RNAiは、Necromenic虫にマイクロインジェクションによる遺伝子ノックダウンとトランスジェネシスを媒介 Pristionchus pacificus</em

要約

RNAiは、特定のmRNAの転写産物が1〜2ノックダウンできますが、モデル生物において、遺伝子導入は遺伝子の機能を操作することができます。このプロトコルは、necromenic線虫に安定的に伝送されるDNAと一時的な二本鎖RNAを導入するために必要な手法を例示することを目指して Pristionchus pacificus、進化の発達、および行動生物学の研究のため。

要約

それは、RNA干渉と安定した遺伝子導入による遺伝子機能と発現解析-深さで、さらに、完全に配列のゲノムを取得し、特定の解剖学と生物の分子細胞生物学のために多くの種に限られている。ために新たなモデル生物にとってますます手頃な価格ですが、例えば、 線虫（Caenorhabditis ^{elegans）3を}含むクラウングループの線虫の外で、非線虫種で安定的に伝送されるトランスジェニック系統は、 糞線虫 ⁴とPristionchus pacificus ⁵の例外を除いて、このもっともらしい門（線虫）で報告されていない。 P.の拡大する役割を容易に開発、進化、そして行動^6-7の研究ではpacificusは 、我々はここにトランスジェニック動物や遺伝子のRNAiによるノックダウンを行うためのマイクロインジェクションを使用する現在の方法を説明します。の生殖腺のような、P.の生殖腺pacificusは syncitialと直接マイクロインジェクションによって提供される卵母細胞にDNAとRNAを組み込むことが可能です。 C.とは異なり、 P.の虫はしかし、安定した導入遺伝子の継承と身体表現pacificusは、ターゲットの導入遺伝子と共射出マーカー⁵の両端に相補的なエンドヌクレアーゼで消化し ​​、自己ゲノムDNAを追加する必要があります。キャリアのゲノムDNAの添加は、 糞線虫 ⁴とCの生殖細胞における遺伝子発現のための要件と同様ですエレガンス 。動物の独自のゲノムDNAの特定の要件がある場合は、それが明らかでないため、P. pacificus相馬は非複雑なマルチコピー遺伝子またはP.でその染色体外配列を黙らせるには非常に効率的です。 pacificusは、有糸分裂時の適切な動原体のアセンブリのためのゲノム配列が必要です。二軍の腹の移行（二子宮の）雌雄同体の生殖腺では、さらに個々のワーム⁸の両方の生殖腺を注入する能力を複雑にしています。我々はまた、ノックダウン、非ローリングF ₁子孫を得るために生殖腺に二本鎖RNA（dsRNA）を注入することにより、優性突然変異体を（ローラー、tu92）にマイクロインジェクションの使用方法を示しています。 C.とは異なり、 虫 、他のほとんどの線虫のように、P. pacificus PS312は、餌と浸すため、dsRNAをsyncitial生殖巣にマイクロインジェクションによって投与されている必要がありますを介して全身性のRNAiを受け入れるではありません。この現在の研究では、PPA - EGL - 4プロモーターを変換するために必要なマイクロインジェクションのプロセスを記述することを望む：：GFP融合レポーターとノックダウン支配的なローラーPRL - 1（tu92）視覚的に有益なプロトコルの変異体。

