小説を使用して、脊髄損傷後のマウス後肢の骨の損失の経時的評価、 in vivoで、方法論

要約

成体マウスの大腿骨と脛骨の骨の損失の長手方向の検討は、連続した低線量X線スキャンを使用して、脊髄損傷後実施した。大腿骨の骨量の減少が40日後の傷害まで検出されていないときに脛骨の骨の損失は、試験期間を通じて検出された。

要約

脊髄損傷（SCI）は、しばしば骨折¹のより高い周波数につながる、骨盤と下肢のsublesional地域で骨粗しょう症を伴っている。これらの骨折は、しばしば正常な感覚機能を失っている地域で発生すると、患者は死亡を含む骨折依存病理、リスクが高いです。骨密度（BMD、グラム/ cm ^2）を、骨ミネラル含量（BMC、グラム）の両方でSCI -依存性の損失は機械的な廃用^2、異常な神経細胞のシグナル伝達^3、ホルモンの変化⁴に起因している。 SCI誘発性骨粗しょう症の齧歯類モデルを使用すると、SCIは、次の骨粗しょう症の開発だけでなく^、5月7日新しい治療法（および⁸にレビュー）を生成するためのテスト環境の基礎となるメカニズムに関する貴重な情報を提供することができます。 SCIのマウスモデルは、メカニズム- BAへの還元主義的なアプローチを可能として、非常に興味深いです。ヌルとトランスジェニックマウスを使用することにより、sedの評価。そのようなモデルは、重要なデータを提供している一方で、SCI後の骨損失の程度を決定する上で低侵襲、、信頼性の高い再現性、そして定量化可能な方法の必要性は、診断を向上させるために、特に時間の経過と実験動物の同一コホート内で、まだある、治療方法、および/またはSCI誘発性骨粗しょう症の予防。

げっ歯類で骨密度を測定するための理想的な方法は、X線放射の低水準に（時間の経過に）シーケンシャル、多重露光を可能にするであろう。この研究は、新しい全体動物スキャナ、低エネルギー（1-3 milligray（線量））高解像度、高倍率X線画像を提​​供するために使用できるIVISルミナXR（キャリパーインスツルメンツ）の使用方法について説明しますマウス後肢の骨のSCIを以下の時間をかけて。無傷、年齢をマッチさせたコントロールと比較して有意な骨密度の低下は、後の脊髄切断10日間でマウスの脛骨に見られた（ナイーブ）マウス（13％減少、P <0.0005）。近位大腿骨の密度の低下が40日後の損傷（7％減少、P <0.05）まで検出可能ではなかったしながら遠位大腿骨の骨密度の低下は、10日目後SCIでも検出可能であった。マウスの大腿骨の密度のSCIに依存する損失は、骨密度測定のための二重エネルギーX線吸収法（DXA）、現在の"ゴールドスタンダード"を使用して事後確認された。我々は、IVISルミナXRを使用して40日後SCIでマウスの大腿骨のBMCの12％の損失を検出する。これは、マウスの大腿骨事後30日後SCI ^9日にDXAの分析を使用する以前に報告されたBMCのピカールで13.5％の損失や同僚と比べても遜色。我々の結果は、IVISルミナXRは小説、SCI以下のマウスに後肢の骨密度の長期的、長手方向の測定を行うためのhigh-resolution/high-magnificationの方法を提供することを示唆している。

