上皮成長因子受容体をターゲットとしたゼラチンベースのエンジニアNanovectorsを使用してヒト膵臓癌細胞における遺伝子デリバリーとトランスフェクション

要約

タイプBゼラチンベースの設計nanovectorsシステム（GENS）が膵臓癌の治療における全身遺伝子デリバリーとトランスフェクションのために開発されました。上皮成長因子受容体（EGFR）nanparticlesの表面上の特定のペプチドによる修飾により、彼らは、EGFR受容体をターゲットに可能性があり、そのような高い細胞内のグルタチオン濃度として、環境を還元条件下でプラスミド離します。

要約

32,000人以上の患者が年間米国で膵臓癌と診断され、この病気は非常に高い死亡率¹に関連付けられています。緊急の必要性は、膵臓癌患者の悲惨な生存統計で改善できる新たな臨床的に翻訳可能な治療戦略を開発するために存在します。癌の遺伝子治療は、途方もない約束を示しているものの、主要な課題は、持続的な導入遺伝子の発現につながることができる安全で効果的なデリバリーシステムの開発中です。

ゼラチンは、広く食品や医薬品に使用される最も汎用性の高い天然の生体高分子の一つである。我々の研究室からのこれまでの研究では、タイプBゼラチンは物理的な細胞内送達時にプラスミドと改良されたトランスフェクション効率のスーパーコイル構造を維持したDNAを、カプセル化することができることが示されている。ゼラチンのチオール化により、スルフヒドリル基は、ポリマーとのとFに導入することができます全体の複雑度ジスルフィド結合を安定化ナノ粒子、内ORMのジスルフィド結合は、細胞質ゾルのグルタチオンの存在のために壊れている、ペイロードは^2-5を放出される。ポリ（エチレングリコール）（PEG）修飾GENS、全身循環に投与、長期循環時間を提供し、優先的に強化された透過性と保持効果⁶により新生血管の超透過性に起因する腫瘍塊の対象とする。研究は⁷ PANC - 1ヒト膵臓腺癌細胞の上皮成長因子受容体（EGFR）の発現を介して示している。積極的に膵臓癌細胞株を標的とするためには、EGFR特異的ペプチドは、PEGのスペーサーを介して粒子表面上に結合させた^8。

ほとんどの抗腫瘍遺伝子治療は^、9セルのアポトーシス機能を復元するために、そのような野生型p53の腫瘍抑制遺伝子、（WT - P53）の管理に焦点を当てている10を制御する細胞増殖、の重要なシグナル伝達経路としてのp53機構機能。膵臓癌では、ほとんどの細胞がアポトーシス活性の損失を引き起こし、p53タンパク質に変異を持っている。 WT - p53の導入により、アポトーシスが修復される可能性があり、さらに癌細胞¹¹に細胞死を誘発する。

上記の理論的根拠に基づいて、我々は、EGFRがWT - p53遺伝子のデリバリーとPANC - 1細胞​​で評価した配信の効率化とトランスフェクションのためにペプチドで修飾されたチオール化ゼラ​​チンナノ粒子をターゲットに設計されている。

