イメージングのための簡単​​な方法シロイヌナズナ浸潤イメージング媒体としてPerfluorodecalinを使って葉

要約

我々は浸潤性封入剤としてperfluorodecalinの使用を説明しています。これは、撮像の深さを改善するための簡単​​な方法です。シロイヌナズナ葉組織。

要約

生体試料に深く高解像度の画像を取得する問題が広く^1を認めている。このような植物の葉の海綿状の葉肉のような空気で満たされた組織または肺の脊椎動物、さらに困難は細胞成分との間の、細胞と空域の間及び生体組織や光学系の他の部分との間の屈折率の複数の遷移から生じる。また、屈折率の不一致は、蛍光物質の励起および蛍光顕微鏡における信号の放出の減衰につながる。我々は光学的にレーザパワーでダメージが増加するに頼ることなく、深さで焦点顕微鏡（LSCM）サンプル画像をスキャンするレーザーを改善し、最小限の生理的影響^2を有する浸潤のイメージング媒体としてここにパーフルオロカーボンのアプリケーション、perfluorodecalin（PFD）を、記述する。我々は、その結果として光学的に複雑であるシロイヌナズナの葉組織、とPFDの使用のためのプロトコルを記述する構造（ 図1）。 PFDは、この使用³に適するよう、属性の数を持っています。 PFDの屈折率（1.313）が水（1.333）と同等ですし、空気（1.000）よりも細胞質ゾル（約1.4）のそれに近いです。さらに、PFDは非蛍光、容易に入手可能であり、非毒性です。それは洪水を可能にする気孔貫通^4、のための- PFDの低い表面張力（19ダインcm ^-1には ）水（72ダインcm ^-1）のそれより低く、また上限（30ダインcm ^-1の 25）以下です。潜在的に破壊的な真空または界面活性剤の応用せずにスポンジ状の葉肉の空域。最後にと決定的に、PFDは、CO ₂とガス交換がこうしてサンプルについての生理学的影響を最小限に抑え、浸水組織で維持できるようにするO _2を 、溶解させるための偉大な能力を持っています。これらのプロパティは、部分的液体呼吸と肺のインフレを含む様々な用途で使用されているる^5,6、手術^7、人工血^8、増殖培地^9、及び植物¹⁰の氷の結晶形成の研究の酸素化。現在のところ、それは、ライブ共焦点イメージングのための水または水性緩衝液に組織をマウントするのが一般的です。私たちは、封入剤として、PFDの使用は、既存の慣行の改善を表し、イメージングのためのライブ全体の葉のサンプルの簡単な製造を可能にすることを検討してください。

プロトコル

以下のプロトコルは、 シロイヌナズナの葉の浸潤性封入剤としてPFDは使用するためのシンプルな方法を説明しますが、我々は、このメソッドは画像空気が豊富な組織が ​​望まれる様々なアプリケーションで使用される場合があることを期待しています。

1。 PFDの取付け葉サンプル

1. ポリジメチルシロキサンのガス透過性のガスケット（PDMS、ノースカロライナ観測ジェル）と顕微鏡のスライドを準備します。 PDMSは、粘弾性ポリマーであり、実験の要件に合わせたチャンバーを提供するように成形することができます。
2. 空気とPFDは平衡化させます。これは、空気バブリングによってまたは空気で満たされたボトルのPFDの小さな体積を振ることによって達成することができる。
3. デカントは、開いているシャーレにPFDと5分間PFD上に全体実生または切除された葉をフロートさせます。組織は、ガラス固化体組織（ 図2（））を彷彿とさせる半透明になるはずです。葉は、PFD、依への曝露前より暗くまたは明るく表示されることがあります照明条件や使用する組織の年齢で丁。
4. 空気平衡PFDとPDMSチャンバーを記入し、慎重にPDMSチャンバーにインキュベーションペトリ皿から組織サンプルを転送する。実験的な要件に応じてカバースリップと画像でスライドを密封する。
5. 注：PFDもカバースリップ上に構築されたオープンなチャンバー内にまたは灌流チャンバ内のよく実行し、シリコングリスと互換性がある。それはそれらを溶解するとPFDは、テフロンのコンポーネントと互換性がありません。

