たばこの主流煙のフリーラジカルを検出し、気相を清掃するためのプロトコル

要約

スピントラッピングESR分光法は、植物抗酸化物質リコピン、タバコの煙のガス相フリーラジカルを捕捉に関するピクノジェノールとブドウ種子抽出物の効果を研究するために使用されていました。

要約

喫煙は、ヒトの癌に関連付けられています。それは、肺がんによる死亡のほとんどは喫煙^5,6,7,12によって引き起こされることが報告されている。タバコの煙の粒子相のタバコのタールおよび関連製品は、発がん性と変異原性関連疾患の主要な原因ですが、タバコの煙には^、9,10の発ガン性物質の重要なグループとみなされているフリーラジカルを大量に含まれています。フリーラジカルは、有害なタンパク質の構造、脂質およびDNA配列により細胞成分を攻撃し、癌の様々なタイプを開発のリスクを増加させる。吸入ラジカルが肺³のタバコの煙の健康への悪影響の多くに寄与する付加体を生成する。研究は、喫煙によって誘発される損傷のリスクを減少させるためにタバコの煙のフリーラジカルを減らすために行われている。それは、ヘモグロビンとヘム含有化合物が部分的に、反応性窒素酸化物を捕捉できることが報告されている酸化剤とタバコの煙⁴の発がん性nitrosocompounds。 "バイオフィルター"は、ヘモグロビンで構成され、活性炭はフリーラジカルを捕捉すると、タバコの煙¹⁴からのフリーラジカルの90％まで除去するために使用されていました。しかし、費用対効果がないため、それが正常に実用化されていません。別の研究では、シコニン、漢方薬⁸の構成要素の良好な掃気効率を示した。本研究では、我々はスピントラップを使用してたばこの主流煙（MCS）におけるガス相フリーラジカルのスカベンジ効果のたばこの煙のガス相フリーラジカルを捕捉するためのフィルタシガレットに一般的な天然の抗酸化エキスを導入するためのプロトコルと測定を報告する電子スピン共鳴（ESR）分光法^1,2,14。我々は、リコピンとたばこフィルターで、将来のアプリケーションを指すようにブドウ種子抽出物の高い清掃能力を示した。これらのプロの重要な利点pectiveスカベンジャーは、それらがそれぞれトマトやワイン産業の副産物^11,13から大量に得ることができることです。

プロトコル

1。材料

本研究で使用したすべての溶媒は試薬グレードであった。 N - tert -ブチル-α- phenylnitrone（PBN）と標準的スピンラベルが2,2,6,6 - テトラメチル-1 - piperinyoxyl（TEMPO）を含むスピントラップは、Sigma社から入手し、供給として使用された。植物酸化防止剤は、スワンソン社米国から商業的に入手した。

