カプセル化された細胞凝集体の中で低酸素シグナルの追跡

要約

架橋PEGハイドロゲル中の細胞の写真 - カプセル化する方法について説明する。カプセル化されたマウスインスリノーマ（MIN6）集合内の低酸素シグナルが蛍光マーカーシステムを用いて追跡されます。このシステムは、ハイドロゲル骨格と細胞表現型の変化と低酸素シグナル伝達の相関関係にあるセルの連続検査が可能になります。

要約

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic β-cells results in loss of insulin production and potentially lethal hyperglycemia. As an alternative treatment option to exogenous insulin injection, transplantation of functional pancreatic tissue has been explored^1,2. This approach offers the promise of a more natural, long-term restoration of normoglycemia. Protection of the donor tissue from the host's immune system is required to prevent rejection and encapsulation is a method used to help achieve this aim.

Biologically-derived materials, such as alginate³ and agarose⁴, have been the traditional choice for capsule construction but may induce inflammation or fibrotic overgrowth⁵ which can impede nutrient and oxygen transport. Alternatively, synthetic poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels are non-degrading, easily functionalized, available at high purity, have controllable pore size, and are extremely biocompatible,^6,7,8. As an additional benefit, PEG hydrogels may be formed rapidly in a simple photo-crosslinking reaction that does not require application of non-physiological temperatures^6,7. Such a procedure is described here. In the crosslinking reaction, UV degradation of the photoinitiator, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produces free radicals which attack the vinyl carbon-carbon double bonds of dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking at the chain ends. Crosslinking can be achieved within 10 minutes. PEG hydrogels constructed in such a manner have been shown to favorably support cells^7,9, and the low photoinitiator concentration and brief exposure to UV irradiation is not detrimental to viability and function of the encapsulated tissue¹⁰. While we methacrylate our PEG with the method described below, PEGDM can also be directly purchased from vendors such as Sigma.

An inherent consequence of encapsulation is isolation of the cells from a vascular network. Supply of nutrients, notably oxygen, is therefore reduced and limited by diffusion. This reduced oxygen availability may especially impact β-cells whose insulin secretory function is highly dependent on oxygen^11-13. Capsule composition and geometry will also impact diffusion rates and lengths for oxygen. Therefore, we also describe a technique for identifying hypoxic cells within our PEG capsules. Infection of the cells with a recombinant adenovirus allows for a fluorescent signal to be produced when intracellular hypoxia-inducible factor (HIF) pathways are activated¹⁴. As HIFs are the primary regulators of the transcriptional response to hypoxia, they represent an ideal target marker for detection of hypoxic signaling¹⁵. This approach allows for easy and rapid detection of hypoxic cells. Briefly, the adenovirus has the sequence for a red fluorescent protein (Ds Red DR from Clontech) under the control of a hypoxia-responsive element (HRE) trimer. Stabilization of HIF-1 by low oxygen conditions will drive transcription of the fluorescent protein (Figure 1). Additional details on the construction of this virus have been published previously¹⁵. The virus is stored in 10% glycerol at -80° C as many 150 μL aliquots in 1.5 mL centrifuge tubes at a concentration of 3.4 x 10¹⁰ pfu/mL.

Previous studies in our lab have shown that MIN6 cells encapsulated as aggregates maintain their viability throughout 4 weeks of culture in 20% oxygen. MIN6 aggregates cultured at 2 or 1% oxygen showed both signs of necrotic cells (still about 85-90% viable) by staining with ethidium bromide as well as morphological changes relative to cells in 20% oxygen. The smooth spherical shape of the aggregates displayed at 20% was lost and aggregates appeared more like disorganized groups of cells. While the low oxygen stress does not cause a pronounced drop in viability, it is clearly impacting MIN6 aggregation and function as measured by glucose-stimulated insulin secretion¹⁵. Western blot analysis of encapsulated cells in 20% and 1% oxygen also showed a significant increase in HIF-1α for cells cultured in the low oxygen conditions which correlates with the expression of the DsRed DR protein.