プロトコル

1。トランスジェネシス：DNA調製

1. 支配的なコインジェクションマーカー：pRL3 [PPA - PRL - 1（tu92）]
   pRL3プラスミドは、視覚的に成功した形質転換事象を識別するための支配的なコインジェクションマーカーです。このプラスミドは、密接にCでSQT - 1コラーゲン遺伝子に関連するPPA - PRL - 1遺伝子の優性突然変異体対立遺伝子（tu92）をコードする虫やワームの本体軸^1,5に沿って時計回りにねじる運動に野生型正弦波運動に変換します。形質転換動物は、C言語で使用されるポピュラーな優性選択マーカーROL - 6（su1006）と非常に似ています過去20年間のエレガンス 。
2. ターゲットレポーター遺伝子：PPA - EGL - 4P：：GFP
   目的の遺伝子をシーケンス^9をコードするGFPに、転写または翻訳後リンクすることができます。本研究では、PPA - EGL - 4promoter：：GFP（EGL - 4、cGMPの依存性プロテインキナーゼ）は使用いた上流に翻訳開始の2 kbのフラグメントは、P.でGFPの発現を付与することができるかどうかを判断するには、d pacificus PS312。このGFPベクターは、変更されたとのGFPコード領域を含んでいます
   イントロンと親切にXiaoyue王とラルフJ.ゾマー（マックスプランク研究所、チュービンゲン、ドイツ、EU）が提供する多目的PPA - RPL - 23の3'UTRターミネーター^5。
3. ゲノムDNA：PS312
   野生型P.の追加pacificus PS312のゲノムDNAは、特にそれらのF ₂後代^〜5トランスジェニックF ₁動物から、安定した導入遺伝子の継承を取得する必要があります。で安定したF ₂トランスジェニック系統で観察されたものに似て：ゲノムDNA二つ導入遺伝子（GFPレポーター：共射出マーカーPRL - 3とPPA - EGL - 4P）との複合体の余分な染色体の配列を形成する場合、それはまだ定かではないC.エレガンス ^3。しかし、要件が同一のcohesiを共有するためにゲノムDNAと導入遺伝子を持っているためオーバーハングをVEは強く宿主細胞は、適切なDNAの伝達（gDNAをシグマG1N10キットを用いて調製した）のために認識できる複雑な染色体外配列の形成を示唆している。
4. DNA消化
   ：GFPベクターDNAと共射出マーカーpRL3とPS312 gDNAのと互換性のある粘着性がオーバーハングを生成する：制限酵素は、PPA - EGL - 4Pを線形化するために使用されます。ボルテックスではない、タップして混ぜる。 37℃で一時間インキュベート℃に

pRL3	4μgの
10xbuffer	10μlの
をPstI（10 U /μL）	4μlの
のdH 2 O	〜
合計：	100μL
PPA - EGL - 4P：：GFP	4μgの
10倍のバッファ	10μlの
をSalI（10 U /μL）	4μlの
のdH 2 O	〜
合計：	100μlの
gDNAをPS312	10μgの
10倍のバッファ	10μlの
pstファイルIおよびSal I（10 U /μL）	μlの8
のdH 2 O	〜
合計：	100μlの

表1。制限酵素消化のための混合物。

5. DNAの沈殿と準備
   1. 消化産物の1:10〜酢酸ナトリウム（3 M NaCOOCH ₃液（pH5.2））と2.5倍の100％エタノールの量を追加し、ペレットを見やすくするためにグリコーゲンの20 ng /μLのを追加。
   2. 4℃で15分間14,000 rpmで遠心する℃、
   3. tippiによって上清をデカントゆっくりとngの遠心分離管逆さにしてから、ティッシュペーパーで、それをタップすると、ペレットがチューブの底隅に安全であることを確認し、エタノールの自由意思。
   4. 75％エタノール1 mlを追加します。
   5. すぐに4℃で5分間、14,000 rpmでスピン℃、
   6. ゆっくりと上下逆に遠沈管を転倒し、ペレットがチューブの底の隅に固定していることを確認し、エタノールの自由な意思ティッシュペーパーで、それをタップして上清をデカントします。
   7. 25から30で5分間14,000 rpmで真空遠心分離で乾燥ペレット° C、乾燥してエタノールの完全にフリーになるまで。
   8. TEまたは滅菌のdH ₂ Oを30μlを加え、℃で混合簡単に前にボルテックスで4℃で一晩おきます。
   9. 表2は、注射のための各精製したDNAから注入混合物を作成する方法について説明します。
   10. -20℃で保存注射用混合物を融解後、かもしれない破片の粒子を取り除くために5分間14,000 rpmでチューブをスピンダウン注射針を詰まらせる。

遺伝物質	濃度
PPA - EGL - 4P：：GFP（SalIで）	> 5 ng /μlに（0.1-10ng/μl）
pRL3（PstIで）	>は1 ng /μL
gDNAをPS312（PstIで+をSalI）	> 60 ng /μLの
のdH 2 O	〜
合計：	30μlの

