マウス肺樹状細胞の分離

要約

マウス肺樹状細胞の高度に精製された調製物が記載されている。特定の重点は、従来の樹状細胞サブセットの分離に与えられます。

要約

肺の樹状細胞（DC）は、侵入病原体の^1,2と同様に気道の免疫寛容の回答³の制御でのセンシングにおいて重要な役割を果たします。肺の樹状細胞の少なくとも3つの主要なサブセットは、マウスで記載されている：従来の^{DC（CDC）4、}形質^DC（PDC）5とIFN -産生キラー^{DC（IKDC）6,7。} CDCのサブセットは、肺⁸で最も顕著なDCのサブセットです。

DCサブセットを識別するために知られている一般的なマーカーは、CD11cは、I型も単球、マクロファージ、好中球およびいくつかのB細胞⁹上に発現される膜貫通インテグリン（β2）です。一部の組織では、マウスDCを識別するマーカーとして樹状細胞を使用すると、ほとんどのCD11c ⁺細胞は主要組織適合遺伝子複合体クラスII（MHC - II）の高レベルを表すCDCのサブセットを表す脾臓、のように、有効です。しかし、肺はものより異質な組織であるサイドDCサブセットは、MHC - IIの低レベルの試合CD11cは高レベルの表現の異なる細胞集団の割合が高いがあります。その特性上、ほとんどがF4/80、脾臓マクロファージのマーカーのその式に基づいて、CD11cは^ハイ MHC - II ^LOの肺の細胞集団は、潜在的なDC前駆¹¹として、肺のマクロファージ、最近10として同定されている。

マウスPDCには対照的に、肺の免疫応答におけるCDCの特定の役割の研究は、これらの細胞の分離に役立つ可能性が特異的なマーカーの不足により制限されている。したがって、この作品では、我々は高度に精製されたマウスの肺CDCを分離する手順を説明します。肺DCサブセットの分離は、呼吸器病原体だけでなく、肺の宿主免疫応答を誘発する環境要因に応答してこれらの細胞の機能に関する洞察を得るために非常に便利なツールを表します。

プロトコル

1。肺血流と、単一の細胞懸濁液

1. 大腿静脈を経由してケタミン/キシラジン麻酔の混合物（1mg /マウスケタミン1.8では、キシラジン0.19）と放血の腹腔内注射したマウスを安楽死させる
2. カットと軽く腹膜の外側の皮を引き戻すことによって胸腔を公開。心臓と肺の両方を公開するために、胸郭を切断してダイアフラムを開くに進みます。
3. EDTA - HBSS（カルシウム/マグネシウムを含まないHBSSで1mMのEDTA）を充填した5mlの注射器を使って静かに肺を灌流。 25 Gの針を接続し、右心室に針を挿入する。注入時の漏れを防ぐために、鉗子を使用して針の周囲心筋組織を固定します。一定の圧力を維持しながらゆっくりとソリューションを注入する。正確な血流は肺の膨張とピンク/白への色の変化になります。
4. この組織からの潜在的な汚染を破棄するように所属リンパ節を削除します。
5. 収集肺組織では、氷の上でペトリ皿に移し、カミソリの刃を使用して、小さな断片に切り刻む。
6. を5 ml /コラゲナーゼ消化液の肺を含むgentleMACS C管に接地された組織を転送する（コラゲナーゼタイプ1Aは0.5 mg / mlのプラスIV型ウシ膵臓のDNase 20 5％FBS、100 U / mlペニシリンおよび100μg/mlを含むHBSSでμg/ mlの/ mlのストレプトマイシン）。
7. 単一の細胞懸濁液を得るためにgentleMACSのdissociatorを使用してください。 m_lung_01：プログラムを選択してください。 30分間37℃でサンプルをインキュベートする。組織片を懸濁するためにチューブを5分ごとに振る。プログラムm_lung_02に進みます。
8. 4で335 x gで10分間、15mlコニカルチューブと遠心分離機にサンプルを移す℃にこのステップの後、4で全ての試薬と遠心分離を維持° Cは、細胞の生存率の低下を防止する。
9. 上清を捨て、室温で1分間ACK溶解緩衝液2 mlを加え、残りの赤血球を溶解する。 13で細胞を洗浄4で335 x gで10分間、冷たいPBS/0.5％BSAおよび遠心℃のミリリットル
10. コー​​ルドPBS/0.5％のBSAの5mlに上清、再懸合計セルを廃棄し、100μmのナイロンメッシュを徹底的に渡します。
11. トリパンブルー排除色素を使用して、総細胞数を決定します。