プロトコル

1。プラスミドDNAをカプセル化されたEGFR標的ゼラチンナノ粒子の調製

1. チオール化ゼラ​​チンの合成
   1. チオール化ゼラチンは、タイプBゼラチンの第一級アミノ基の2 -イミノチオランと共有結合によって、従来の方法^2-5のように合成した。ゼラチン1グラムを100mlの脱イオン水に溶解し、15時間室温で20 mgの2 - イミノチオラン塩酸塩とインキュベートした。
   2. 未反応の試薬は3時間ごとに、1mMのHCl溶液で5 mMの塩酸溶液、透析によって除去した。精製チオール化ゼラ​​チンは、4℃でさらに使用するために乾燥し、保存されている凍結された。
2. DNA含有ナノ粒子の調製
   1. 200mgをチオール化ゼラ​​チンは水と溶液のpHで溶解し、0.2 M NaOH溶液の添加によって7に調節した。 1mgのDNAは、ゼラチン溶液を加え穏やかに混合した。
   2. しながら冷却したエタノールを混合物に徐々に添加した高速で攪拌しながらソリューション。溶媒組成が75％を水力発電 - アルコール溶液に変化したときナノ粒子が形成された。
   3. ナノ粒子は、さらに0.1ミリリットルの8％（v / v）のグリオキサール溶液をゆっくりと添加する​​ことによって架橋された。未反応試薬を0.5ml、0.2Mグリシン溶液でクエンチした。
   4. ナノ粒子は、30分、16,000 rpmで超遠心した。ペレット回脱イオン水で洗浄し、ナノ粒子を精製した凍結乾燥し、4℃で保存した。
3. ナノ粒子の表面改質
   1. ナノ粒子を10 mg / mlの濃度で0.1 Mリン酸緩衝液（pH7.4）に懸濁させ、メトキシ- PEG -スクシンイミジルカルボキシメチルエステル（MPEG - SCM、MW 2000ダ）​​またはマレイミド- PEG -スクシンイミジルカルボキシの2倍の重量とインキュベートしたゆっくりと撹拌しながら室温で2時間メチルエステル（MAL - PEG - SCM、MW 2000ダ）​​。
   2. PEG化ナノ粒子を、30分間、16,000 rpmで超遠心分離で収集したS.ペレット回脱イオン水で洗浄し、ナノ粒子を精製した凍結乾燥し、4℃で保存した。
   3. MAL - PEG - SCM修飾されたナノ粒子は、10mg/mlの濃度で0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）に懸濁させ、ゆっくりと攪拌しながら室温で6時間EGFR特異的ペプチド（YHWYGYTPQNVI - GGGGC）の10％の重量でインキュベートした。
   4. ペプチド修飾されたナノ粒子は、30分で16,000 rpmで超遠心分離で収集した。ペレット回脱イオン水で洗浄し、ナノ粒子を精製した凍結乾燥し、4℃で保存した。

2。 EGFR標的ナノ粒子のキャラクタリゼーション

1. 粒子径とゼータ電位測定
   ナノ粒子は、1mg/mlの濃度で水に懸濁した。懸濁液をゼータサイザーナノ（マルバーン社）を用いて分析した。粒度分析は、25で90度の散乱角で実施させたC.ゼータ電位は25℃の水の誘電率、屈折率と粘度のデフォルトパラメータ℃で測定した
2. 走査型電子顕微鏡
   凍結乾燥ナノ粒子はアルミニウム試料のマウントにマウントし、スパッタコーティングされたパラジウムと導電性を向上させ、電荷の蓄積を最小限にする。サンプルは、3 kVで走査型電子顕微鏡日立4800電界放出で表面形態を観察した。
3. 化学分析用電子分光（ESCA）
   コントロールの凍結乾燥製剤、PEG化およびペプチド改変ナノ粒子は、ESCAで分析した。それは、国立ESCAおよび生物医学問題の表面分析センター（NESAC / BIO）、ワシントン大学（シアトル、ワシントン州）で行った。
   1. サンプルは、超高真空中に入れ、表面から二次光電子の放出を誘導低エネルギーX線ビームにさらされた。
   2. ビンの関数として検出される電子数をプロットして鼎エネルギー、観測スペクトルのピークは、それぞれの化学成分に割り当てられていた。
   3. C1sのスペクトルの高分解能の分析）は286.4mVでエーテル（CO）、炭化水素（285mVでCCやCH）からの正確な化学組成を決定するために行われ、カルボニル（288.1 mVでC = O）、および各機能の相対組成された曲線下の面積により決定された。
4. カプセル化されたプラスミドの安定性
   カプセル化されたプラスミドDNAの安定性は、プレキャストゲルで抽出されたDNAを実行することによって確認された。ナノ粒子は、同時にまたは連続して、別々にPBS（37℃で30分）、0.2 U / mlのDNaseを（室温で10分）を含む0.2 mg / mlのプロテ​​アーゼで消化した。次に、試料をウェルあたり18μLのボリュームで100ng/wellの濃度で1.2％アガロースゲル（GP）（E -ゲル、Invitrogen社、CA）上に負荷された。プラスミド裸をコントロールとしてロードされており、ゲルを30分間75 Vで実行されました。コダックデジタルX線検体（DXS）システムは、bを視覚化するために使用されたUV transluminescenceで扱う。
5. プラスミド荷重の決定
   プラスミドカプセル化されたナノ粒子は、℃で30分間、1mg/mlに懸濁させ、37℃で0.2mg/mlプロテアーゼで消化した。溶液を10分間、13,000 rpmで遠心分離し、上清をPicoGreenアッセイ（Invitrogen社）を持つプラスミド濃度のために収集し、テストされています。カプセル化率は、初期荷重0.5％（w / w）のでカプセル化されたプラスミド濃度を除して算出した。