表2。PPA - PRL - 1注射混合物

2。 RNA干渉：in vitroで二本鎖RNAの合成で

1. 目的の遺伝子を増幅するPCRを使用してください。 RHL091 5' - agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC - 3'（BamHI部位）とRHL092 5' - tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG - 3'（PstIサイト）は、464 bpのゲノム断片を増幅したPPA - PRL - 1（tu92）対立遺伝子を含むpRL3ベクトルからメンター（位置3から466まで）。
2. BamHIおよびPstIでPCR産物を消化。
3. をBamHI / PstIで消化pL4440 RNAiの給餌ベクトル²への断片をライゲーションする。
4. コンピテント細胞に挿入されたベクトルを変換し、アンピシリンLB培地プレート（50μg/ mlの）上に成長する。
5. T7プライマーを用いたPCRにより、正常に挿入ベクトルを選択してください。
6. BLOCK - ITのRNAi合成キット（Invitrogen）を用いて）二本鎖RNA二本鎖RNAを作るためにPRL - 1遺伝子を含むPCR産物を両側にT7を使用してください。
7. > 200 NG /注射用溶液、最大1μg/μLの場合dsRNAの濃度は最高です。
8. -20℃で保存注射用混合物を融解後、注射針を詰まらせることができる破片の粒子を除去するために5分間14,000 rpmでチューブをスピンダウン。

3。マイクロインジェクション：導入遺伝子および/またはdsRNAの注射のためのプロトコル

1. 注射針
   1. 温度：ナリシゲ針プラーを（PC - 10モデル＃）に設定します：
      1. に底のつまみを回して、"第2のヒーター。"
      2. "第2のヒータAdjを。"回しパネルまでのノブは様々な長さのテーパー針の先端のための55.0から60.0 ° Cを読み取ります。
   2. （一度に針を引っ張る）"ステップ1"に戻って一番下のノブを回します。
   3. チャンバー内に針をロードし、それが安全であることを確認してください。
   4. "スタート"ボタン（赤いボタン）を押すと針はすべての重み（これは反対方向に2つの同一の針を作成してください）​​でプルアップすることができます。
   5. 針に蓄積からほこりを防ぐためにプレードウによって所定の位置に固定プラスチック培養プレートでチャンバーとストアからニードルを取り外します。
2. 取付パッド
   1. 1.5 mlの遠心管に、H _{2 O} 1ml中にNoble寒天の0.02 gを追加して2％ノーブル寒天溶液を作る寒天は、4 °年度までのCで保存することができる。
   2. 完全に混和し、> 88℃に設定したヒートブロックに寒天を溶かす
   3. 1 mlのマイクロピペットを用いて、スライドガラスの中央（フィッシャー、12 544 - F）に液体2パーセントNoble寒天のドロップを置きます。
   4. ドロップの上に別のスライドガラスを配置することで平らに。
   5. 五スライドガラスの層があるまで"ドロップステップを"繰り返します。
   6. お互いからスライドガラスをスライドさせて、各ガラススライドを削除します。
   7. 70℃の真空オーブン中でスライドガラス上の寒天パッドを平らに乾かし℃で一晩に4時間（または室温で一晩）。
   8. 将来使用するために複数の注入パッドとストアを行います。
3. 雌雄同体の生殖腺へのマイクロインジェクション

図1。 P.の概略図pacificusの解剖学。明確な有核細胞は、雌の生殖細胞（卵母細胞）であり、灰色の網掛け部分は腸です。唯一の遠位前生殖腺が表示されますが、2つの遠位生殖腺が半ば体の近くに背側に互いに交差に気づく。

図2。マイクロインジェクションの画像。（A）注射針の先端が引っ張らキャピラリー部分の右端のラインにフォーカスされている。それでも鋭いポイントを保持しながら、軽くその辺に針の先端に触れることにより、針の先端が切断してください。 （B）上に針の挿入はちょうど、最初の注射のための腸内の曲率の上に生殖腺。 （C）底部に針の挿入はちょうど目の注射のための腸内の曲率の下に生殖腺。

