X線CTを用いたマウス肥満モデルにおけるセグメンテーションおよびFATボリュームの測定

要約

脂肪含有量分析は、定期的にマウス肥満モデルを活用した研究で実施しています。小さな動物のCTイメージングと解析の新たな方法は、長手方向のディテール豊かな脂肪含有量分析のために提供しています。小さな動物のCTイメージング、分析、および可視化を実行するためのステップの手順で、ここでは詳細なステップです。

要約

肥満が増加罹患率と死亡率と同様に生活の質の減少メトリックに関連付けられています。病気に貢献する正確な根本的なメカニズムは、現在線引きされているものの^1の両方の環境要因と遺伝的要因は、肥満に関連付けられています^。2,3いくつかの小さな動物が肥満のモデルが開発されており、様々な研究で採用されています^。4これらの実験に不可欠なコンポーネントは、様々な条件の下、地域および/ ​​または総動物性脂肪含有量データの収集が含まれます。

肥満の小さな動物モデルでの脂肪含量を測定するための伝統的な実験方法は、（例えば、二重エネルギーX線吸収法（DEXA）、または（MR）磁気共鳴）侵襲（例えば、脂肪沈着の ex vivo での測定）と非侵襲的なプロトコルが含まれその各々は、相対的なトレードオフを示します。脂肪含有量を測定するための現在の侵襲的な方法は、詳細を提供することがあります臓器や地域特有の脂肪の分布が、犠牲にするために被験者は、長手方向の評価を排除します。逆に、現在の非侵襲的戦略は、臓器や地域、特定の脂肪分布のために制限された詳細を提供していますが、貴重な長手方向の評価を有効にしてください。専用の小動物X線コンピュータ断層撮影（CT）システム、およびカスタマイズされた分析的手続の出現で、脂肪分布と縦プロファイリングの臓器や地域固有の分析の両方が可能な場合もあります。最近の報告では、生きたマウスの脂肪の in vivoでの長手方向のイメージングのためのCTの使用を検証しています^。5,6ここでは、一緒にケアストリーム分子イメージングAlbira CTシステムを利用する脂肪/総体積測定、分析、可視化を可能にする修正方法を提供PMODとVolviewソフトウェアパッケージである。

プロトコル

1。動物

1. 結果は以下に報告するため、3 C57BL/6Jマウスと4 B6.V-LEP ^OB / Jマウスは、ジャクソン研究所（バーハーバー、メイン州、米国）から入手した。 B6.V-LEP ^OB / Jマウスは肥満の最も初期のモデルのいずれかを表しており、研究が盛んに残っています。 B6.V-LEP ^OB / Jマウスでは増加した脂肪細胞のサイズと数によって特徴づけ表現型を示し、野生型マウスよりも3倍以上の重量を量ることができます。ここ^{7,8、B6.V-LEP OB} / Jマウスは正として用いたCTベースの脂肪含有量測定のためのAlbira CTシステムの実現可能性を説明するために肥満の表現型を制御します。
2. 動物は約12週齢に達したときのイメージングを行った。 （B6.V-LEP ^OB / Jマウスにおける肥満は生後4週間後にマニフェストです）。
3. マウスは、イソフルラン（2.5％流量）で麻酔し、イメージングのためのノーズコーンのセットアップを経由して2.5％の下に保った。不定冠詞imalsはAlbiraイメージステーションに付属の標準的なラットのベッド（M2M Imaging社クリーブランド、オハイオ州）で発生しやすく配置した。手足は一様CT取得のための胴体から横方向に配置された。
4. 画像の取り込みが完了した後、マウスはノーズコーンから削除され、歩行まで回復ケージに戻した。

2。画像の取得と復元

1. 画像の買収はAlbira CTシステム（ケアストリーム分子イメージング、ウッドブリッジ、CT）を使用して実行されます。マウスは、イソフルラン（2.5％流量）で麻酔し、イメージングのためのノーズコーンのセットアップを経由して2.5％の下に保った。買収は600の突起を使用して、115ミリメートルの長さのベッドをスキャンするために行われた。 X線源は45 KVPの200μAと電圧の電流に設定され、強化するためにビームを0.5ミリメートルのAlフィルタを使用しました。
2. CTの設定についてはおおよその放射線深い線量当量は220 mSvであった、と浅い線量当量は、357.4 mSvであった。これらの用量は20倍の報告よりも低いLD50値を超えている^9。
3. 画像は "標準"パラメータを使用してAlbiraスイート5.0再構成を介してFBP（フィルター逆投影）アルゴリズムを使用して再構築さ​​れます。これらを組み合わせた買収と再建の設定は、全体の動物の解析のために十分なものとみなさ125μmの等方性ボクセル、最終的なイメージを生成します。詳細な地域特定の分析のために、35μmの等方性ボクセルによる再建は、90μmの最終的な解決のために選択することができます。

3。画像解析

画像解析は、PMOD（PMODテクノロジーズ株式会社、チューリッヒ、スイス）解析ソフトウェアを使用して実行されます。画像は、FATボリュームの合計量としての密度初の組織に従って、PMODでセグメント化されています。