3 PANC - 1膵臓癌細胞の in vitro トランスフェクション研究で

1. 細胞の培養条件
   PANC - 1およびCapan - 1膵臓の腺癌細胞株、SKOV3卵巣腺癌細胞株およびNIH - 3T3マウス繊維芽細胞株は、ATCCから入手した。 PANC - 1、NIH - 3T3は、37 L -グルタミン、ペン- strepおよび10％ウシ胎児血清に付属のDMEMで成長させた℃、5％CO _2、Capan - 1必須のDMEM中にはウシ胎児血清20％を供給。SKOV3、10％ウシ胎児血清に付属のRPMI - 1640で増殖させた。
2. EGFR発現のウェスタンブロット解析
   1. 細胞ライセートを2万個の細胞から採取し、BCAアッセイ（Pierce）を用いて、総タンパク質濃度について分析した。 NIH - 3T3は、ネガティブコントロールとSKOV3はEGFRの発現のポジティブコントロールとして使用されたとしても使用されました。
   2. 総タンパク質抽出物10μgを90分間135Vでプレキャストドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS - PAGE）システム上で実行されました。
   3. その後、ゲルをiBlotドライブロッティングシステム（インビトロジェン社）により、PVDF膜に転写した。
   4. 膜は、室温で1時間のTween含有トリス緩衝生理食塩水（TBS - T）の5％脱脂乳でブロッキングした。
   5. 膜は4℃で別々に一晩一次ウサギβ-アクチン抗体の1:1000希釈と一次ウサギのEGFR抗体の1:1000希釈で切断し、インキュベートした℃に
   6. 膜は、その後で2回洗浄し、TBS - Tと室温で1時間、TBS - Tで二次抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ標識IgGの1:2000希釈液とインキュベート。
   7. TBS - Tと水で余分な抗体を洗浄した後、4ミリリットルECL基質（Pierce、ロックフォード、イリノイ州、米国）が5分間メンブレンを加えてインキュベートした。
   8. 化学発光バンドはその後、コダックのデジタルX線検体（DXS）システムを用いて可視化した。
3. 異なる製剤で細胞の生存率の研究
   1. PANC - 1細胞​​を一晩補充したDMEMの200μLでウェルあたり10,000細胞で96ウェルプレートで増殖させた。
   2. 増殖培地は、0、0.5ナノ粒子、1、2、4、6 mg / mlの異なる濃度で含有する無血清培地と交換した。 1mg/ml PEI、既知の細胞傷害性カチオン性ポリマーは、陽性対照として使用した。
   3. 細胞は6時間200μLナノ粒子で処理し、20μLMTS試薬と完全な100μLに置き換えられた培地。
   4. 37℃で3時間後のインキュベーションの後、℃、5％のCO _2が 、ホルマザン産物の吸光度をBioTekのSynergyHTプレートリーダー（ウィヌースキ川、VT）で490nmの吸測定した。
   5. 細胞のパーセント生存率は100倍したネガティブコントロール（0mg/ml）からの相対ポリマー処理した細胞の吸光度の比として表され、ポリマーの濃度の関数としてプロットした。
4. 細胞の人身売買の研究
   1. ローダミンBイソチオシアネート（RBITC）はアミン基との反応によりチオール化ゼラ​​チンに結合するために使用されていました。透析および凍結乾燥後、RBITCはチオール化ゼラ​​チンは、ナノ粒子の調製に使用したラベルが付いて。
   2. 脱溶媒する前に、25μlのPicoGreenは1分間プラスミド1mgのと混合し、標識したプラスミドをゼラチン溶液に加えた。別の製剤は、従来の方法に以下の行われた。
   3. PANC - 1細胞​​は20万セルのpとガラスカバースリップを含む6ウェルプレートで増殖させたよくER。一晩増殖させた後、標識されたナノ粒子の2ミリリットルを無血清培地に1mg/mlの濃度で各ウェルに処理した。
   4. 異なる時点の後、15分から6時間に、培地を室温で15分間のインキュベーションのためHoest 33342（Invitrogen社）の1μg/mlのを含む培地と交換した。 4％パラホルムアルデヒド溶液の2ミリリットルを、細胞を固定するために各ウェルに置き換えられました。次いで、細胞をPBSで2回洗浄した。
   5. Coversilpsをガラススライドにマウントした。レーザー走査型共焦点蛍光顕微鏡は、固定された細胞の画像を撮影するために使用されていました。
5. pEGFPを- N1カプセル化されたナノ粒子と蛍光顕微鏡によるトランスフェクション効率の定性定量
   1. pEGFPを- N1プラスミドは、ナノ粒子に封入し、さらに治療のためのml当たり10μgのプラスミドと同等の濃度で無血清培地に懸濁した。
   2. PANC - 1細胞​​を6ウェルプレートcontaiで一晩増殖させたウェルあたり20万セルとガラスカバースリップを寧。 pEGFPを- N1プラスミドカプセル化されたナノ粒子の2ミリリットルを各ウェルに処理した。プラスミドの20μgを20μlのリポフェクチン、陽イオン性脂質トランスフェクション試薬と混合し、および未処理細胞をネガティブコントロールとして使用されていた間、それは、陽性対照として使用した。
   3. 細胞を6時間ごとに異なる​​処方でインキュベートした。
   4. 培地は、24、48、72および96時間後にトランスフェクションした培養液と細胞に置き換えられた。
   5. ポストトランスフェクション後、培地をHoest 33342（Invitrogen社）の1μg/mlのを含む培地に交換したし、室温で15分間細胞とインキュベート。
   6. カバーガラスは、ガラススライド上にマウントされ、細胞内のGFPの発現を蛍光顕微鏡で観察した。微分干渉コントラスト（DIC）と蛍光画像は、画像Jソフトウェアで処理されたオリンパスBX61顕微鏡とデジタル画像を使用して取得した。
定量
1. pEGFPを- N1プラスミドは、ナノ粒子に封入し、さらに治療のためのml当たり10μgのプラスミドと同等の濃度で無血清培地に懸濁した。