プロトコル

1。マウス脊髄切断モデル

1. 大人、男性、C57BL6マウス（約20〜25 g）は、ケタミン（200 mg / kg）をとキシラジン（10 mg / kg）の組み合わせを使用して麻酔する。すべての外科手術は無菌条件下で機関、IACUCに承認された手術室で行われます。
2. 一度深く麻酔、バックの毛を電気バリカンを使ってトリミングされます。剃毛背部は70％エタノールに続くヨウ素溶液との最初のスクラブです。
3. 最初の切開の前に、切開する背面の面積は、最初の手術後の痛みを最小限に抑えるための濃度（0.25％、<1ml/kg）で局所麻酔薬（Marcaine）で浸潤されています。
4. 小さなはさみを使用して、小さな開口部がL2の領域付近での皮膚で作られています。この開口部はT2エリアに長手方向に延びる、はさみの同じセットで展開されます。皮膚の縁は、その後ブルドッグクランプの使用を介して離れて開催されます。
5. マイクロシザー構造がその後使用されています胸椎レベル8（T8）で背側脊髄ラミナから筋肉組織をクリアに。クウと^{Wrathall（1998）10}に記載のT8を識別することができます。簡単に言えば、T13はその背棘突起によって識別することができます。 ＃5デュモンのピンセットを使用して、最後の肋骨は触知/識別とT8に戻ってカウントすることができます。一旦クリアされると、骨RongeursはT8で背側椎弓切除を実行するために使用されます。
6. 完全脊髄切断の病変：いったん脊髄を滅菌マイクロシザーの追加セットが手術用顕微鏡下で脊髄の長軸に垂直な平面で脊髄を切断するために使用される、T8で公開されている。我々は穏やかに病変の完全性を確認するために脊髄の一方の極を持ち上げるために＃5デュモンの鉗子を使用してください。
7. 脊髄切断に続いて、滅菌生理食塩水に浸した滅菌gelfoamの小片、（0.9％）を慎重に止血を促進するために病変空洞内に配置されます。
8. gelfoamの追加部分は、露出したスピンの上に配置されアルコード。皮膚を無菌、ステンレス製の外科用ステープルで閉じられます。被験者は、その後、自分のホームケージに戻した寝具の材料の吸引を防止するためにペーパータオルの上に置き、約12時間の期間のための加熱パッドで暖めています。被験者はまた、早期に回復中にケージの床の上にハイドロパック（ClearH2O）と食品ペレットと提供されています。負傷した被験者は自分のホームケージでの食品/水は、一度麻酔から回復にアクセスすることができます。
9. すべての負傷者の被験者は、試験期間（40日）のためのクレーデの手動方法の変更を使用して1日2回のマニュアル膀胱の避難を（約12時間間隔で）受け取る。
10. 負傷したマウスは、の期間のための外科手術後の痛みを制御するためにも、アヘンのブプレノルフィンの水和を維持するために三日間のための0.9％生理食塩水（0.5 CC）の毎日二度腹腔内注射で提供される、1日2回注射（0.05 mg / kg体重）です。 5日間。動物はサインoを示す場合痛みの兆候（処理不自由、背を丸め身長、新郎への障害、発声が）解決するまで、最初の5日間の期間の後にfの痛みは、彼らが毎日追加ブプレノルフィン（0.05 mg / kg）を受け取ることになります。

2。脊髄- transectedマウスの同一コホートでIVISルミナXRを使用して、骨密度の長期的評価

1. 10日目後SCIで始まり、40日まで10日間の間隔で継続し、我々は、生活の中で右と左大腿骨と脛骨を評価した麻酔の被験者（切除SCIと無傷年齢をマッチさせた対照）。
2. スキャンの日に、被験者はキャ​​リパーIVISルミナXRが収容される部屋に機関のビバリウムの領域から彼らのホームケージに移した。すべての被験者は、以前にSCIの配信で使用したのと同じケタミン/キシラジンカクテルを使用して麻酔する。このカクテルは、1〜1.5時間の期間のために麻酔の状態を保証します。scannの期間中、十分なここに示す操作手順。
3. 調査官は、ルミナXRのデバイスを初期化して内部カメラが正常に動作温度（-90 ° C）（〜10分）に到達することができます。
4. かつて麻酔、被験者（切除または制御）が静かにルミナXR内で動物のプラットフォーム上に配置されます。高倍率のレンズは、大腿骨と脛骨の領域（高倍率レンズとビュー2.4X2.4cmのフィールド）の両方にフォーカスを可能にするデバイスに挿入されます。対象が不適切に視野の外に配置されている場合、ドアが開かれ、左または右後肢を中心にされるまで（後肢の適切な配置のための図2aを参照）、再配置対象。
5. 一度適切に配置、X線の機能を実行することができる。 動物に適したエネルギーのドロップダウンリストから選択します（リビング主題、35 Kv値100uA、X線フィルタ処理）
6. 動物が正しい位置にあれば、チェックイン時に、マーキングX線によるX線機能を有効にするコントロールパネルは。X線画像を取得 。全体の大腿骨と脛骨が（図2bを参照）表示されることを確認します。生の画像データは、自動的にハードドライブに保存されます。代表的。TIFFファイルも保存されます。マウスは、そのホームケージに戻され、捜査官の監視の下に回復するために許可されています。プロセスは、次のマウスを使って繰り返されます。
   注：リビングイメージのソフトウェアは、デフォルトで変換されたX線画像が表示されます。生のX線画像を表示するには、修正/フィルタリングツールのX線吸収の横にチェックマークを外します。 X線のデータは吸収のために修正されているときには、測定のROIの信号強度を比較することによって相対的な骨密度を評価することができます。 ROIの強度が増加する組織の密度が増加する。