プロトコル

1。 PEGDMの合成と光活性PEGDMのマクロマー溶液の調製

1. 硬質プラスチック製のキャップで40mlのガラス製バイアル瓶にPEGの2Gを（線形、10,000 Da）の重量を量る。
2. 無水メタクリル酸の約308μL追加し、緩くバイアルをキャップ。
3. 電子レンジ標準の国内電子レンジで2分の高オンバイアル。さらに5分間高い上にマイクロ波し、耐熱手袋、徹底的にボルテックスバイアルを身に着けている。
4. 簡潔にバイアルは手袋で処理されるのに十分冷まします。それを暴露すると徐々にバイアルを旋回しながら、塩化メチレンを追加。解決策は、必要に応じてサンプルをボルテックス、明確かつ均質に表示されるように十分な追加。 2 mLの - 使用される塩化メチレンの合計量は1.5でなければなりません。
5. コー​​ルド200mLにPEGDMを沈殿させる、ソリューションを滴下してジエチルエーテルを撹拌する。
6. 真空ろ過によってPEGDMを収集し、それが乾燥することができます。
7. 十分な量のPEGDMを溶かすの脱イオン水（通常100 -150 mL）で。
8. 千Daの分子量カットオフ値を持つ透析チューブに5日間脱イオン水に対して解決策を透析。 1日1回水を交換してください。
9. 分注し-80℃で適切な容器と凍結にソリューション℃で一晩。精製された白色PEGDMの粉末を得た4日間のソリューションを凍結乾燥。 ° C使用しないときは4で粉を保管してください。
10. 光活性PEGDM溶液を調製するには、まず、脱イオン水でイルガキュア2959を溶解して0.5重量％の光開始剤のストック溶液を調製。渦解と暗闇の中で保管してください。
11. 10重量％のPEGDMとハンクス平衡塩類溶液（HBSS）0.025重量％イルガキュア2959溶液を調製します。 PEGDMの溶解を確実にするために徹底的にボルテックス。我々は通常、同時に、このソリューションの1mLのを準備。
12. 1.8 mLのマイクロ遠心チューブに0.2μmのシリンジフィルターを通してそれをフィルタリングすることにより解決策を滅菌する。アルミホイルにチューブを巻きますし、4℃で保存

2。文化、感染症、およびMIN6細胞の凝集

1. MIN6細胞を37で加湿環境で10％FBS、7mmのグルコース、100ユニット/ mLのペニシリン/ストレプトマイシン、及び0.5μg/ mLのamphotercin B℃、5％CO ₂を添加したRPMI 1640培地中で培養されています。
2. 処理された培養フラスコの表面から細胞を解除するには、37で細胞をリンス、培地を吸引除去° C、カルシウム/マグネシウムを含まないHBSS、HBSSを吸引し、37 ° Cトリプシン- EDTA溶液2 mlを加え、細胞を許可する3分間インキュベートする。
3. しっかりと細胞がフリーノックするフラスコの側面をJARファイルにまとめ、その後、37の8 mLを加え° C培地と精力的に気泡を導入しないように注意しながら上下に細胞懸濁液をピペットで。
4. 滅菌15 ml遠心チューブに細胞をピペッティングし、血球計算盤またはプロシージャを数え、他の細胞を用いて細胞数を実行します。
5. メーカーで細胞を感染させる準備にウイルスは、最初に感染される細胞の総数を決定し、感染の希望多重度（MOI）（セル50〜100感染粒子）を達成するために必要なウイルス懸濁液の体積を計算する。
6. 慎重に1.8 mLのマイクロ遠心チューブにHBSSのプレ分注し、ボリュームにウイルス懸濁液の適正量をペッティングにより、HBSSでウイルスを希釈する。 HBSSウェルあたりの凝集細胞を50μLが適当である。
7. ピペット6ウェル懸濁培養プレートのウェルに加え40万の細胞を達成するために必要な量をし、そのチューブを上下にそれらをペッティングにより細胞を分散させる。
8. 所望のMOIを達成するために各ウェルに希釈したウイルスの適切なボリュームを追加します。
9. 1.7 mLの全量をもたらすために各ウェルに培地を追加。
10. インキュベーター内部のオービタルシェーカー上でプレートを置きます。培地は優しく井戸（〜100 rpm）で周りに洗うように、低設定でシェーカーを設定します。凝集して細胞を許可する24〜36時間のTE。 75〜175μmのおおよその直径を持つ凝集体が形成されるべきである。