2. PANC - 1細胞​​を、ウェル当たり20万セルで6ウェルプレートで一晩増殖させた。 pEGFPを- N1プラスミドカプセル化されたナノ粒子の2ミリリットルを各ウェルに処理した。プラスミドの20μgは、ネガティブコントロールとして使用した陽性コントロールおよび未処理細胞として使用された20μlのリポフェクチン、陽イオン性脂質トランスフェクション試薬と混合した。
3. 細胞を6時間ごとに異なる​​処方でインキュベートした。
4. 培地は、24、48、72および96時間後にインキュベートした培養液と細胞に置き換えられた。
5. ポストトランスフェクション後、細胞溶解物を各ウェルから回収し、BCAアッセイ（Pierce）を用いて、総タンパク質濃度について分析した。
6. ウェルプレートは、COAだ各ウェルにモノクローナル抗GFP抗体の1:1000希釈液100μlとテッド。 2時間のインキュベーション後、プレートをPBS - 0.5％（w / v）の4回のTween - 80で洗浄した。
7. 300μlTBSブロッキングバッファーを各ウェルに添加し、2時間インキュベートした。その後、プレートをPBS - 0.5％（w / v）の4回のTween - 80で洗浄した。
8. 各群のタンパク質の30μgをプレートに添加し、4℃で一晩インキュベートした。その後、プレートをPBS - 0.5％（w / v）の4回のTween - 80で洗浄した。
9. アルカリホスファターゼの相対的な二次抗GFP抗体の1:2400希釈液100μlを各ウェルに添加し、1時間インキュベートした。その後、プレートをPBS - 0.5％（w / v）の4回のTween - 80で洗浄した。
10. 100μlのアルカリホスファターゼの基質を各ウェルに添加し、30分〜1時間インキュベートした。プレートは、405nmの吸光度をBioTekのシナジーHTプレートリーダーで測定した。
11. 発現したGFP濃度はマイルあたりナノグラムとして報告された総タンパク質のlligrams。
6. WT - p53のプラスミドカプセル化されたナノ粒子を用いたRT - PCRによるトランスフェクション効率の定性定量
   1. WT - p53のプラスミドをナノ粒子に封入し、さらに治療用10μgのプラスミド1ml当たりの濃度と同等と無血清培地に懸濁した。
   2. PANC - 1細胞​​を、ウェル当たり20万セルで6ウェルプレートで一晩増殖させた。 WT - p53のプラスミドカプセル化されたナノ粒子の2ミリリットルを各ウェルに処理した。プラスミドの20μgは、ネガティブコントロールとして使用した陽性コントロールおよび未処理細胞として使用された20μlのリポフェクチン、陽イオン性脂質トランスフェクション試薬と混合した。
   3. 細胞を6時間ごとに異なる​​処方でインキュベートした。
   4. 培地は48時間後にインキュベートした培養液と細胞に置き換えられた。
   5. mRNAは、T（高純度RNAアイソレーションキット（ロシュ、インディアナポリスを、）を使用して各ウェルから抽出され、光度計2000で測定したhermo科学、Wilminton、DE）。
   6. RT - PCRは、QIAGENを使用して行われたワンステップRT - PCRキット（QIAGEN、バレンシア、カリフォルニア州）。 p53のためのプライマー、バックス、Bcl - 2を、β-アクチン、DR5、Apaf - 1の、プーマ、サバイビンはEurofins MWGオペロン（ハンツヴィル、アラバマ州）により合成した。
   7. PCR産物をゲル電気泳動で評価し、cDNAのバンドのピクセルは、ImageJのソフトウェアを使用して分析した。
7. WT - p53と治療効果の定量は、カプセル化されたナノ粒子をpalsmid
   1. WT - p53のプラスミドナノ粒子に封入し、さらに治療のためのml当たり10μgのプラスミドと同等の濃度で無血清培地に懸濁した。
   2. PANC - 1細胞​​を、ウェル当たり20万セルで6ウェルプレートで一晩増殖させた。 WT - p53のプラスミドカプセル化されたナノ粒子の2ミリリットルを各ウェルに処理した。プラスミドの20μgは、陽性対照および未処理細胞であったとして使用された20μlのリポフェクチン、陽イオン性脂質トランスフェクション試薬と混合し、ネガティブコントロールとして使用。
   3. 細胞を6時間ごとに異なる​​処方でインキュベートした。
   4. 培地は、24、48、72および96時間後にインキュベートした培養液と細胞に置き換えられた。
   5. クロマチン凝縮/膜透過性/死細胞アポトーシスキット（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）は、異なる色素でアポトーシス細胞、ネクローシス細胞と生細胞を標識するために使用されていました。
   6. CompuCyteからICYS研究イメージングサイトメーター（ウエストウッド、MA）は、治療後のアポトーシスのレベルを分析し、比較するために使用された。蛍光顕微鏡像に基づいて、すべての色の強度を記録し、異なる集団を算出したのカウントと割合に対してプロット。
   7. 細胞に対する治療法がなかったことを意味ネガティブコントロールと比較し、倍の変化アポトーシス細胞は外に計算し、グラフに記載されていた。
   8. 3.8.8アポ- ONE均質なカスパーゼ-3 / 7アッセイキット（プロメガ社、マディソン、WI）は、pを調べるために使用されたWT - p53のプラスミドのトランスフェクション後のROアポトーシス活性。 1mg/ml PEIは、すべてのアポトーシス活性を排除するネガティブコントロールとして使用した。 、カスパーゼ3 /の基質である、ポストトランスフェクション後、細胞はローダミン110、ビス - （Z - DEVD - R110 N - CBZL -アスパルチル- L -グルタミル- L -バリル- L -アスパラギン酸のアミド）で処理した7、最大18時間。
   9. プレートは、520分の490 nmの蛍光用BioTekのシナジーHTプレートリーダーで測定した。緑色の蛍光の強度に基づいて、プロアポトーシス活性を評価することができます。