2。タバコの煙やフリーラジカルの分析の準備

1. リコピンは、アセトンに溶解しながら、フィルタに酸化防止剤を導入するために、抗酸化物質のピクノジェノールとブドウ種子抽出物は、まず、95％エタノールに溶解した。溶媒量は、抗酸化物質の溶解度に応じて異なっていた。
2. 0.4酸化防止剤の量はmg /フィルターを使用した。彼らはその後、活性炭、10mgので被覆した。この目的のために活性炭を真空下で濾過し、乾燥嫌気的条件下で抗酸化溶液との〜12時間、攪拌した。
3. 酸化防止剤は、従来のアセテートフィルター（CAフィルタ）に導入した。この目的のために、フィルタは2つの部分に切断した。抗酸化物質は、フィルタの2つの間に挿入し、フィルタを形成するためにテープの一部でラップされたコーティングされた植物 - 抗酸化物質フィルターサンドイッチ（図1A）。この組み合わせのフィルタは、その後、タバコを含むタバコのロッドに装着された。制御フィルタは、無酸化防止剤を除く抗酸化フィルタが追加されたのと同じ方法で行われました。
4. 喫煙のシミュレーションに先立って、研究のタバコが解凍され、2日間の最低飽和NaBrのソリューションを使用して一定の湿度環境（20℃、相対湿度60％）に格納されていました。
5. ルーチン分析のための喫煙シミュレーションは、水アスピレーターまたはGAST DOA - P104 - BNの真空ポンプ/エアーコンプレッサー（ベントンハーバー、ミシガン）接続で構成され、図1に示すように、シングルポート喫煙装置を用いて周囲温度で実施したスピントラッピングへ一端が開いた状態でT字路を介してアセンブリ。パフは、パフの間に開いたままに開放端を塞ぐことによって行った。ガス流量は、ポンプと通気孔の間に配置されたバルブを調整することによって、〜2.2 SCFH = 17.5 ml / sの時に流量計とセットにより確認した。
6. 研究のタバコは、2秒の持続時間を35 mLのパフのボリュームの条件で燻製された¹と同様に、60秒ごとに繰り返す。図に示すように、気相フリーラジカルの定量的な推定のための喫煙シミュレーションは、スピントラッピングシステムと連携して実施した。 1。
7. 十強烈なパフ（35ミリリットル/パフ）は各タバコのために採取した。気相フリーラジカルは、ケンブリッジフィルターパッドを介してMCSを渡すことによって回収し、スピントラップ溶液（ベンゼン、2.0 mLの0.05 M PBN）に導入した。
8. 最後のパフの後、バブルトラップのソリューションは、同じベンゼンとの最初の体積（2.0 ml）に再調整した。アリコート〜25に移した長さ0 mmの一端に封止さ3mmのIDのガラス管。
9. トラッピングソリューションは、凍結 - ポンプ - 解凍の手順を使用して脱酸素した。それは、液体窒素で凍結され、真空を適用した。それはトラップされた気泡が脱出できるように、アルゴン雰囲気下で融解され、そして再び凍結。このサイクルを3回繰り返した後、チューブは真空下で炎シールであり、さらにESR測定に使用。ベンゼンでも可溶である酸素は、有機ラジカルのESR線を広げるため、この手順が必要です。脱酸素化が劇的に信号対雑音比を向上させます。
10. X -バンドESRスペクトルは、標準的条件下で9.34 GHzの周波数でブルカーEMX分光計で記録した。ほとんどの実験で使用した分光器の設定は次のとおりだった：センターフィールド3312.5G、スキャン幅80G、変調振幅0.5G、時定数82マイクロ秒、スキャン時間40秒。
11. スピントラップ付加体は、いくつかのケースではREQの実験条件、で比較的安定しています通常、〜20分を要した25の蓄積を、uired。しかし、12時間後にベンゼン溶液中でのESR信号の強度は〜5倍に減少した。
12. トラッピング付加体の濃度を定量化するために、その最初の一微分ESRスペクトルが統合されました。結果として得られる吸収スペクトルは、煙に含まれるすす/タール製品に起因する可能性が最も高いブロードシングレットの背景を示しています。
    
    このバックグラウンドを差し引いた後にトラップ付加体の分離されたトリプレットが複数の時間（図2）統合されました。

3。代表的な結果

タバコ生産煙を（気相）の燃焼におけるフリーラジカルのほとんどは、瞬時と不安定である。これらの基を観察するために、スピントラップ技術が採用されている。それはより安定であり、ESR（図1）によって検出することができるスピン付加物にそれらを変換することによって気相フリーラジカルを捕捉。 0.05本研究では、スピントラップソリューションM PBNは、酸素と炭素中心^15を分離することが困難な基の混合物である煙の気相フリーラジカルを、収集するために使用されていました。私たちのケースでは、しかしながら、観測された超微細分裂定数_N = 13.7Gと_H = 1.95Gは、主要な製品であることを示唆し、アルコキシルフリーラジカルの付加体^{（RO.）2を}トラップするための対応する値に非常によく似ています。我々は、煙の流れの水分によるものであったその弱いESR信号と（図2）私たちの初期の測定で観測された低再現性を示した。この問題を解決するために、我々はケンブリッジフィルターとスピントラップのソリューションとの間の液体窒素（LN2）トラップを追加しました。 LN ₂トラップでは、急速凍結によるMCSの流れから水を除去し、ガラス管の内壁に、それを捕捉することも可能です。これは非常にESR信号を改善し、再現性の高い結果（図3）を可能にした。