3. 1. コントラストとDIC剪断設定は両性生殖腺を表示するための理想であることを確認してください。
   2. 引っ張らキャピラリー針に注入混合物の1.0から2.0μlをロードする。
   3. マイクロインジェクションのマニピュレータに針を置き、窒素タンクの圧力計は理想的な条件（10〜20 psiに設定する必要があります。0.5から1秒間）。
   4. スライド（図2A）上に配置薄く引かキャピラリーチューブの端にわずかに触れて、針の先端を破る。
      1. 針ブレーカのスライド：プルオイルを一滴でスライドガラス上に配置キャピラリーの最薄部
   5. 針が壊れているしたら（P. pacificusは彼らドライアウトする前に注射のために5分のウィンドウを持っていると死ぬ）パッドにあなたのワームを選んでいる間はアイドル位置に位置することができます。
   6. J4 -若い成虫のフルプレートを使用して、ちょうどOP50細菌の芝生内のすべてのワームをカバーするのに十分なパラフィン油を（重い）注ぐ。
   7. ワームを選択し、注入パッドの上に置きます。
   8. 位置針と離れて針（図2B、2C）から外陰部の方向にワームの生殖腺、顕微鏡でのワームのガラススライドを置きます。
   9. 顕微鏡の視野の位置に針を下ろします。
   10. 同じ焦点面（図2B）のトップ生殖腺と針を合わせます。
   11. 注射の混合物にゆっくりとワームとポンプを突く、遠位端に向かって分離ooctyesが導入遺伝子またはdsRNAを配信を最適化するには成功した注射を（示すためには、注入時には、遠位に近くなるまで続けて生殖腺の拡大の波が見えるはずヒント）。
   12. 下の生殖腺に注入し、注入を繰り返すように針の位置を、この生殖腺は、消化管の下にあるしかしながらので卵母細胞の広がりが見られるため、より困難に達成することである（図2C）されません。
   13. 通常の探してこのワームは、注射後の成功注入を示し、損傷した生殖腺（外陰部から突き出たまたは体腔内ポップ）があってはならない。
   14. アイドル位置にニードルバックを置きます。
   15. ワームを救うために準備する。
   16. 注入されたワームが配置されているパッドの上にM9バッファーの低下（0.5μl）を追加します。
   17. お好きなものをいくつかOP50バクテリアを使用して、OP50とワームに触れ、そしてそれは守らなければならない。 Weは口のピペットを使用しないでください。
   18. OP50の50μlのスポットを接種したプレートの上にワームを配置、2-4ワームはそのようなプレートに救出することができます。
4. 遺伝子導入のためのポスト噴射ストレージ＆スクリーニング
   1. 20℃で注入したワーム（P _0）を格納° C〜4日間、卵を産むとF _1を成長する。
   2. 選択された表現型（PPA - PRL - 1優性マーカーを発現しているローリング動物のための遺伝子導入、検索用画面へ）のため4日目の画面のワーム。
   3. 単一の独立したF ₁ピックアップ、秒'25で新しいシードプレートとストアに観察された表現型との動物を° Cこの温度は、F ₁から安定した線の形成を促進"
   4. 独立したF ₁行から単一のF _2。個々のF ₂行は同じような導入遺伝子の伝達率を持っている。私たちはしばしば、変換F ₁動物当たり> 15 F ₂行を取得します。
   5. 25℃で、その後の世代保存
   6. 各々のラインのために：ローラーの伝送速度は、通常、それゆえに、ターゲット遺伝子の発現レベルを（GFP：PPA - EGL - 4P）を決定するために、この時点で必要な、F ₄世代後に一定のままである。 GFPの発現は、支配的なローラーの表現型の浸透の程度と相関しないことがあります。
5. RNAiの表現型のポスト噴射ストレージ＆スクリーニング
   1. 20℃で注入したワーム（P _0）を格納° C〜4日間F _1を置くと成長する。
   2. 選択された表現型（RNAiノックダウン表現型をスクリーニングするために、標的遺伝子の活性の損失に関連する可能性がある浸透表現型を検索し、我々の場合におけるPPA - PRL - 1表現型の損失）のため4日目画面F ₁のワーム。
   3. 我々の経験では、非ローラーノックダウン表現型は、F ₂の> 97％が失われている。