4。代表的な結果

1。 EGFR標的ナノ粒子の合成とChatacterization

スキームは図1に示したようにEGFR標的ペプチドで修飾されたナノ粒子を合成した。脱溶媒和が作成したナノ粒子は、粒子径とゼータ電位のために特徴づけられた。チオール化ゼラ​​チンから製造された粒子の平均粒径と表面電荷チオール化の程度が異なると、表1に記載されています。異なるナノ粒子の平均粒径は150から250 nmの間であった。チオール化ナノ粒子は、粒子内部のジスルフィド架橋の形成のために、ゼラチンナノ粒子に小さいサイズを可能性と比較している。さまざまな表面改質と、ナノ粒子のサイズが増加している。異なる製剤のゼータ電位は-20 mVの程度であった。 SEMの分析で、大きさ、表面形態とナノ粒子の球状の形状を観察したとサイザーの結果に対応する。ゼラチンナノ粒子とチオール化ゼラ​​チン粒子にDNAローディングの効率は95％（表1）よりも高かった。

上皮成長ファクトとチオール化ゼラチンナノ粒子の表面の変形例を示す図1。化学反応スキーム、R受容体（EGFR）ポリ（エチレングリコール）（PEG）スペーサーを介して結合ペプチド。

ナノ粒子のキャラクタリゼーション

製剤	ナノ粒子の直径（nm）の	ゼータ電位（mV）	プラスミドDNAの積載効率（％）
ゲルNP	151.4 ± 23.5	-17.1 ± 5.23	95.6 ± 2.2
SH -ジェルNP	132.6 ± 17.9	-24.6 ± 5.16	97.0 ± 3.8
SH -ゲル- PEG	179.0 ± 30.9	-22.3 ± 9.50	95.8 ± 6.5
SH -ジェルPEGペプチド	230.8 ± 41.5	-18.1 ± 4.02	94.8 ± 5.1