トラップされたフリーラジカルの量は、使用して決定したリファレンスサンプル。酸化防止剤なしのコントロールのサンプルについては、TEMPOの濃度が既知のための二重積分スペクトルとの重積分スペクトルの比較により推定されたベンゼンの典型的な付加体の濃度は1.24μM（図2）であった。喫煙中にそれぞれのシガレットを通過する空気の量は約350 mlとするので、これは〜7.1X10 ^-9 MのMCSの気相におけるフリーラジカル濃度の推定値を与え、気相から捕捉されたラジカルの合計数〜1.5 × ¹⁵の全体のタバコの。ガスおよび粒子相の両方を含む全体のタバコの煙のフリーラジカルの総量の推定値は、、〜10 ¹⁶フリーラジカルは⁹だった。

メインストリームのタバコの煙のガス相フリーラジカルの植物の酸化防止剤の清掃効果の異なるレベルが観察された。彼らの掃気率を図に発表されました。 4。低いながら、リコピンとブドウ種子抽出物は最も高い率を示したER率は、ピクノジェノール（図4）のために観察された。

図1。スピントラップを使用して、たばこの主流煙（MCS）で気相フリーラジカルを収集するための改良された喫煙シミュレーション設計のダイアグラム。 MCSは、ケンブリッジフィルター（イエローフィルター）、CAフィルターを通して水アスピレーターによって描画され、H ₂ Oを除去するために液体窒素のトラップを通過させた気相の製品が最終的にトラップをスピンに行き、スピントラップ溶液を通してバブリング。植物の抗酸化物質がMCSにフリーラジカルを捕捉するためにタバコに接続されている（丸で拡大）従来のアセテートフィルターの2枚の間に配置されました。

図2ベンゼンのスピントラッピング付加物濃度の定量的な見積もりは、最初のインテグラから幅広いバックグラウンドシグナルを差し引くことが必要ですlのスペクトル。スピントラッピング付加のための超微細分裂のパラメータは_、H = 1.95 _G、N = 13.7Gです。

図3。LN2トラップを介して渡すことは、実質的MCSのスピントラップによって得られたESR信号の品質を向上させます。

図4。 MCSにおけるフリーラジカルの濃度で自然な酸化防止剤の効果。相対的シグナル強度は、次のとおりです。コントロール - 100％、ピクノジェノール - 55％、ブドウ種子エキス - 12％、リコピン - 10％。

ディスカッション

タバコの煙の異なるフリーラジカルスカベンジャーの効果の信頼できる推​​定値は、フリーラジカルの定量的検出のための再現可能なテクニックを必要とします。以前に^1、それは非極性溶媒に高濃度のスピントラップ溶液の少量がタバコの煙からフリーラジカルをトラップで最も効果的であることが示されている。タバコの煙は、常に有機化合物の燃焼とトラッピング溶媒中で終わってしまうタバコの残留水分から水蒸気が含まれています。 PBNスピントラップ溶液中の水のこの混合物は、実質的スピントラップ付加体の寿命とそのESR信号の強度を減少させる。液体窒素で冷却したU字管を介して簡単に通過するのMCSによってこの水分を削除すると、劇的に気相ラジカルのある部分も凍結面上に捕捉されていても、我々の実験でESRスペクトルの質を改善。

tを使用する彼の手法は、我々は、タバコのフィルターに導入された天然化合物を別のラジカル捕捉の相対効率を比較した。我々はすぐにタバコのフィルターに組み込む後のリコピンとブドウ種子エキスは、気相のMSCからのフリーラジカルの90％まで捕捉できることがわかった。このような高い清掃能力は、ヘモグロビンとshikonine ^8,14のような最も効率的な報告フリーラジカルのプロテクタの間でこれらの安価な容易に入手できる天然化合物をランク付けする。まだ、我々の実験に学んだ自然な酸化防止剤をロードしたたばこフィルターは、室温で貯蔵の週後に清掃能力の顕著な部分を失った。この問題を解決することは、商業的なたばこフィルターにリコピンとブドウ種子抽出物の将来のアプリケーションを刺激することができる。