異なる系統にヒト胚性幹細胞（hESCの）の伝播との差別化のための3Dプラットフォームとしてのアルギン酸マイクロカプセル

要約

我々は、内胚葉とドーパミン（DA）ニューロンへの伝播および胚性幹細胞の分化のための効果的な3Dプラットフォームとしてマイクロカプセル化技術を最適化しました。また、移植時にホストからの細胞の免疫単離するための機会を提供しています。このプラットフォームは、他の細胞型に適応することができます。

要約

彼らは無限に培養で増殖し、身体の任意のセルのタイプに区別することができますので、ヒト胚性幹細胞（hESCの）は、細胞補充療法のための魅力的な代替供給源として浮上している。生体の様々なタイプも幹細胞のニッチ^1-3模倣 ​​微小環境を提供するために、幹細胞培養に使用されている。後者は、カプセル化などの3次元（3D）環境^4を提供^することにより、特定の系統だけでなく、組織の組織に細胞間相互作用、細胞増殖、分化を促進するために重要である。細胞のカプセル化の原理は、3D文化²で半透膜の範囲内で生きている細胞の捕捉が含まれます。カプセルの孔径よりも大きくなり、ホストからの抗体および免疫細胞^は、5除外されているのに対し、これらの膜は、膜を横切って栄養素、酸素と刺激の交換を可能にします。ここでは、事前に文化へのアプローチを送り、アルギン酸マイクロカプセルを用いた3次元微小でhESCのDAニューロンを区別します。我々は、カプセル化されたhESCの生存率を向上させる培養条件^2を変更しました。我々はこれまでに大幅にカプセル化されたhESCの生存率を高め、3DプラットフォームP160-Rhoの関連コイルドコイルキナーゼ（ROCK）阻害剤、Y-27632およびヒト胎児線維芽細胞エアコン血清代替培地（HFF-CM）を加えていることが示されているている細胞は胚体内胚葉マーカー遺伝子^1を表明した。我々は今、DAニューロンへのhESCと効率的な分化の伝播のために、この3Dプラットフォームを使用している。タンパク質および遺伝子発現解析は、DA神経分化の最終段階の後にチロシン水酸化酵素の発現の増加（TH）、DAニューロンのマーカーで、2週間後> 100倍を示した。我々は、アルギン酸マイクロカプセルを使用して、我々の3Dプラットフォームは増殖を研究するために有用であるという仮説を立てたとの差別化を指示様々な系統にhESCの。この3Dシステムでは、分化の過程でのhESCからフィーダー細胞を分離することができ、また、将来的には移植時の免疫単離するための可能性を秘めています。

プロトコル

以下の手順のすべてがクラスIIバイオセーフティキャビネット内無菌技術を使用して行われている。使用する試薬や機器は、以下の表に記載されています。

1。 1.1％アルギン酸（w / v）の準備

1. 滅菌した50mlのチューブにアルギン酸ナトリウム（高グルクロン酸含有量≥60％、粘度> 200メガパスカル秒、エンドトキシン≤100 EU / g）を精製した0.275グラムを追加し、25 mlの滅菌0.1パーセントゼラチン溶液、事前に準備を追加（0.5グラムgelatin/500ミリリットルミリ-Q H ₂ O、オートクレーブで溶解したもの）。
2. 部分的にアルギン酸塩粉末を溶解するのに約30秒間ボルテックスチューブは一晩、10×gで軌道ミキサー上にチューブを置きます（室温）。
3. アルギン酸塩溶液25mlの9％滅菌食塩（NaCl/50ミリリットルミリ-Q H ₂ O 4.5 g）の2.778ミリリットルを追加します。 5分95×gで遠心分離し、続いて約30秒間ボルテックスチューブを。
4. 4でアルギン酸塩溶液を保存°、短期記憶（1-2ヶ月）または-20℃で長期保管（年程度）のC。