TABLE（1）制御とEGFR標的ゼラチンとチオール化ゼラチンナノ粒子の粒径、表面電荷、およびプラスミドDNAのカプセル化効率。

高解像度C _1S化学分析用電子分光法（ESCA）のスキャンは、ペプチドで修飾されたチオール化ゼラチンターゲティングチオール化ゼラチン（SH -ゲルNP）、PEG修飾チオール化ゼラチン（SH -ゲルPEG）とEGFRの表面の成分を分析するために使用されたナノ粒子（SH -ジェルPEGペプチド）。表2の結果は、ピークの285.0で、CH（炭化水素）、CO（エーテル）、およびC = O（カルボニル）グループの強度、286.3、および288.1 eVの、それぞれを示した。エーテルのCOの信号は、PEG修飾の後に増加し、ペプチドコンジュゲーションの後に減少している。窒素組成は、PEG修飾後に減少し、ナノ粒子にEGFRを標的とするペプチドの存在を確認したペプチドの変更、後に増加しているが。 ESCA分析では、さらにPEGとペプチド表面改質を認識しています。

ナノ粒子の表面組成の化学分析用電子分光

製剤	C 1S（％）	O 1S（％）	N 1S（％）
SH -ジェルNP	59.3 ± 0.8	22.9 ± 0.5	12.9 ± 0.1
SH -ゲル- PEG	58.2 ± 0.6	28.0 ± 1.2	9.5 ± 0.7
SH -ジェルPEGペプチド	56.7 ± 0.8	25.9 ± 0.7	12.3 ± 0.6
製剤	CC（％）	CO、N（％）	C = O（％ ）
SH -ジェルNP	51.5	26.6	21.9
SH -ゲル- PEG	17.1	63.1	19.8
SH -ジェルPEGペプチド	33.1	42.8	24.1

化学分析用電子分光法の表2。C _1S高解像度スキャン（ESCA）

カプセル化されたプラスミドの安定性を調べるために、ナノ粒子はsimuntaneouslyまたは順次に、プロテアーゼまたはDNase別々に処理した。電気泳動後、図2の結果は、すべてのナノ粒子内にカプセル化されたプラスミドDNAは裸のプラスミドDNAに匹敵するナノ粒子と安定、で保護されていることが示されている。調査これらはすべて、これらのナノ粒子がカプセル化とカプセル化の後にプラスミドの構造を保つことができることが示されている。

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図2。チオール化ゼラチンでカプセル化されたプラスミドDNAの安定性、PEG修飾はゼラチンチオール化、およびEGFRは、アガロースゲル電気泳動によってチオール化ゼラチンナノ粒子をペプチドで修飾された。ナノ粒子はナノ粒子のマトリックス内にプラスミドDNAのカプセル化を証明するためにプロテアーゼ0.2 mg / mlの処理した

2。膵臓癌細胞におけるベースラインのEGFR発現

二つのヒト膵臓腺癌細胞株（PANC - 1およびCapan - 1）はEGFRの発現のためのウェスタンブロットにより分析した。ヒト卵巣腺癌（SKOV3）とマウス線維芽細胞（（NIH - 3T3）細胞をそれぞれ、正および負の対照として選ばれた。β-アクチンは、タンパク質のローディングコントロールとして解析した。PANC - 1細胞​​は、Capan - 1に比べて高いEGFRの発現を示しているそしてこの細胞株は、in vitro試験は、次のために使用された

3。コントロールとSurfaの細胞毒性CE - Modifiedのチオールゼラチンナノ粒子

ナノ粒子の細胞間相互作用を評価するために、細胞毒性のアッセイは、ナノ粒子による治療後に実施された。図3の結果に基づいて、両方の制御と表面修飾ナノ粒子は、PEIの比較でも高濃度でPANC - 1細胞​​で比較的安全と生体適合性であった。以下の研究は1mg/mlナノ粒子を用いて行った。

