デグロンを使用した生細胞におけるユビキチン·プロテアソーム活性のモニタリング（DGN）·不安定化緑色蛍光タンパク質（GFP）ベースのレポータータンパク質

要約

生きた細胞内でユビキチン - プロテアソーム活性をモニターするための方法が記載されている。デグロン - 不安定化のGFP（GFP-DGN）と安定したGFP-dgnFS融合タンパク質が生成され、レンチウイルス発現ベクターを用いて細胞内に伝達される。この手法は、ユビキチン - プロテアソーム活性を容易に落射蛍光またはフローサイトメトリーを用いて評価することができる安定したGFP-dgn/GFP-dgnFS発現する細胞株を生成することができます。

要約

プロテアソームは異常、誤って折り畳まれた、破損したり、酸化されたタンパク質^1、2のタンパク質分解に関与する主な細胞内小器官である。プロテアソーム活性の維持は、細胞のストレス応答^3、細胞周期の調節と細胞分化⁴または免疫システムの応答⁵のように、多くの重要な細胞プロセスに関与していた。ユビキチン-プロテアソーム系の機能不全は、腫瘍および神経変性疾患^4、6の開発に関係している。さらに、プロテアソーム活性の低下は、細胞老化と生物の老化^{7、8、9、10}の特徴として見出された。ここで、我々は、GFP-DGN融合タンパク質を用いて、生細胞におけるユビキチン - プロテアソーム活性を測定する方法を提案する。初代培養細胞を生体内でユビキチン - プロテアソーム活性をモニターすることができるように、相補的DNA（緑色蛍光タンパク質（GFP）-DGN融合タンパク質をコードする構築物のGFPDGN、不安定な）とフレームシフト突然変異を運ぶバリアント（GFP-dgnFS、安定した^11）レンチウイルス発現ベクターに挿入されます。それは細胞のタイプやドナーの年齢とは無関係非常に高いトランスフェクション効率を保証しますので、我々は伝統的なトランスフェクション技術を介して、この手法を好む。プロテアソーム阻害剤の非存在下または存在下でGFP-dgnFS（安定した）タンパク質と不安定化タンパク質（GFP-DGN）によって表示される蛍光の差は、それぞれの特定の細胞株ではユビキチン - プロテアソーム活性を推定するために使用することができます。これらの違いは、落射蛍光顕微鏡によって監視することができますまたはフローサイトメトリーで測定することができる。

プロトコル

1。プラスミド構築

1. オーダーカスタムオリゴヌクレオチドDGN（ACKNWFSSLSHFVIHL ^11）とdgnFS（HARTGSLACPTSSSICE）のエンコードおよびDGN / dgnFS（ 図1）とGFPの融合を得るためのpEGFP-C1ベクターにそれを連結。
2. pENTR方向性TOPOクローニングキットのプロトコールに従ってPCRにより、GFP-DGNおよびGFP-dgnFSのコード配列を増幅し、pLenti6/V5方向性TOPOクローニングキット（ 図6）に進みます。

2。ウイルス産生

1. 彼らはトランスフェクションの日に90〜95％コンフルエントになるようにT75フラスコのHEK 293FT細胞外にトランスフェクションの前日（1日目）はシード。
2. トランスフェクション当日に血清および15mlファルコンで抗生物質を含まないDMEM 1.5mlにリポフェクトアミン2000試薬36μlを希釈します。別の15mlファルコンを使用し、いずれかのGFPを相補的なDNA構築物を運ぶ3μgのpLenti6/V5を薄める -DGNまたはGFP-dgnFS、血清および抗生物質を含まないDMEM 1.5mlに2.5μgのエンベロープのエンコードプラスミドpMD2.Gと7.5μgのベクターバックボーンpsPAX2。 5分後、希釈したDNAは、希釈されたリポフェクトアミン2000試薬と結合されます。
3. 形成するために、DNA-リポフェクタミン複合体を許可するように室温で20分間混合物をインキュベートする。
4. HEK 293FT細胞の培養液を除去し、培地の7ミリリットル（抗生物質なしで）慎重にそれを交換して、ミキシング用フラスコ、前後にロックして（2日目）にDNA-リポフェクタミン混合物を追加します。加湿した5％CO ₂インキュベーター内で37℃で一晩フラスコをインキュベートする。
5. 翌日、培地を変更します（抗生物質なしの10 mlの培地、3日目）。
6. 48時間後（5日目）収穫上澄み、室温で5分間、300×gで遠心分離し、0.45μmPVDFフィルターを通って上清をフィルターします。