2。代表的な結果：

PFD -インキュベートした葉サンプルの顕微鏡検査は、空域の大部分が浸水していることを示している。 図2（b）は PFDに懸濁した組換えGFPが殺到する空域を示しています。それは葉がPFDとインキュベーションにより浸水していることは明らかであるが、空気のその時々ポケットが残る場合があります。水は、これらの条件下で葉をフラッディングしません。サンプルのLSCMはでインキュベートし、マウントさ IR、水またはPFDが可能なイメージング（ 図3）の深さで水と空気以上に優位に立つことPFDを示しています。 図3に示す例では、空気、水とPFDマウントされているシロイヌナズナが cytosolicallyローカライズされた金星、35Sプロモーターの制御下に恒常的に発現されたYFP ¹¹の変形を表現する葉を示しています。 PFDと水を比較するときに我々は、イメージングの深さでおおよそ2倍の増加を見ることができます。それは、PFDを使用するときに見られる精密な改善がレンズと使用される組織の種類の開口数によって変化すること、しかし、注意する必要があります。我々は、PFD治療苗における細胞質流動と根毛の伸長、健康な植物の各指標を見てきました。さらに、我々 は FV / Fmは 、植物¹²の光合成機能の測定は、イメージングに使用されるタイムスケール上の許容限度内であること^2を示している。

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図1。植物の葉の複雑さと光学的影響
A.の解剖学的特徴を示すダイヤグラム表示光学セットアップに関連したシロイヌナズナの葉。使用される略語はobjです。 =対物レンズ、IMM。 =液浸液、COV。 =カバースリップ、MNT。 =封入、カット。 =キューティクル、広告。 EP。 =向軸表皮、ST。 =気孔孔、SP。 =エアスペース、PALなど=海綿状葉肉、。 =柵状葉肉、VB =維管束、広告。 EP。 =向軸表皮。細胞壁は黒い線で示されます。

図2。 PFDは、容易にシロイヌナズナの葉を貫通する
（）空気、水の中でインキュベートまたは5分間PFDは葉とライカMZ16F顕微鏡（ライカマイクロシステムズ（英国）（株）、ミルトン - ケインズ、英国）とライカDCF3000FXデジタルカメラを用いて画像化。 Joveのロゴは、アセテートフィルムに印刷し、あちこちに照らされたライトボックスで下にはM。露光時間は89 msであり、すべての画像を収集し、同じように処理されました。スケールバーは2mmを表す。

（b）の組換え緑色蛍光タンパク質を精製運ぶPFD（GFP）は、 生体内で空域を区切ります。 GFPは、偽色の緑で、赤は葉肉細胞を区切るクロロフィル自家蛍光を、表示するために使用されます。 （ 図2（b）許可とリトルジョンらで利用可能な完全な技術的な詳細に再現。2010 ^2）。スケールバーは25 mを表す

図3。 PFDは、葉に共焦点イメージングを向上させる
無傷のシロイヌナズナで細胞質局在化金星蛍光（緑色）とクロロフィルの自家蛍光（赤色）を示すLSCMの画像は、空気、水またはPFDで結像される葉。励起波長は514 nmであると蛍光発光は、金星は604 nmの518 nmで記録し、少なくとも657 nmの葉緑体のための679 nmの。各パネルは、5μmの間隔で取得した11共焦点画像のZ -スタックから取り出した単焦点セクションです。これらは、補足的なムービーを生成するために使用されている1μmの間隔で取得した59個のイメージのフルZ -スタックから抽出した。深さの測定は、上皮表面に対して与えられる。同様に処理された代表的なイメージは、表示されます。そのような顕微鏡の設定などの実験の詳細は、リトルジョンらに見られるものと同じです。、2010 ^2。スケールバーは20μmを表す。

ディスカッション

これは、空気充填または光学的に複雑な組織の顕微鏡を向上させるためにシンプルで使いやすい手法です。私たちは、テクニックはいくつかの強力な利点を持っていることが示されていると我々は、それが空気が豊富な組織に関連する生物学的疑問を解明するために使用されることを願っています。例えばそれは、植物の葉肉や肺内の病原体の攻撃の研究のための自然な選択になるでしょう。我々はまた、技術の限界を認識しています。我々は、長いタイムスケールの実験中に優れた屈折率のマッチング、顕微鏡の他のモードでの使用、及びパーフルオロカーボン封入補充に取り組んでいます。我々はまた、PFCガスの主な利点の一つは、すなわち生物学的に不活性なフリップサイドを持っていること、しかし、認識する。 PFCは容易にまたそれらが容易にそのようなホルモン、薬物、および他の小分子やイオンのような関心の化合物を送達するために使用することはできないことを意味する生物学的分子を溶解しない。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
Perfluorodecalin	F2ケミカルズ	N /	順番に電話。
カロライナ観測ジェル	生物ブレード	13から2700