としてテトラゾリウム色素（MTS）アッセイにより評価したPANC - 1細胞におけるナノ粒子製剤の濃度の関数として図3。パーセント細胞生存率

4。 PANC - 1細胞​​における受容体介在性細胞取り込み

EGFR標的化ペプチドとナノ粒子の受容体介在性エンドサイトーシス取り込みの表面のアクセシビリティを確認するには、システムは、各共同標識することにより設計されました細胞内のナノ粒子の取り込みと人身売買の可視化のための異なる蛍光でmponent。このラベリングシステムで、プラスミドDNA、ナノ粒子と細胞核を同定することができた。レーザー走査型共焦点蛍光顕微鏡は、15分から6時間に、異なる時点で画像を撮影するために使用されていました。異なる製剤の画像を比較することにより、ペプチド結合したゼラチンナノ粒子は、30分以内に高速取り込みとプラスミド放出を示した。この結果はさらにEGFRペプチドコンジュゲートナノ粒子は非特異的なエンドサイトーシスを受けた他のナノ粒子に比べて、はるかに高速だった細胞表面上のEGFR特異的ペプチドとEGFR受容体、間の迅速な相互作用を容易にエンドサイトーシスを受けたことを証明した。

細胞の人身売買に関する研究

図4共焦点蛍光顕微鏡PANC - 1細胞​​におけるDNA -カプセル化されたナノ粒子の取り込みと人身売買のalysis。 （赤=ローダミン標識ナノ粒子、緑=プラスミドDNA PicoGreen標識、および青= DAPI標識核）。レーザパワーは、下のパネルの最後の4つの図で7回以下であった。

5。強化緑色蛍光タンパク質との定性的および in vitroトランスフェクションの定量

図5と図6の蛍光顕微鏡分析におけるELISAは変更されずに、PEG修飾およびEGFRペプチドで修飾されたチオール化ゼラ​​チンナノ粒子の投与の際PANC - 1細胞​​において定性的および定量的なGFPのトランスフェクション効率を測定するために使用されていました。 EGFR標的ナノ粒子が提供するプラスミドはリポフェクチン - 複合DNAを含む他のコントロールに対して48時間、後にGFPの発現の最高レベルとなりました。

図5。GFPの発現ELISAによるnalyzedは、時間制御とEGFR標的ナノ粒子におけるプラスミドDNAの投与後の関数としてプロット。

GFPのトランスフェクションのためのFluoresence顕微鏡分析

図6。EGFP - N1の24、48、72および96時間後にトランスフェクション後のepifluoresence顕微鏡によるPANC - 1細胞に緑色蛍光タンパク質の発現の定性分析。リポフェクチン- DNA複合体は、ポジティブコントロールとして使用した。

PANC - 1細胞の6。野生型p53 を用いたin vitroトランスフェクションのプラスミド

EF -1α/ HTLVハイブリッドプロモーターと野生型p53プラスミドPORF - hp53は、E.から抽出された大腸菌とアポトーシス治療効果を研究するナノ粒子に封入。 PANC - 1細胞​​を6時間粒子、さらに24のためのポストトランスフェクション、48、72、および96で処理した時間。

p53は細胞内で、この機能を達成するためにアポトーシスを誘導する可能性があるため、多くの下流の転写因子が関与し、直接重量- p53の発現により調節される。それらの、バックス、カスパーゼ-3、カスパーゼ-9、DR5の中で、PUMAとApaf - 1のは、p53の発現がアップレギュレートされるとBcl - 2の間に、サバイビンがダウンレギュレートされるでしょう。これらの転写因子のレベルを調べるために、mRNAは48時間後にトランスフェクション後のPANC - 1細胞​​から抽出し、RT - PCRに使用した。製品は、ゲル電気泳動で評価し、バンドはImageJを用いて分析した。その結果に基づいて、図7に示した、サバイビンが他の治療法に比べてチオール化ゼラ​​チンナノ粒子を対象とEGFRの治療で有意に減少し、明らかな変化は、カスパーゼ-3、カスパーゼ9、DR5、のBcl - 2、Bax及び表現は見られませんでしたPUMAとApaf - 1increased標的ナノ粒子治療を。

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図7。WT - p53発現の下流の因子のmRNAレベルは、48時間後にトランスフェクション後、RT - PCRで比較した。

WT - p53のトランスフェクションの後、クロマチン凝縮/膜透過性/死細胞アポトーシスキットは異なる色素でアポトーシス細胞、ネクローシス細胞と生細胞を区別するために使用されていました。 CompuCyteからICYS研究イメージングサイトメーター（ウエストウッド、MA）は、治療後のアポトーシスのレベルを分析し、比較するために使用された。陰性対照と比較して、アポトーシス細胞倍の変化が出算出し、図8に示します。 EGFR標的チオール化ゼラ​​チンnanopaticlesは、トランスフェクション後の後の最も高いアポトーシス細胞集団を示している。カスパーゼ-3 / 7活性の分析はまたEGFR標的ナノ粒子が急速に内部化し、PANC - 1細胞​​のアポトーシス活性の最も高いレベルを持っていたことが明らかになった。