2。磁気分離とCD11c ⁺細胞の濃縮

1. 4℃で200 × gで10分間、単一の細胞懸濁液を遠心し、上清を捨てる。
2. 10 ⁸合計のセルごとに分離バッファー400μlの再懸濁し細胞ペレット（PBS、0.5％BSA、および2mM EDTA）。 4℃で30分間anti-CD16/CD32抗体（0.5μg/ 10 ⁶細胞）を使用して、結合ブロックのFcを介する非特異的抗体℃に
3. 4で200 × gで10分間冷分離バッファと遠心を10ml℃で細胞を洗浄分離バッファー400μlで細胞を再懸濁します。
4. 10 ⁸あたりのCD11cマイクロビーズを100μlを加えの合計のセルを。よく混ぜ、冷蔵庫で15分（2〜8℃）インキュベートする。
5. 4℃で200 × gで10分間冷分離バッファと遠心の10mlで細胞を洗浄し、上清を捨てる。
6. 冷分離緩衝液3mlで細胞ペレットを再懸濁します。
7. プログラムのposseldを選択することにより、autoMACS Proの^TMのセパレータを使用して磁気分離を実行します。陽性画分（0.5 ml）を収集する。

3。従来の樹状細胞（CDC）の分離

1. 抗CD11c PE - Cy7とanti-IA/IE（MHC - II）- FITC抗体で30分間、4℃でインキュベートし、濃縮CD11c陽性細胞懸濁液抗体の最適化された濃度は、細胞の0.5μg/ 10 ⁶です。
2. 4で335 x gで10分間、冷たいPBS/0.5％BSAおよび遠心℃で細胞を洗浄再懸PBS/0.5％BSAを0.5mlの中の細胞と40μmのナイロンメッシュを介してそれらを渡す。
3. に進んでください純度のモードでFACSのアリアのセルソーターを使用してセルを並べ替える。精製された細胞の損傷を防止するためにコレクションチューブにPBS/0.5％BSAを100μlのを追加。細胞選別のプロセスを通して冷蔵温度であなたの細胞を保つ。

4。単一の細胞懸濁液およびCD11c +細胞の濃縮を取得するための代替プロトコル

1. gentleMACSのdissociatorの交換では、ステップ1.5から接地肺組織は、37℃で1時間肺とインキュベートあたりのコラゲナーゼ溶液5 mlを入れた15 mlコニカルチューブに移すことができる渦は、細胞が15分ごとに組織断片を再懸濁するため。 inとout 20 Gの針に接続して、3 mlの注射器を介してサンプルを6-8回を渡すことによって、組織を混乱させる。プロセス中に泡を避ける、特に細胞の生存率が低下します。単一の細胞懸濁液が得られれば、1.8に進みます。
2. AutoMACSPro ^TM separaの交換でTorは、樹状細胞の細胞の濃縮のための磁気分離は、また、2つのMACSカラムを介して手動で細胞懸濁液を渡すことで実行できます。適切な列の選択は、サンプルサイズが異なります。