2。 CaCl _2を析出槽の準備

1. ミリ-Q H ₂ Oの1リットルのCaCl ₂の14.7グラム^。2H ₂ OとHEPESの2.38グラムを溶かす
2. 7.4のpHレベルを調整します。
3. 0.22μmのフィルターを使用してソリューションを殺菌する。
4. 沈殿槽は室温（6-12ヶ月）で保存することができます。

3。カプセル化解除溶液の調製

1. ダルベッコのリン酸500mlに生理食塩水（D-PBS）をバッファ、0.5M EDTA 50mlと1M HEPES、5 mlを加える。
2. 20分間121℃0.22μmのフィルターまたはオートクレーブ°Cを使用して滅菌する。
3. 室温（6-12ヶ月）でカプセル化解除ソリューションを保存します。

4。血清代替物（SR）培地の調製

1. 前のカプセル化には、DEのように事前にSR培地を調製特定の試薬や機器の表にスクライブ。

5。 ROCK阻害剤の調製（Y-27632）

1. ヒトD-PBSで（HSA）血清アルブミン5 mM溶液を作るため0.1％Y-27632の粉末を希釈する。

6。カプセル化のためのhESCの準備

1. 37°C（光から保護）で2時間ROCK阻害剤（RI）の10μMを添加した培養培地で細胞を事前に扱います。
2. RI処理後、37℃で10分間accutaseで酵素的に二回D-PBSで細胞を洗浄し、培養プレートから細胞を除去する
3. 静かにピペットやセルスクレーパーで細胞をこすり、15 mlチューブに収集されます。 1:1の比率でSR培地でaccutaseを中和する。
4. 単一細胞懸濁液を調製し、40μmのフィルターを用いて中和し、細胞をフィルタリングし、新鮮な50 mlの遠心チューブに集める。
5. 血球計を使用して、ソリューション内のセルの合計数を計算します。
6. 5分間細胞懸濁液を95×gで遠心し、慎重に、その後上清を捨てる。予め温めておいた0.9％のNaClで細胞を洗浄します。 5分95×gで遠心し、上清を捨てる。

7。細胞のカプセル化

1. 14G×2 "IVカテーテルの軟質プラスチックチューブに取り付けられた1 mlの注射器を準備します。これは、図1に示すように、シリンジポンプにロードされて細胞懸濁液を吸引するために使用されます。
2. 125万細胞/ mlアルギン酸塩の密度で予め温めておいたアルギン酸塩溶液で細胞を再懸濁します。静かに注射器で混ぜて泡を作成することは避けてください。
3. 図1に示すように、ビーズジェネレータ、シリンジポンプとエアフローメータを設定します。これらのデバイスの詳細については、特定の試薬や機器の表に記載されています。
4. シリンジに吸引し、細胞と、IVカテーテルのプラスチックチューブを廃棄し、カプセルマシンにシリンジを接続します。 10 cmの隙間ががあることを確認してください図1に示すように、カプセル化マシンとコレクションポイントの終了をトゥイーンする。
5. 20ミリリットル/時間、8 L / minで、100 kPaの（カプセルのサイズは空気の流量を変えることによって変更することができます）の圧力の空気流量でシリンジポンプを設定することにより、細胞をカプセル化します。
6. カプセルを安定させるための7分間予め温めておいた沈殿槽の20mlを充填したペトリ皿（100×15ミリメートル）にカプセル化された細胞を収集します。
7. の0.9％NaCl 20mlを充填し50 mlの遠心チューブに穏やかな吸引によってカプセル化されたセルを転送します。
8. ゆっくり、上清を捨てるカプセルがチューブの底に沈殿することができます。の0.9％NaClで洗浄プロセスを繰り返します。
9. 培養フラスコにRI（10μM）、転送を補充し、37℃/ 5％CO ₂でインキュベート予め温めておいた培養培地中にカプセル化された細胞を再懸濁します。