3。 IVIS X線スキャンの画像解析

1. リビングイメージのアイコンをダブルクリックしてソフトウェアを開きます。
2. クリックして、X線像をロードする [参照]ボタン。表示されるダイアログボックスで、関心のフォルダを選択し、[OK]をクリックします。リビングイメージのブラウザでは、選択したユーザーIDとともにデータ、ラベル情報、およびカメラの設定情報が表示されます。データを開くには、以下のいずれかの操作を行います：データ行をダブルクリックし、データの名前を右クリックし、ショートカットメニューの[ 読み込み]を選択し、データの行を選択して、Load をクリックするか、サムネイル ​​をダブルクリックします。画像とツールパレットが表示されます。開いているデータは、ブラウザの緑色で強調表示されます。
3. ツールパレットで、ROIツールをクリックしてください。 ROIツールで、Typeドロップダウンリストから選択測定ROI。この実験で用いる3のROIをロードするには、 正方形のアイコンをクリックして、3乗をロードする。
4. 定規を使用して、大腿骨の長さを測定する。総大腿骨の長さの1 / 8 ^番目になる正方形の二つの長さを調整します。。総大腿骨の長さを1/24thされるこれら2つの四角形の幅を調整します。あなたの定規、測定1月8日大腿骨の近位端からの距離の^目 、そしてそれは大腿骨の中央に配置されるように正方形を位置づけると。それは大腿骨の遠位端（図3）から総大腿骨の長さの4分の1にあるように、2番目の四角を位置づける。これらのROIのは、近位および遠位の両方大腿骨領域を測定するために使用することができます。
5. 定規を用いて、脛骨の長さを測定する。合計脛骨の長さの1 / 8 ^番目であることが第三平方の長さを調整します。合計脛骨長さの1 / ³⁰日に幅を調整します。正方形を位置づけるように中心に、1 / 8 ^番目の脛骨の近位端（図3参照）から脛骨の距離の合計の長されている。
6. 測定アイコン（鉛筆と定規）をクリックしてください。 ROIの強度測定は、X線画像に表示され、ROIの測定値のテーブルが表示されます。このテーブルtをエクスポートする。csvファイルとして任意の場所をO。これは、Excelを使用してテーブルを開くことができます。
7. 保存した画像のすべてでこれを繰り返します。
8. あるExcelシート上のすべてのデータを統合する。統計的有意性は、Microsoft ExcelまたはSigmaPlotの11.0ソフトウェア（SYSTATのソフトウェア）のいずれかを使用して学生のt -テストにより決定した。

4。骨密度の事後分析：

1. IVISルミナXR内で最終的な縦のX線スキャンの買収に続いて、マウスはその後Beuthanasia（75mgのペントバルビタール/ kg）で深く麻酔する。一度深い麻酔が達成されている、マウスtranscardially氷冷リン酸緩衝血を抜くためにheparain（40 mg /リットル）と生理食塩水で灌流されています。
2. いったん放血、消費税の両方大腿骨。これは密度の測定値^11を影響を与えることが示されているために、できるだけ多くの軟組織を除去するために特別な注意を払ってください。で水に浸したガーゼや店舗で大腿骨を包みます- 20Cは、それらを分析する準備が整うまで。