5。代表的な結果：

肺CDCは、CD11cは^ハイ / MHC - II ^ハイの細胞集団として同定されています。図に示す。 1は、CDCは、脾臓（4.8％）などのいくつかの他の組織に比べて1.4％の小さな割合を表しています。しかし、脾臓とは対照的に、肺のCD11c陽性細胞は、CDCとは異なる細胞集団を含む、MHC - IIの異なる量を表現する。単一細胞調製後、全肺の細胞の細胞収率はわずか1％以上がCDCのサブセットを表す、そこから60〜70パーセントの生存率と3.8から3.0程度× 10 ⁷細胞/肺であった。この割合は、総肺CDCは約10 tをインクリメントされた樹状細胞の磁気分離後に増加したオリジナルの準備（図2A）からのIME（> 16％）。しかし、MHC - II（CD11cは^HI / MHC - II ^LO、マクロファージ）の少量を表現するCD11cは細胞が肺CDCのサブセットと混合され、高汚染の細胞集団（> 70％）を表す。図に示す。 2B、それらの細胞は、CDCの純度は> 96％に達した細胞選別工程後に除去した。全体の手順の後にCDCの通常の収率は5 × 10 ⁴細胞/肺であった。顕微鏡写真は、代表的な樹状突起（上のパネル）と丸い細胞としてCDCの形態的特徴を示す。一方、CD11cは^ハイ / MHC - II ^LOは、マクロファージ（Mφ、下のパネル^）12の典型的な細胞の突起を示す形態学的に異なるサブセットを表す。

マウスの肺及び脾臓で図1の差動DC周波数 。肺C57BL / 6マウスからNDの脾臓組織をコラゲナーゼで収集し、処理した。コラゲナーゼ消化後、細胞を抗マウスCD11cは- PE - Cy7および抗マウスIA / IE - FITCで染色した。代表的なフローサイトメトリープロットでは、肺と脾臓におけるCDCの割合（CD11cは^HI / MHC - II ^ハイ ） ^を示す。

（2）マウスの肺からCDCの分離。マウスの肺の単一細胞の懸濁液を抗CD11cマイクロビーズで標識し、自動細胞分離装置を通過した。）代表的なプロットは、CDCの割合を示す図 （樹状細胞^ハイ / MHC - II ^HI）とマクロファージ（Mφ、CD11cは^ハイ / MHC - II ^LO）CD11cは濃縮後の集団。濃縮分画のさらなる染色は、抗マウスCD11cは- PE - Cy7および抗マウスIA / IE - FITCを使用して続く。二重陽性細胞をソートし、フローサイトメトリーによって分析した。へのその形態を特定する、セルが変更されたライト-ギムザ染色でサイトスピンし、染色した。B）代表プロットは、細胞選別後のCDCおよびMφの割合を示す。顕微鏡写真では肺CDCと肺のMφの代表画像を示す。バー=20μmのスケール。

ディスカッション

肺マウスDCの分離は、呼吸器の刺激の広い範囲の研究のための重要なテクニックです。これらの細胞を得る工程は、細胞の喪失だけでなく、細胞の生存と純度を防ぐための重要な手順が含まれています。コレクションの前に肺を灌流しても、末梢細胞を排除するだけでなく、汚染物質の赤血球を削減することができます。肺の多数が処理されるときに自動化された解離の使用はadvanteogusことが...

資料

試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント（省略可能）
ACK溶解緩衝液	インビトロジェン	D6 - 0005DG
抗マウスのCD11c（HL3）	BD Pharmingen社	5580979	PE - Cy7共役
抗マウスIA / IE（269）	BD - Pharmingen社	553623	共役FITC
Collangenaseタイプ1A	シグマ	9891 - 500mgの
セルストレーナー	BDファルコン	352340、352360
CD11cは（N418）マイクロビーズ	国内でのみ有効	130-052-001
DNase Iを	シグマ	D5025 - 150KU
ハンクス平衡塩類溶液	インビトロジェン	14170
HEPES緩衝液	インビトロジェン	15630
ペトリ皿は60mm	BDファルコン	351016
GentleMACS™Cチューブ	国内でのみ有効	130-093-237
ジェントルMACS dissociator	Miltentyi	130-093-235
AutoMACS - Pro™の	国内でのみ有効	130-092-545
FASCSアリア	BD