3。 PEGDMの細胞のカプセル化

1. 細胞は、分散（ステップ2.4​​）または以下の集約（ステップ2.10）としてカプセル化されることがあります。ヒドロゲル前駆体PEGDMソリューションが液体であるため、細胞が架橋ハイドロゲルの形成に先立って解決する傾向がある。セトリングがそのようなより大きな凝集体と同様に、急速に発生が予想されている場合、それは細胞がゲルの中心面に沈殿するように二つのステップでヒドロゲルを生成するために有益であるかもしれません。分散した細胞の適切なワンステップのハイドロゲルの合成手順が示されている（ 図2）およびツーステップ手順（3.2〜3.9）以下同様に（ 図3）と詳細表示されます。
2. ハイドロゲルは、1 mLのプラスチック製の注射器のオフテーパ状先端をカットして、ラックに端を開く配置することによって形成されるの容器を作成します。
3. 光活性PEGDMのピペットで20μLのでボリュームが全体のプランジャーの表面を覆うことを確認してプランジャーの上に注射器の開放端にlution。平坦な液体表面を達成するために小さな単位でプランジャーを調整します。
4. ラックと位置ヒドロゲルの架橋を可能にするために約8分間UVランプ（波長365nm、〜7 MW / cm ^2）の下のラックにピペットを置きます。この時間の間に、細胞の調製を開始することができる
5. ピペットで1.8 mlのマイクロ遠心チューブに細胞/骨材の希望数を含むボリュームを、キャップ、そして5分間、130 gでチューブを遠心する。
6. マイクロピペッタを使用して、慎重にチューブの先端で細胞ペレットを乱すことなくメディアを取り出してください。メディアのヘッドがペレットに近づくにつれて、それは、細かいを使用して10μLピペットチップ役立ちます。
7. ゆっくりと光活性PEGDMの溶液20μLに細胞ペレットを再懸濁します（凝集体を扱う場合広口ピペットチップを使用）し、目の上に注射器に細胞懸濁液を追加eは、以前にハイドロゲルの部分を架橋。
8. ハイドロゲルの構築を完了するために、UV光のさらに8分に注射器を公開。終了すると、細胞が完全に円筒状のハイドロゲル（ 図3）内にカプセル化されるべきである。
9. シリンジからと簡単にゲルを洗浄するために24ウェルプレートのウェル中のHBSSを1 mLにハイドロゲルを取り出します。希望の条件の下で24ウェルプレートと文化のウェルに培地1 mLにゲルを移す。

4。低酸素状態の追跡

1. 任意の時点で文化、画像中の細胞は低酸素シグナル伝達の開始を追跡するために蛍光顕微鏡を使用して。あなたがマルチウェルプレートの画像ができるイメージングや顕微鏡ステージ上に配置する前に、顕微鏡のスライドにゲルを転送されているものに応じて。 DSレッドのピーク励起は556nmで実現し、発光ピークは586nmで発生します。排出量はかなり激しいですので、退色はを観測していない問題があることがED。蛋白質の生産と最初の信号検出の開始の間のタイムラグは約12時間です。信号は、個々のシグナル伝達の細胞を識別するのに十分な固有のものですが、解像度は細胞内シグナルの局在を決定するには不十分かもしれません。シグナル伝達細胞では、信号は通常は細胞質全体に均一に観察される。これは増加した蛋白質の発現、全体的なタンパク質の蓄積、または遅延タンパク質の成熟に起因するかどうか我々はまだ完全に決定していないのに信号強度はまた、低酸素への長時間曝露と増やすことができます。

5。代表的な結果

PEGハイドロゲル内にカプセル化されたMIN6凝集体の代表例を図4に示されています。架橋ゲルは、反応が実行された容器の形状を取って、全体に固体になります。滑らかな外側表面を有するゲルは、異物の再の予防を支援するために注入するための望ましいsponse。ゲル内で、細胞の凝集体は完全にマトリックスで囲まれ、均一に良い栄養素の輸送を可能にするために配布される必要があります。

MIN6凝集体における低酸素シグナルの代表画像を図5に描かれている。マーカーのウイルスに感染して同一のMIN6集計は、画像キャプチャの前に44時間を20％O _2（5A）または1％O _2（図5b）のいずれかで培養した。

図1当社の低酸素マーカーのシステムの活動の概略図。 DSレッドDR遺伝子と上流のHREのプロモーターのアデノウイルス挿入がHIF - 1の制御下に蛍光タンパク質の低酸素誘導性の製造を可能にする。