培地- DMEM（HEK 293FT）

テント "> DMEM
10％のFBS
0.1mMのMEM NEAA
6 mM L-グルタミン
1mMのMEMピルビン酸ナトリウム
1パーセントペンストレプトマイシン（オプション）
500μg/ mlのジェネティシン（オプション）

3。ポリエチレングリコール（PEG）沈殿によるウイルス濃度

1. 4℃で2時間インキュベートした上清の4つのボリュームに℃、1ボリュームのポリエチレングリコール溶液（PEG 50mMのポリエチレングリコール、41 mMのNaCl、オートクレーブは、pH = 7.2）を追加慎重にそれを反転させて20〜30分毎に混ぜる。
2. 4℃で30分間1500 xgでスピンダウンホワイトペレットが見えるはずです。
3. 上清を吸引除去し、4℃で5分間1500 xgで再度遠心操作残りのPEG溶液を吸引します。
4. 媒体またはでペレットを再懸濁し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でピペッティングし、ダウンしてから、20〜30秒間激しくボルテックスすることによって。ガイドラインとして1 T75フラスコとアリコートそれ100μlに、500μlを使用しています。 -80℃でウイルス℃で保存

4。ウイルスの力価測定

1. うち5種×6ウェルプレートの各ウェルに10 ⁴ U2-OS細胞トランスフェクションの前日。
2. トランスフェクションの日に培地を除去し、8μg/ mlのポリブレンを（ヘキサジメトリンブロマイド）を含むDMEMを1ミリリットルでそれを交換してください。濃縮ウイルス上清1:10〜1:100に希釈し、よく一つに1μlのそれぞれに追加します。高いウイルス濃度の場合は1μL、5μLと残りのウェルのために濃縮したウイルス上清10μlを使用しています。一つは、よくポジティブコントロールとして残されます。
3. 次の日は、DMEM 2 mlで培地を交換してください。
4. 選択翌日から始まります。各ウェルに10μg/ mlのブラスチシジンを適用します。一日おきに抗生物質を含む媒体を交換してください。
5. 非形質導入細胞の選択を開始した後、約6-7日で死んでいる。染色のために、PBSで細胞を3回洗浄し、クリスタルバイオレット（10 mg / lのクリスタルバイオレットで細胞をカバー20％エタノール）を加え、室温で5〜10分間インキュベートする。吸引クリスタルバイオレットを（数回再利用できます）と蒸留H ₂ Oで2回ウエルを洗浄し、プレートを乾燥させます。
6. コロニーをカウントし、千と対応する希釈（ 図7）で乗算します。この手順では、ウイルス/ mlのトランスフェクションユニット（TU）を計算することができます。

培地- DMEM（HFF-2/U2-OS）

DMEM
10％のFBS
6mMのL-グルタミン
1パーセントペンのStrep

5。ヒト二倍体線維芽細胞の形質導入（この手順は、任意の細胞型にも使用できます。）

1. うち5種×10 ^4個のヒト二倍体線維芽細胞（HDFS）6ウェルプレートに伝達前日。
2. 1ミリリットルの合計で伝達エンハンサーとして8μ​​g/ mlのポリブレンとともに2つの感染多重度を使用しています。
3. 翌日、培地を変更します。
4. 時細胞がコンフルエントの70〜80％にある10μg/ mlのブラストサイジンを使用して、選択を開始します。選択が完了したら（これ以上トランスフェクトしていない細胞が死なない）細胞の増殖を開始することができ、細胞は実験のための準備が整いました。ブラストによる慢性選択がプロテアソーム活性を測定する準備ができ、安定した細胞株を過剰発現するGFP-DGNまたはGFP-dgnFS融合タンパク質を生成することができます。この手順では、細胞型の独立した非常に高いトランスフェクション効率を保証します。