5。 Hologic QDR 4000骨密度測定装置を用いてDXA分析

1. 融解のガーゼに浸して大腿骨と骨密度測定装置のスイートへの転送。
2. 製造業者のプロトコルに従って装置のキャリブレーション、BMCとBMD値が許容範囲内であることを確認してください。
3. マシンの真鍮のコリメータを配置。これにより、ユーザーは特定のターゲットに集中するX線ビームの大きさと角度を制限することができます。
4. 沈める水（左顆、ベッドに大腿骨と平行）、とだけレーザーの右側に位置してで満たされたペトリ皿に解凍した大腿骨。
5. スキャンしようとしている大腿骨のための伝記 （動物の識別情報、治療、等を含むわかりやすいタイトルを）入力します。
6. 選択メニューからスキャンを入力し、[regionA高解像度を選択します。あなたのスキャンパラメータを示している：0.01インチ行間隔と0.00499インチ点の分解能で、2 × 0.7489インチの領域をスキャンする。
   注意：これは進行中にスキャンを監視する。 X線ビームラスターはサンプルをスキャンするように、完全に骨のサ​​ンプルをカバーするためにチャンバ内に十分な水があることを確認するために監視する。
7. 分析の選択]メニューの下に分析入力してください。 ROIとして全体の大腿骨を強調するためにプロンプ​​トに従います。レポートページは、計算されたBMC（グラム）とBMD（GMS / cm ^2）をしてくるだろう。
8. 残りの大腿骨を分析するためにこれらのステップを繰り返します。
9. あるExcelシート上にすべてのデータを統合し、（t -検定）統計分析を行います。

6。代表的な結果：

ナイーブなマウスと比較して、脊髄損傷後のマウスの脛骨と大腿骨の相対的な骨密度の低下は、上記の方法を用いて検出可能である。後の骨密度の検出可能な大幅な低下を起こすことがあります40日で最大15％の骨密度の低下（P <0.0005、図4）とわずか10日間（12％、P <0.0005）、。大腿骨の骨密度の低下は、40日後の傷害（7％減少、P <0.05、図5）で観察された。これらの結果は、脊髄損傷後の骨密度変化の長期的観察のための非侵襲的なX線イメージングを使用するための証拠を提供する。

現在利用可能なものへのこの方法の有効性を比較するために、我々は40日DXAイメージングを使用して負傷した後、これらのマウスの摘出した大腿骨を分析した。データ出力の表現は、図6で見ることができます。我々は（12％減少、P <0.05、図7）ナイーブと比較すると骨ミネラル含量の著しい損失がSCIのマウスではないことがわかった。骨密度は有意な変化が、同様の傾向（図8）に従うでしたしませんでした。これらの結果は、文学に見られるものと類似しています。ピカードらはBMCで13.5％減少した（P <0.001）が、有意なDECRを観察BMD（ピカード2008）に容易になります。

図1実験のタイムライン。

図2左後肢の代表者向き：。）写真とb）のX線。

図3。近位大腿骨と脛骨の地域内でのROIの大きさと向き。

年齢をマッチさせたnaives（N = 5）に比べて30〜40日負傷後の脛骨近位部10、20、（N = 5）におけるSCI後の図4。骨密度の低下。エラーバーはSEMを表す、** P <0.005、*** P <0.0005。

図5。骨密度の損失、20、（N = 5）。エラーバーはSEMを表す。* P <0.05。

図6。10、20、30、40日負傷後の遠位大腿骨におけるSCI後の骨密度の低下（N = 5）年齢をマッチさナイーブなコントロールと比較して（n = 5）の。エラーバーはSEMを表す。* P <0.01〜0.05、** P <0.001〜0.01、*** P <0.0001から0.001; **** P <0.0001。

図7。BMCとBMDの出力を示すDXAデータの代表的なイメージ。

図8。DXAのSCIマウスの大腿骨の骨塩量の分析（グラム）40日後の傷害（N = 5）対年齢をマッチさせたnaives（N = 5）。エラーバーはSEMを表す。* P <0.05。

図9。DXAのSCIマウスの大腿骨の骨密度の分析（mg / cm ^2）を40日後の傷害（N = 5）対年齢をマッチさせたnaives（N = 5）。有意な差は、エラーバーはSEMを示す。

