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ザショウジョウバエ卵室は、mRNAの局在化のメカニズムを研究するための優れたモデルです。ローカライズのプロセスを支える動的なイベントをキャプチャするために、生きている組織の急速な高分解能のイメージングが必要となります。ここでは、最小限の中断でライブサンプルの解離およびイメージングのためのプロトコルを提示します。
ライブセルイメージングは、このような軸仕様、細胞分化と器官形成1などのトピックを調べるためにモデルとして使用されるショウジョウバエの多くの組織に適用される重要なテクニックです。実験試料の正しい準備は非常に重要、しばしば無視され、ステップです。準備の目標は、生理学的な妥当性を確保するために、最適な撮影条件を確立することです。組織の生存を維持するためには、脱水、低酸素症、発熱、または媒体の劣化2を避けることが重要です。
ショウジョウバエの卵室は、体のパターニング、mRNAの局在と細胞骨格の組織3,4から、限られた関連はなく、疑問を調べるための十分に確立されシステムです。初期および中期段階の卵室では、ハロカーボンのオイルでマウントすると、それは酸素の自由な拡散を可能にすることで生存のために良いですが、脱水と低酸素症を防ぎ、顕微鏡検査のために優れた光学特性を持っています。イム蛍光タンパク質の老化と卵室または5月7日標識RNA、タンパク質または抗体の物理的な注入に導入遺伝子の導入によって可能性があります。たとえば、動物のゲノムにMS2の構造の追加は、卵母細胞8のmRNAのリアルタイム観測を可能にします。これらの構造は、コートタンパク質9 MS2バクテリオファージRNAステムループの相互作用を活用したmRNAのin vivo標識を可能にします。
ここでは、雌のショウジョウバエから個々の卵管と卵室を分離するだけでなく、卵巣の抽出のためのプロトコルを提示します。 ショウジョウバエの卵形成の詳細な説明については、アランC. Spradling(2009年再版1993年)10を参照してください。
解剖のために前に1。 ショウジョウバエの準備(E. Gavis、プリンストン大学によると)
注:別の方法として、プレミックス別の容器に貼り付け、酵母やスパチュラでバイアルにペーストを追加します。
(2) ショウジョウバエの卵巣切開
3。の分離卵管
注:各卵巣は、文字列10のビーズのように配置の異なる段階の6から10卵室で構成された約16卵管が含まれています。
注:前に卵管を分離するため、照明は、試料に浅い角度で当たるように解剖顕微鏡で光源を調整します。これは、サンプルにコントラストを与え、若い段階の卵室の可視化を可能にします。
注意:古い段階が完全に卵巣から分離するには大きすぎるとして、個々の卵管が若い段階(ステージ10〜胚腺)の間に解除されます。
注:解剖プローブと後期の卵母細胞を穿刺すると、油中に漏れて細胞質になり、個々の卵管の抽出が非常に困難になります。後期段階の卵母細胞がパンクしている場合は、新鮮な卵巣に移動します。
注:これは、むしろ実験のためにハエのn個の数を増やすことが少なくハエから両側の卵巣を解剖よりも、いくつかのハエから一卵巣それぞれを詳細に分析することをお勧めします。
注:卵巣小管の乱暴に取り扱うと、不健康な卵母細胞になり、実験の成果物につながる可能性があります。
注:卵子は卵巣(Fを図7Eの比較)から解剖された後、40分を強調するため、表現型の変化を表示するために開始されます。
4。分離し、個々の後期卵室(E. Gavis、プリンストン大学によると)
注:後期の卵室を解剖しながら卵をパンクチャリングは、iを解剖してのように非難するようではありません若いステージのndividual卵管。
注:ステージ14卵室では、オリエンテーションのための背の付属を把握するために鉗子を使用しています。
5。注射の準備
注:中間段階の卵母細胞の注入は、東洋卵管垂直にカバースリップの長軸に。
6。蛍光RNAの注入
始める前に:噴射装置と注射針が視野の中心上に配置されるように、マイクロマニピュレータの制御を設定します。
注:ポイント訪問機能を備えた自動ステージを使用している場合は、注射のため8月9日卵開始する前に、すべてのステージをマークすることをお勧めします。これは、簡単に訪問し、選択した卵母細胞の注入を可能にします。
