパターンは、細胞の理想的な量のパターンを供給しないというどちらか少なすぎるか多すぎる細胞と基質を播種したために発生します。パターンが正しく設計されていない場合、また、（例えば、線狭すぎる）細胞が添付してそれで正常に成長することができなくなります。プラズマのパターニングにも基板を殺菌しているという事実のために適切な細胞培養のプロトコルに従う場合、これはまれですが汚染されたサンプルの場合には、適切な清浄度は、手順のいずれかの間に維持されなかったであろう。

図1。細胞と蛋白質のパターニング。

ディスカッション

ここで提示細胞の調査の方法は、だけでなく、生物学的構造を模倣してグループ化された細胞の行動と環境要因への単一の細胞応答の両方の調査を促進する自然の中で細胞内な刺激を生成する方法を提供する多細胞ネットワークの複雑なパターンを作成することができます。それはすぐに細胞培養と同じラボで低コストの機器で実行できるので、このメソッドの使用は、シンプルでありながら堅牢です。それは、また強く細胞の区別があります結果の動作の簡単な観察を可能にし、長期的な細胞の挙動の調査を可能に長期間、安定して自然のことです。それは、さらにそれが多くの細胞タイプと互換性があり、任意のパターンを作成できるように、実行する実験の多様な範囲を可能にする。技術の長期安定性は、プラズマによって与え表面機能が表面の一部であり、削除または劣化することができるコーティングまたは他の層ではないという事実に由来する。液体の下で保管した場合は、変更のこのタイプは、数ヶ月のため、そのセルの指導力を保持することができます。

意味のある結果を確保するために必要な実験の最も重要な部分は、最終的に細胞の指針として使用されるマスターパターンを作成することです。このパターンが適切に設計されていない場合は、細胞が適切にパターンに応答しなくなりますし、有用な動作を得られないことがあります。このような線幅、パターン間隔、および他のようなパラメータが大幅に特定のパターンを持つセルの互換性に影響を与えることができ、通常はそのようなパラメータの範囲は、最も適切な設計のための画面への最初のフォトマスク上に作成することができます。

パターニングを行うに関連する他の重要なパラメータは、ホコリのない環境、細胞播種と細胞培養の一般的な無菌性を維持し、金型の作成が含まれています。金型の作成は、PDMSは、エポキシモールドをオフにキャスト繰り返しを可能にするために行われている様々な転送手順によって行うことができる。繰り返し鋳造の下に小さく、高アスペクト比構造を持つモールドをレジストとしては、同じように劣化しないので、エポキシモールドが作成されます。トランスファー成形が適切に行われた場合、寸法および収量には影響しませんが不完全に脱気、不完全硬化、または過度の加熱によりそのように正しく行わ場合は、パターンの泡、粗さや変形が最終結果に影響を与える発生する可能性があります。ほこりが作業PDMSモールドと表面、したがって適切なプラズマ遮蔽と化学のパターン間の適切な接触を妨げることができるようにホコリのない環境を維持することに関連して、金型は、可能な限りクリーンに保つ必要があります。細胞の播種密​​度は、どちらも少なすぎるまたは多すぎる細胞がパターンのエリアに生息することを保証するために最適化されていなければなりませんし、無菌性は、使用されている細胞の細菌および他の汚染を避けるために維持されなければならない。

技術はまた、マイクロ流体、微小電極、および機械的プローブとして他の要素と組み込むことができます。これは、これらの組み合わせの効果を研究に焦点を当てているより良い実験と今後の作業中にさまざまな生理的条件を複製するために細胞に追加の刺激を提供する

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
プラズマクリーナー、真空チャンバ	Harrickプラズマ	PDC - 001
倒立型蛍光および位相差顕微鏡	ニコン	TE2000 - U
顕微鏡ステージトップインキュベーター	AmScope	モデルTCS - 100	適切な大気を供給する筐体を含むように修正
ポリスチレンペトリ皿	VWR	25384-090
ポリジメチルシロキサン（PDMS）	ダウコーニング	Sylgard 184
エポキシ	DevConの	2トン透明エポキシ＃14310
細胞培養培地	様々な		メディアは、セル型の標準処方に従って
レチノイン酸	シグマ	R2625