ディスカッション

この研究では、キャリパーIVISルミナXRイメージングシステムを用いて、マウスのシングルコホート内で、縦方向に（脛骨と大腿骨）個々の骨の中で密度の変化を評価するための新たな、非侵襲的方法を提示。 SCIは、年齢をマッチさせた、無傷、対照マウスと比較して40日の検定の期間にわたって脊髄- transectedマウスの単一のコホート内研究大腿骨と脛骨の両方で骨密度の減少を作り出した。大腿骨の我々の結果は、キャリパーインスツルメンツIVISルミナXRのアプリケーションは、骨量の減少にSCIの長期的かつ進歩的な影響を評価するために敏感な測定ツールとなり得ることを示唆し、DXAを使用して、事後、確認された。

このシステムを用いて研究者に一つの潜在的な利点は、長手方向にSCIを以下の動物の後肢の骨の病理学的変化の開発を追跡する機能です。長期間にわたって、単一のコホートを評価する能力は、STが提供さの点で研究者に栄の利点：動物の購入や長期ケアに関連付けられている1）コスト。代わりに、時間依存性の変化を評価するために、特定の時点で屠殺する必要のある動物の多数を必要とする研究から、これらの病理学的成果は、同じ期間、2以上の同一コホート内で追跡することができる）の変動：に加えて、コントロールコホートとの比較は、負傷した被験者の単一のコホート内で生成された成果を評価し、研究の範囲全体に同じ動物のための時間のポイントの間で比較することができます。もう一度、両方のイントラ動物変動だけでなく、大規模の必要性を減らす実験対象のコホート。

キャリパーIVISルミナXRは、SCI誘発性骨粗しょう症の開発に関する重要な長手方向の情報をご提供している間、考慮すべき制限があります：1）このプラットフォームは、私たちは、高分解能X線datを生成することができましたしながらSCIの後のマウスの後肢の骨で、そのユーティリティは、マウスなどの小型げっ歯類に限定される場合があります。ルミナXR内で許容される最大の主題の高さは2.8 cmです。その高さは上記のものは正常にルミナXRのX線成分を用いて画像化することができます。私たちの手で、これは200〜250グラムの重量でラットを研究する我々の能力を妨げている。それは、この重量の範囲や、ハムスターや砂ネズミのような他のげっ歯類の下に画像のラットへの可能性かもしれませんが、これはPIによる追加テストが必要になります。 2）ジョイント向き。それは、調査員が慎重にイメージングセッション間の正常な比較を可能にする容易に再現可能な方向に手足を手配することが重要です。四肢の配置の標準化は、調査員が保存され、被験者と時間の両方に適用できる標準化されたROIの生成および適用できるようになります。

全体的に、我々は、IVISルミナXRがモデル化するために使用する優れたプラットフォームを提供していると確信してマウスのSCI -依存性の骨粗しょう症の発症。 1）より、これらの変更は時間をかけて安定させるかどうかを判断する）SCI後の骨の損失および脱塩、2の時間的性質を理解する、3）の可用性と、探索：同じマウスのコホート内で縦方向に骨の損失を研究する能力は、私たちができるようになりますトランスジェニックとヌルのマウスラインの両方が、恐らく最も重要な利点は、これらの病理学的還元主義的に変化、および4の分子メカニズム）を研究する能力、どちらかの初期段階での骨粗しょう症の発症を予防するために設計された新たな介入をテストを開始傷害の、または、骨粗しょう症はすでに開発された後、このような変更を逆にする。最後に、ルミナXRは、優れたX線イメージングの可能性を提供することに加えて、また生きている動物の両方で生物発光と蛍光シグナルを研究するために使用することができます。一つは、簡単にMULを見て、このシステム内で提供される他のモダリティを組み込む想像できるSCIまたは他の病気のプロセスに続いて機械的に骨のダイナミクスを決定する要因のtitude骨粗しょう症の結果で​​ある。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
Beuthanasia	バトラーシャイン動物 健康	001848
Ketathesia（ケタミン 塩酸塩）	バトラーシャイン動物 健康	023061
キシラジン	バトラーシャイン動物 健康	037849
Bupivicaine	バトラーシャイン動物 健康	021801
Gelfoam; 7MM	フィッシャーサイエンティフィック	NC0085178	推進するために 時の止血 手術
IVISルミナXR	キャリパーライフサイエンス	135400
ZFOV、2.5 cmのフィールド ビューレンズ	キャリパーライフサイエンス	127285	絶対必要 への高生成 倍率X線 骨の画像 構造は
QDR骨 密度計	Hologic		モデルは使用されなく 生産の