8。 DAニューロンにカプセル化されたhESCの分化

ve_content ">カプセル化されたhESCが分化する前に3日間のRIで処理される。

1. シードマウス間質細胞株、0.1％ゼラチンコートT75フラスコおよび条件24時間の分化前にDA神経分化培地中のPA6細胞（材料表）で1.0×1cm ²当たり10 ⁴の密度でPA6細胞。
2. 50 mlの遠心管にカプセルを転送し、それらがチューブの底に沈殿することができます。
3. 上清を捨て、PA6細胞エアコンDA神経分化培地中でカプセルを懸濁します。
4. その後4日目のメディアの変化と隔日で28日間培養PA6細胞単層（7.5×10 ⁵ PA6細胞あたり9×10 ⁶ヒトES細胞）とカプセル化のhESC（各時間は培地の半分だけを変更します）。
5. PA6細胞と培養中の3週間後、残りの週に100 ng / mlのSHHおよび100 ng / mlのFGF8aでDA神経分化培地を補足するものです。

9。カプセル化されたhESCのカプセル化解除

1. 15 mlの遠心管にカプセルを吸引し、それらをチューブの底に沈殿することができます。その後、慎重に上清を捨てる。
2. 二回D-PBSでカプセルを洗浄します。その後、上清を除去するカプセルがチューブの底に沈殿しましょう​​。
3. カプセルへの解決策をdecapsulating 5ミリリットルを追加します。 4から5分間室温でインキュベーションする前に吸引を介して完全に懸濁液を混ぜる。
4. 3分95 xgでカプセル化が解除された細胞を遠心し、上清を捨てる。
5. 3分95×gで遠心分離し、続いてD-PBSで細胞ペレットを洗浄します。繰り返します。
6. カプセル化が解除された細胞はさらに、単層として培養されたまたは下流の分析に使用することができます。

10。代表的な結果

アルギン酸マイクロカプセルの直径は400から500μmである。カプセル内の細胞の数はestimatでした一回のカプセルの総数で割った細胞の総数を計算することによってED。したがって、カプセル当たり約5.0×10 ^4個の細胞を推定した。このことから、我々はカプセルに含めることができるセルの最大数は、約1.0×10 ⁵であることを想定しています。カプセル化されたhESCの生存率はカルボキシフルオレセインジアセテートsuccinimidlyエステル（CFDA）/ヨウ化プロピジウム（PI）アッセイを用いて使用することにより決定> 80％（図2）のとおりです。我々は1.1％に2.2％からアルギン酸塩濃度を減少させることによってと塩化バリウムの塩化カルシウムを沈殿槽を変更することにより、hESCのカプセル化の条件を最適化しました。これらの条件から、我々は1.1％アルギン酸カルシウムでカプセル化された細胞のみが生き残ることができることを示した、増殖し、in vitroで ¹ に EBを形成しています。さらに条件を最適化するために、培養媒体とRIの効果は、Y-27632を調べた。図2および3に示すように、データは、RIのpreventeを実証D解離誘導アポトーシスと細胞の生存と昇格クラスター形成^1,6を維持^した 。さらに、HFF-CM + RIで培養したカプセル化されたhESCの生存率は、RIの補充せずに他のグループよりも有意に高かった。しかしながら、これはSR + RIで培養されたカプセル化されたhESCに有意差はなかった。同様に、BrdUアッセイを使用して、細胞増殖は、クラスタ（図3）へと発展して、単一の細胞として25％から75％に増加した。 TUNELによるアポトーシスアッセイは、HFF-CMから取得したクラスタでは、TUNELのために主に陰性であったのに対し、SR培地で培養したマイクロカプセル内の単一の細胞（データは示さず）アポトーシスであることを明らかにした。ある程度までは、bFGFを添加したHFF-CMには、Y-27632が存在しない場合にカプセル化されたヒトES細胞の生存と増殖を促進した。しかし、Y-27632による治療カプセル化の前に（2時間）と後（追加の4日間）が著しく強化された生存率、増殖およびカプセル化されたhESCのクラスター形成1.1％アルギン酸カルシウムマイクロカプセルインチ