図8。ICYSを使用してコントロールWT - p53のトランスフェクションPANC - 1細胞·イメージングサイトメーターのプロアポトーシス活性のサイトメトリー分析

ディスカッション

制御とEGFR標的とチオール化ゼラ​​チンナノ粒子は、効率的なDNAのカプセル化と安定性を用いて調製した。これらのシステムのすべての粒子サイズは直径150〜250 nmの範囲であった。ゼータ電位は、このシステムはわずかに負のシステムであることを証明しています。 SEMの分析では、ナノ粒子のサイズはゼータサイザーの結果と同じであった。 ESCA分析では、PEGとペプチド表面改質を確認することができた。

ウェスタンブロット分析は、PANC - 1細胞は、高いEGFRの発現のレベルを持っていたし、この細胞株はin vitro試験のために使用されることを示した。 PEIと比較して、コントロールと表面修飾ナノ粒子の両方がPANC - 1細胞​​では比較的少ない細胞毒性であった。

細胞の人身売買の研究は急速な取り込みとPANC - 1細胞​​におけるEGFR標的ナノ粒子のプラスミド放出を示した。 EGFR標的ナノ粒子で表現するレポータープラスミドDNAの配信は、最高レベルの結果リポフェクチン-複合DNAを含む他のコントロールに対する相対的なGFP発現。同じシステムで、WT - p53のプラスミドでトランスフェクションは、下流のアポトーシス経路およびPANC - 1細胞​​において誘導急速にアポトーシスを誘発した。

これらの予備的な結果は、EGFRを標的とチオール化ゼラ​​チンナノ粒子は、膵臓癌の治療として遺伝子治療のための安全かつ効率的なDNAの配信システムとして提供できることを示唆している。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント
タイプBゼラチン、ブルーム225	シグマアルドリッチ	G9391
2 - イミノチオラン塩酸塩	シグマアルドリッチ	I6256
pEGFPを- N1プラスミド	ELIMバイオファーム	N /
PORF - hp53大腸菌	Invivogen	PORF - hp53
グリオキサール溶液（H 2 Oで40wt.％）	シグマアルドリッチ	128465
グリシン	シグマアルドリッチ	410225 - 250G
QIAフィルタープラスミドメガキット	QiageN	12281
ベックマンLE 80K超遠心機	ベックマン	N /
フリーゾーン6リットルコンソールのフリーズドライシステム	Labconco	7753020
MPEG - SCM、MW 2000ダ	ライサン島	MPEG - SCM - 2K - 1G
MAL - PEG - SCM、MW 2000ダ	Jenkemテクノロジー	A5001 - 1
ゼータサイザーナノ	マルバーン	ゼータサイザーナノZS
日立4800電界放出走査型電子顕微鏡	日立	S - 4800 UHR FE - SEM
クワント- IT PicoGreen 二本鎖DNAの試薬とキット	インビトロジェン	P7589
リポフェクチントランスフェクション試薬	インビトロジェン	18292011
DMEM	Mediatech cellgro	10 013 CM
RPMI	Mediatech cellgro	50 020 PB
ピアースBCAタンパク質アッセイキット	サーモサイエンティフィック	23225
iBlotドライブロッティングシステム	インビトロジェン	IB1001
X細胞SureLockミニセルとX細胞IIブロットモジュールキットCEマーク	インビトロジェン	EI0002
ピアースECLウェスタンブロッティング基質	サーモサイエンティフィック	32109
コダックデジタルX線検体（DXS）システム	コダック	N /	;
CellTiter 96 AQ ueous Oneソリューションの細胞増殖アッセイ（MTS）	プロメガ	G3580
BioTekのSynergyHTプレートリーダー	BioTekの	N /
光度計2000	サーモサイエンティフィック	N /
ワンステップRT - PCRキット	キアゲン	210212
クロマチン凝縮/膜透過性/死細胞アポトーシスキット	インビトロジェン	V23201
アポ- ONE均質なカスパーゼ-3 / 7アッセイキット	プロメガ	G7790
Hybaid PCRスプリントサーマルサイクラー	サーモサイエンティフィック	N /
EGF受容体抗体	セルシグナル伝達	2232
β-アクチン抗体	細胞シグナリング	4967
抗ウサギIgG、HRP結合抗体	細胞シグナリング	7074
マウスモノクローナルGFP抗体	ノーバスバイオ	NB600 - 597
ヤギポリクローナルGFP抗体（アルカリホスファターゼ）	ノーバスバイオ	NB600 - 1502
ホスファターゼ基質キット	サーモサイエンティフィック	37620