4。代表的な結果：

遺伝子導入のp"> 1。結果

セッション	注入されたP 0	F 1ローラー	％トランスジェニックF 2	F 2の後に平均％の透過
1	60	2	（1行目）0％ （ライン2）13パーセント	NA 13パーセント± 10
2	40	1 *	（3行目）0％	NA
3	40	0	0パーセント	NA
4	40	1	（4行目）0％	NA
5	20	0	0パーセント	NA
6	40	1	（5行目）26％	22パーセント± 10

クロスしなかったコンテンツ"> *男性ローラー、NA：該当なし

：GFP（サル私は消化）、pRL3（ローラー）（PST私は消化）、とgDNA PS312（PstIおよびSalIでの消化）：。PPA - EGL - 4Pと注入されたPS312の表3の結果。

図3（A）野生型（B、C）安定したF ₄ pRL3、PPA - EGL - 4P：：ヘッドニューロンGFPの発現を示すGFPトランスジェニックライン。

2。 RNA干渉の結果

図4。 RNAが注入されたPRL - 1変異体では、"ローリング"運動の完全なノックダウンを示しています。（）PRL - 1ローラーの機能獲得型変異体tu92。 （B）PRL - 1変異体展示正常な野生型の姿勢や運動を"ノックダウン"。 （C）PRL - 1（下）もある長いB注入されたPRL - 1変異体（上部）よりody。 （D）注入PRL - 1（下）の長い体は野生型PS312（上）よりも長いもです。長い体の表現型は、CのROL - 5（SQT - 1）RNAiノックダウンが観察されたelegansの N2（データは示さず）。

	ロール	非ロール
PRL - 1本鎖RNA（200 ng /μlに）	13	21
B PRL - 1本鎖RNA（ng /μLの1000）	9	16
の制御	20	2

表4。PPA - PRL - 1 dsRNAを注射のまとめ。 （A）[二本鎖RNA] = 200 ng /μlに、（B）[二本鎖RNA] = 1000 ng /μlに。 P =それぞれ200および1000 ng /μLの注入のための両側フィッシャーの正確確率検定、、、で0.0019と0.041。

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ディスカッション

P. pacificusの集団は、世界の様々なコガネムシの種と密接に関連して発見し、自由生活と寄生線虫の中間のモデル線虫であるされています。 P.の強さ新興モデル生物としてpacificus、公正な前進遺伝子スクリーニング（ すなわちだけでなく、以前にC.エレガンスを特徴とする候補遺伝子のための^）6,10から分離された変異体の位置的なマッピングを促進し...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
製品：	カタログ番号：	サプライヤー：
DMI3000インジェクション顕微鏡	DMI3000	ライカ
マイクロインジェクターのマニピュレータ（ダイレクトドライブ）	Narashige BC - 3ボールジョイント	Tritech研究
ニードルプラー	Narashige PC - 10	Tritech研究
マイクロインジェクター™全てのデジタルマルチ圧力システム	Narashige MINJ - D	Tritech研究
GeneElute™哺乳類のゲノムDNAミニプレップキット	G1N70	シグマ
pJetクローニングジェットキット	K1231	Fermentas
GeneJETプラスミドミニプレップキット	K0502	Fermentas
DNAクリーン＆コンセントレータ™	D4005	ZYMO研究
BLOCK - IT™RNAiのTOPO ®転写キット	K3500 - 01＆K3650 - 01	インビトロジェン
ディフコ™寒天ノーブル	DF0142 - 15から2	フィッシャーScientifi
顕微鏡のカバーガラス（1.5 - 0.16〜0.19ミリメートルの厚さ、サイズ：50 × 45ミリメートル）	12から554 - F	フィッシャーサイエンティフィック
ガラスキャピラリー（フィラメント）	615000	AMシステム
パラフィンオイル（ヘビー）	O122 - 1	フィッシャーサイエンティフィック
KH 2 PO 4	P386 - 500	フィッシャーサイエンティフィック
のNa 2 HPO 4	AC20651 - 5000	フィッシャーサイエンティフィック
NaClを	BP3581	フィッシャーサイエンティフィック
MgSO 4を	M80 - 500	フィッシャーサイエンティフィック