6。フローサイトメトリーによる測定

1. うち1種×10 ^5個の細胞（GFP-DGNまたはGFP-dgnFSどちらを運ぶ）実験の前日。
2. コントロール細胞の前で3時間プロテアソーム阻害剤を用いた測定、 例えば、100μg/ mlのLLNLを扱う。
3. PBSで2回洗浄し、トリプシンの0.5mlを用いて細胞を収穫します。トリプシン処理を停止するには培地の4.5mlを使用し、15mlファルコンにセルを転送します。
4. スピントン室温で5分間、300×gで彼は細胞。
5. 、培地を吸引除去し、PBSに細胞を再懸濁し、37℃で5分間300 xgで再びスピンダウン℃に
6. FACS緩衝液（10mMのHepes、140mMのNaCl、2.5 mMのCaCl _2、pH = 7.4）中の400μlに再懸濁し、PBSを吸引除去し、FACSチューブに細胞を移す。
7. フローサイトメトリーによって氷と測定試料に対して細胞を維持。細胞は4℃でより長い30分を保存するべきではありません

7。代表的な結果

GFP-DGN融合タンパク質は、タンパク質従ってプロテアソームを標的とする配列を担持し、すぐに分解され、それはGFP蛍光シグナルの減少に対応しています。フレームシフト突然変異体（GFP-dgnFS）このシーケンスの変異バージョンを運び、プロテアソームによって分解されない、それは、より高い緑色蛍光につながる。これらの理由から、期待の高いプロテアソーム活性を持つ若いHDFSとGFP-DGで形質導入n個のフローサイトメトリー測定の両方でと落射蛍光（ 図2AおよびB、図3）の低（6％陽性細胞）の蛍光シグナルを示す。同じHDFSは陽性細胞の39.7パーセントを表示し、GFP-dgnFSで形質導入した。プロテアソーム阻害剤LLNL（N-アセチル-L-ロイシル-L-ロイシル-L-norleucinal）で細胞を処理するには、GFP-DGNおよびGFP-dgnFS細胞（ 図2AおよびBの両方で62.9％の最高に信号を発生させた）。

老化ヒト皮膚試料におけるプロテアソーム活性の可能性低下を判定するには、若い中年と古いドナーから単離し真皮線維芽細胞は、GFP-DGNおよびGFP-dgnFSに感染していた、上記のようにし、フローによる分析前に、同じ継代数に培っメトリ。これらの実験では、若い人（11.2±0.88パーセントGFP陽性細胞）と中年のドナー（20.4±2.27パーセントGFP陽性細胞は、P = 0.003）の間にGFPシグナルで明確な増加が示す、観察されているプロテアの減少高齢ドナー^7（ 図4）から得られた試料でOME活動。プロテアソーム活性のさらなる減少は最古の個体（ 図4）から単離された線維芽細胞では観察されなかった。 GFP-dgnFSの蛍光強度は、すべてのケースであった〜3年齢別グループのために高いトランスフェクション効率を示している90％（データは示さず）。

図1。 GFP-DGNおよびGFP-dgnFSシーケンス。表示は、GFP（緑色）のpEGFP-CL1はベクトル（灰色）とDGN / dgnFSシーケンス（赤）のマルチクローニング部位の3 '末端である。

図2。 GFP-DGNおよびGFP-dgnFSヒト二倍体線維芽細胞のフローサイトメトリー分析。 A. Youngにヒト包皮線維芽細胞（HFF-2）は、緑色蛍光タンパク質を運ぶレンチウイルスベクターを感染させた（GFP）-DGN遺伝子またはGFP-dgnFS（フレームシフト）は、フローサイトメトリー（FACS CantoのⅡ、Becton Dickinson）を用いてGFP蛍光のために示され、分析、構築します。示される場合、細胞はまた、プロテアソーム阻害剤N-アセチル-L-ロイシル-L-ロイシル-L-norleucinal（LLNL）で3時間処理した。非感染細胞を対照として用いた。実験は3連で行った。Bのデータは、3つの独立した実験の代表である。数字はGFP陽性細胞の量を反映しています。 拡大図を表示するにはここをクリック 。