注:正しく実行したときに全体の注入プロセスは10秒未満を取る必要があります。刺すまたは卵母細胞への針の内部に残る大規模な卵室への深刻なダメージになります。
注:注入しながらミスが行われた場合は、次のマークされた卵母細胞に移動します。破損した卵母細胞に時間を無駄にしないでください。
注意:針は注射セッション中に目詰まりがあります。このケースでは、カバースリップ上に油でガラスの破片に隣接して針を移動します。ウィットHと同じ焦点面のガラスと針が、ゆっくりガラス(図6H)に針をRAM。針を注入ボタンを押すと任意の流体終了した場合、針の先端を見てuncloggedされていることをテストします。
注:時間の延長期間は卵室の分離と卵母細胞の注入の間で経過した場合は、卵母細胞がストレスに関連付けられた表現型の変化を注入し、示すことが困難になります。同様の問題は卵母細胞または過剰量の注入(図は6Iを比較して、J、K)の乱暴な取り扱いで発生する可能性があります。
7。イメージング実験デザインを生きる
8。代表的な結果
in vitroで合成されたアレクサ-546 GRK RNAはMe31B :: GFP卵室(図7A)に注入した。 RNAは卵母細胞の背側前方に局在し、核の周りにキャップ(図7B)を形成する。 RNAの局在化の例についてはマクドゥーガルN.らを参照してください。 (2003)11。
蛍光標識タンパク質(タウ-GFP、図7C)またはRNAタギングシステム(GRK * mCherry、図7D)を発現半ばおよび後期段階の卵母細胞を注入することなく撮像することができます。
図1。
図2。
図3。
図4。
図5。
図6。
図7。
ライブセルイメージングは、リアルタイムで細胞プロセスを調べるための強力なアッセイである。単純な明視野観察に加えて、興味のあるタンパク質とRNAの蛍光標識の添加は、多くのブレークスルーをリードしている。ここでは、遺伝的および生化学的アッセイと組み合わせて利用することができる画像個々の生きている卵母細胞のプロトコルを概説しています。
このプロトコルでは、我々はまた、実験的に注射することによって生きている卵母細胞を操作する方法について説明します。アッセイに直接RNAの局在化(ボールとデイビス、未発表)および蛋白質6の機能を阻害する抗体に二次構造の能力を蛍光標識したRNAを合成し、in vitroでを含む材料を注入するための多くの可能性があります。今後はおそらく他の標識成分との分子メカニズムをテストすることが可能になり生きている卵母細胞への細胞機械の導入が表示されます。
t "は>生きている細胞で作業する場合、組織の生存と健康が不可欠です。保存このプロトコルでは、我々は卵室のストレスにつながることができますステップの数を指摘している。たとえば、オイルがイメージングのための優れているにもかかわらず、油の拡張文化が卵室にストレスにつながることができます。これは簡単に核の形態と位置を調べることによって、明るい界曝露下で監視することができ、ストレスの下で歪曲水疱ます。卵母細胞膜は、(Figure7Fに(ストレスのない)図7Eの比較( ))を強調した。ステージ9卵室は、複数の時間にわたってRNAの局在化と境界細胞の移動12を示しています。ただし、ステージ7月8日卵室が卵巣の約40分から削除された後のハロカーボンオイルに悪影響を示すことが開始されます女性の後期段階の卵室、ステージ11から14は、ため、これらのステージ13で卵胞細胞から卵の殻の分泌油または水性媒体のいずれかで正常に開発することができます。これはレポされている水性昆虫培地にインスリンの添加は、最大で6時間14 germariaまでの14時間〜15のためにステージ9卵母細胞を維持することができますrted。それは卵母細胞を強調し、その可能性を低減し、すべてのケースでは、卵室の積極的な操縦は、避けるべきである。イメージング卵室が少ないと治療に注意しながらそれぞれが穏やかに最適な可能性を確保するための最良の方法です。我々は、開示することは何もありません。
この作品は、I.デービスにウェルカムトラストシニア·リサーチ·フェローシップによってサポートされていました。
解剖に使用されるツールは、きれいになる必要がありますが、オートクレーブ滅菌する必要はありません。 EtOHでツールを拭いて、それらを開始する前に乾燥させます。
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