図2 CRにMIN6細胞を分散したのシングルステップのカプセル化のための手続きフローチャートPEGDMハイドロゲルをosslinked。それぞれのゲルの場合は、分散した細胞は光活性PEGDMのマクロマー溶液の40μlの懸濁される。これは、首を切ら1mLの注射器内に配置され、ハイドロゲルは、10〜12分後に365nmのUV光の下で形成される。完了すると、ハイドロゲルのディスクは、注射器から取り出し洗浄し、インキュベーションのための媒体を充填したウェルプレートに配置されます。

図3。架橋PEGDMハイドロゲルに集約されたMIN6細胞のデュアルステップカプセル化のための手続きのフローチャート。それぞれのゲルの場合は、ハーフゲルは最初の8分間の光活性PEGDMのマクロマー溶液の20μLのUV架橋により形成される。 MIN6凝集体は、慎重に前もって形成された半ゲルの上に追加された光活性マクロマーのソリューションの追加の20μLに懸濁されている。完全なゲルが完全に内側にカプセル化された凝集体に紫外線照射の追加の8分によって形成されるゲルの平面。

図4 20倍の倍率下で40μlのハイドロゲルのイメージ。 MIN6集計（〜40万総細胞）は、明確にゲル内に見られている。ハイドロゲルの直径は、（バー= 1mm）の約6ミリメートルである。

図5。PEGDMヒドロゲルに集約されたMIN6細胞のシグナル蛍光低酸素症。 44時間20％O ₂でカプセル化し、インキュベーションに置かれた細胞は2％44時間のためのO ₂でインキュベートしてカプセル化された細胞は明らかに、ユビキタスな信号を表示しながら低酸素シグナルを（）表示されません。 （バー=100μmの）（B）。

ディスカッション

ここで紹介するメソッドは、非生理的条件の最小限の使用とPEGハイドロゲル中の細胞のカプセル化のための迅速かつ簡単な技術を提供しています。 PEGは、その生体適合性と修正を容易にするために非常に有用な封止材料を表します。光活性溶液中でPEGの比率の単純な変化は、例えば、孔径によって、機械などの圧縮率などのプロパティ、およびトランスポートのプロパティを調整することができる。また、PEGを簡単に側鎖の付加によって変更されます。 PEGハイドロゲルは、従って、in vitroでの研究のための有望な臨床デバイスと柔軟なプラットフォームの両方を表す

PEG -カプセル化された細胞の低酸素状態を追跡するための方法も提示されている。このメソッドは、低酸素症検出の簡略化のためと目的の細胞を犠牲にする必要性を回避するのに便利です。テクニックは、その私たちを作る様々な条件で細胞のさまざまな種類のに適用してもよい幅広いefulness。例えば、幹細胞の分化のための手がかりとして、低酸素は、幹細胞の微量培養に追跡することができる。しかし、このメソッドは、分散した細胞は、後で集約されているセルのシステムまたはシステムを分散させるために適用することができます。また、蛍光シグナルの検出には大きいか密度の高い組織では難しいかもしれません。

資料

試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント（省略可能
PEG	シグマアルドリッチ	309028 - 500G
メタクリル酸無水物	シグマアルドリッチ	276685 - 100ML
マイクロ波	エマーソン	MW8784SB
ボルテックス	サイエンティフィックインダストリーズ	SI - A236
塩化メチレン	シグマアルドリッチ	D65100 - 1L
ジエチルエーテル	シグマアルドリッチ	346136 - 1L
透析チューブ	スペクトラム	132640
	研究所
冷凍庫
凍結乾燥機	Labconco	7670521
真空ポンプ	ウェルチ	8917Z - 01
イルガキュア2959	チバガイギー	029891301PS04
HBSS	Mediatech	21から022 - CV
シリンジフィルタ	VWR	28145-477
RPMI 1640	Mediatech	*	*カスタム製剤
FBS	PAA研究所	A15 - 351
ペニシリン - ストレプトマイシン	Mediatech	30から002 - CI
アムホテリシンB	Mediatech	30から003 - CF
インキュベーター	サーモサイエンティフィック	3597	NAPCOシリーズ8000 WJ W / O2抑制
トリプシンEDTA	Mediatech	25から052 - CI
オービタルシェーカー	VWR	12620-926
UVランプ	三洋電機Denri	FLR40SBLB / M	two 40W、365nmのブラックライトブルーUV電球を保持しています
遠心	エッペンドルフ	5811 000.010 *	*注文番号。 モデル5810 R
顕微鏡	ニコン	TI - ND6 - PFS	556nm励起/ 586nm発光のためのフィルタセットを持つ