以前に我々は、カプセル化されたhESCのが正常胚体内胚葉¹に分化させることができることを実証した。ここでは、DAニューロンにカプセル化されたのhESCを区別するために、3Dのプラットフォームとして、細胞カプセル化の応用を検討した。カプセル中の胚様体（EB）が分化した直接的、記載の条件下でカプセル化解除に形成されたhESCのは、90％以上の生存率との文化の2-3日後に進行性の神経細胞の形態（図4）を示した。 neuroprogenitorマーカー、PAX6およびDA神経マーカー、THは、分化の7日間（図5A）の後にアップレギュレートされている間の遺伝子発現解析では、多能性マーカーのダウンレギュレーション、OCT4を示した。免疫蛍光染色は、分化したhESCは、7日目にPAX6陽性（> 80％）が、OCT4陰性であったことを明らかにした。さらに分化hESCの21日後のTH陽性（> 90％）ニューロン（図5B）を示した。ウェスタンブロット解析でも示された14日からTH発現のアップレギュレーション（図5C）PAX6発現は、21日後のダウンレギュレーションであった。比較では、同様の条件下で2次元（2D）の環境下で培養した細胞（例えば、前の分化〜3日2時間RI後処理のためにRIの前処理）PAX6陽性細胞（の割合が高いの> 80を維持して％）、分化期間中およびカプセル化（図5AおよびC）が提供する3D環境のようにTH陽性細胞（<60％）に分化のように効率的ではありませんでした。

ディスカッション

マウス胚性幹細胞とのhESCを使用して、いくつかの研究は、生体材料と組織工学^2,3の3D培養システムの利点を実証した。我々は、アルギン酸バリウムよりもアルギン酸カルシウムでカプセル化されたときのhESCが有意に高い生存率を示したので、アルギン酸バリウムと比較してhESCの増殖と分化を研究するのに適した3Dプラットフォームとしてアルギン酸カルシウムマイクロカプセルを使?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	注釈
アルギン酸塩（MVG UP Pronova）	NovoMatrix	4200101	高いグルクロン酸含有量≥60％、粘度> 200メガパスカル秒、エンドトキシン<100 EU / gで
ゼラチン	Sigma-Aldrich社	G1890-100G
0.9％のNaCl	バクスターヘルスケア	AHF7123
タイプJ1ビーズジェネレータ	Niscoエンジニアリング株式会社	SPA-0447
マルチフェイザーシリンジポンプ	新時代のポンプシステム株式会社	モデルNE-1000
EZIフロー医療計	ガスコーニュ語システム	G0149
Y-27632	メルク	688000
ヒト血清アルブミン	Sigma-Aldrich社	A4327-1G
Accutase	ミリポア	SCR005
14G×2 "IVカテーテル	テルモ	SR-OX1451C
ノックアウト-DMEM	インビトロジェン	10829-018	SR培地（基礎）の
グルタミン-I	インビトロジェン	35050-061	SR培地（2 mM）を用
ノックアウト血清代替物	インビトロジェン	10828-028	SR培地（20％）の
ペニシリン - ストレプトマイシン	インビトロジェン	15070063	SR培地（2.5 U / ml）を用
インスリン - トランスフェリン - セレン（ITS）	インビトロジェン	41400045	SR培地（1x）を用
β-メルカプトエタノール	インビトロジェン	21985-023	SR培地（0.1 mm）の
MEM NEAAソリューション	インビトロジェン	11140-050	SR培地（5mM）を用
グラスゴー最小必須培地	インビトロジェン	11710035	DA神経分化培地（基礎）の
ノックアウト血清代替物	インビトロジェン	10828-028	DA神経分化培地（10％）
ピルビン酸ナトリウム	インビトロジェン	11360070	DA神経分化培地（1mM）を用
MEM NEAAソリューション	インビトロジェン	11140-050	DA nのeural分化培地（0.1 mM）を
β-メルカプトエタノール	インビトロジェン	21985-023	DA神経分化培地（0.1 mm）の
ソニックヘッジホッグ（SHH）	R＆Dシステムズ	1314-SH-025/CF	DA神経分化（100 ng / ml）を用
線維芽細胞増殖因子8A（FGF8a）	R＆Dシステムズ	4745-F8-050	DA神経分化（100 ng / ml）を用