図3。 GFP-DGNおよびGFP-dgnFS HFF-2細胞の蛍光顕微鏡分析。HFF-2ヤングは、 図2と同様に処理した。感染後9日目に、細胞はvであった蛍光および位相差顕微鏡によりisualized。

図4。人間の皮膚の老化におけるプロテアソーム活性の変化。指示の年齢層で9つの異なるドナーからのヒト包皮線維芽細胞が最小限拡大およびGFP-DGNをコードするレンチウイルスコンストラクトで感染させた。感染後9日目に、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。データが重複での年齢グループごとに3つのサンプル（±SE）で得た。

図5。 DGNとdgnFSのための実験的なアプローチ。カスタムオリゴヌクレオチドはのpEGFP-C1ベクターにクローン化され、ウイルスをHEK 293FT細胞を用いて、各構築物のために生産されています。ウイルスの力価が決定される。細胞がウイルスで形質導入と展開されます。有利な治療の後、細胞を分析したフローサイトメトリーによる蛍光シグナルのために。

図6。 pLenti GFP-DGNの地図。GFP-DGN配列を含むpLenti6/V5-DESTベクターのマップが表示されます。略語：PCMV（CMVプロモーター）、GFP-DGN（GFP-DGNのシーケンス）、P _SV40（SV40初期プロモーター）、EM7（EM7プロモーター）、ブラスチシジン（ブラストサイジン耐性遺伝子）とΔU3/ 3'LTR（3'LTR削除されたU3領域）、SV40 PA（SV40ポリアデニル化シグナル）、アンピシリン（アンピシリン耐性遺伝子）、pUC系ORI（PUC由来）、PRSV / 5'LTR（RSV / 5'LTRハイブリッドプロモーター）、Ψ（HIV-1Ψパッケージングシグナル）、RRE（HIV-1のRev応答要素）。

図7。 U2-OSのタイタープレート。U2-OSを6ウェルプレート上に播種し、異なるウイルス濃度（COの1/100と1/10、1、5、10μlの希釈を用いてトランスフェクトした）ウイルス上清をncentrated。一つはよくトランスフェクトしていないコントロール（NT）として使用した。 6-7日後、細胞をクリスタルバイオレットと空気乾燥で染色した。

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ディスカッション

ユビキチン-プロテアソーム活性のためのレポーター基質として緑色蛍光タンパク質（GFP）を用いた最初の出版は2000年¹²年に出版された。それ以来、GFPは細胞の活動、特にユビキチン - プロテアソームプロセスを可視化するための共通のツールと​​なっています。 in vivoでのユビキチン-プロテアソーム活性をモニターするために、GFP-ベースのレポータートランスジェニックマ...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号
のpEGFP-C1ベクター	BD Bioscience社クロンテック	6084から1
pENTR方向性TOPOクローニングキット	インビトロジェン	K2400-20
pLenti6/V5方向性TOPOクローニングキット	インビトロジェン	V496-10
リポフェクトアミン2000試薬	インビトロジェン	11668019
DMEM	シグマ	D5546
PVDFフィルター（Rotilabo-Spritzenfilter）	ロート	P667.1
ポリエチレングリコール	シグマ	P2139
NaClを	メルク	1.06404.1000
ダルベッコのリン酸は、サリのバッファNE 1X（PBS）で	インビトロジェン	14190
ヘキサジメトリンブロマイド	シグマ	10,768-9
ブラストサイジン	インビトロジェン	R21001
クリスタルバイオレット	シグマ	C3886
FACSチューブ	BD Biosciences社
ペニシリンストレプトマイシン（ペンストレプトマイシン）	インビトロジェン	15140130
L-グルタミン、200mMの	インビトロジェン	25030024
ウシ胎児血清（FBS）	Biochrom AG	S0115
MEM非必須アミノ酸（NEAA）100倍	インビトロジェン	11140035
MEMピルビン酸ナトリウムを100mM	インビトロジェン	11360039
D-（+） - グルコース（45％）	シグマ	G8769
ジェネティシン	インビトロジェン	11811023
CaCl2を	メルク	C5080
ヘペス	シグマ	H3375
トリプシン-EDTA（0.05％）	インビトロジェン	25300054