3.1画像は、計算の要求を最小限にするために分析のために低下する可能性があります。

1. 減らすために、メインビュー]タブに移動します。
2. [ツール]> [ 減らします 。
3. 2 2、2、YをXを選択し、Z。
4. 交換して確認してください。
5. Runを選択します 。

メッセージ：縮小が完了すると、 " バウンディングボックスが変更されます " が表示されます。

3.2画像は、後続のボリューム·オブ·インタレスト（VOI）解析用のベッドとノーズコーンの要素を排除するためにマスクすることができます。

1. マスクするには、 プレーン、レイアウト、回転、ミラー、3Dマーカー > 飛行機＆レイアウトに移動します。
2. 表示面Zを選択します 。
3. Z平面のノーズコーンにスクロールします。
4. メインVOI]タブを選択> 頂点を描画します 。
5. ベッドと鼻コーン動物 - を除く鼻の周りに関心領域（ROI）を描画します。
6. 選択する実際のROIをコピーします 。
7. 次のスライスに移動し、鼻の関連プレーンを介してバッファからROIを貼り付けます 。
8. 必要に応じてROIを調整するために頂点の編集グループを使用しています 。
9. ノーズコーンを越えた最初の飛行機でのROIの削除]を選択します 。
10. ノーズコーンを越えた最初の飛行機で、動物の胴回りを（動物のベッドを除く）を包含する新しいVOIを生成します。
11. VOIツール > マスキング＆代数に移動します。
12. 提供するダイアログボックスに-1000を入力してください。
13. 選択したVOISボタン外マスクのボクセルを選択します 。

メッセージ： "取り返しのつかないデータ操作が続行しますか？"表示されます。

14. [はい]を選択します。
15. プレーン、レイアウト、回転、ミラー、3Dマーカー > 飛行機＆レイに移動します。アウト。
16. すべての飛行機を表示]を選択します。
17. 整合性のためにVOIを調べます。
18. 保存を選択します 。
19. 分析として保存します。
20. ファイル名の接頭辞を変更します。

3.3まず、セグメント全体の動物のボリュームのイメージ：

1. [ツール]> [外部]を選択します。
2. セグメンテーションチェックボックスをオンにします。
3. -300〜3500（腹部の脂肪領域の密度範囲から派生した濃度範囲基準）の範囲を入力します。
4. セグメンテーションを実行する]を選択します。
5. セグメンテーションの整合性を調べます。
6. [OK]を選択します。
7. ROIの削除]を選択します 。
8. VOIの統計情報を選択します。

報告された統計は、総容積を表しています。

9. 報告されたボリュームを記録します。

3.4次に、セグメント脂肪ボリュームのイメージ：

1. 脂肪ボリュームセグメンテーションのための非セグメント化されたマスク画像に戻ります。
2. 保存されたマスクデータファイルをロードするには、） 負荷ウィンドウで解析チェックボックスをオンにします。
3. [ツール]> [外部]を選択します。
4. セグメンテーションチェックボックスをオンにします。
5. -200〜-50の範囲を入力します。
6. セグメンテーションを実行する]を選択します。
7. セグメンテーションの整合性を調べます。
8. [OK]を選択します。
9. VOIの統計情報を選択します。

報告される統計情報は、FATボリュームを表します。

10. 報告されたボリュームを記録します。
11. 保存を選択します 。
12. 分析として保存します。
13. ファイル名の接頭辞を変更します。

オプション：スキン/周辺密度が残っている場合は、以下の"収縮および膨張"プロトコルは、VOI解析のために、これらの領域を除去するために実行されるかもしれません。

1. [ツール]> [外部]を選択します。
2. 形態素チェックボックスを選択します。 形態ビューが表示されます。
3. 侵食を選 ​​択します 。
4. [OK]を選択します。
5. [ツール]> [外部]を選択します。
6. 形態素チェックボックスを選択します。 形態ビューが表示されます。
7. 拡張を選択します。
8. [OK]を選択します。

4。 CT画像の可視化

4.1 VolView V3.2（Kitware、クリフトンパーク、ニューヨーク、アメリカ合衆国）は、セグメント化された画像のレンダリングされた3Dビジュアル表示を作成するために利用された。

形式を分析するに設 ​​定されたCTデータを開きます。
1. ポップアップウィンドウのデフォルト設定を使用しています。
2. プラグインメニューを開きます。
3. ユーティリティの下に、 ボリュームをマージを選択します。
4. リスケールコンポーネントをオフにします。
5. 第二の入力を割り当て]をクリックします。
6. 番目の入力のためにセグメント化された脂肪のデータを選択してください。
7. ポップアップウィンドウのデフォルト設定を使用しています。
8. プラグイン適用]をクリックします。
9. 対象マウスの大きなビューをダブルクリックしてボリュームのビューウィンドウを表示します 。

カラー/不透明度]タブから4.2に戻ります。コンポーネントのドロップダウンボックスには、現在編集されているデータセットを指します。 2つのスライダタブの下部に位置し、オーバーレイ内に設定され、各コンポーネントのデータの相対的な明るさを決定し、値が0から1を使用しています。コンポーネント1番目のために電子CTは、我々はグレースケールのカラースキームを使用することを好む。色を変更するには：

1. スカラカラーマッピング]セクションで 、カラースライダのいずれかをダブルクリックします。
2. スライダーを削除するには、ボックスの外にドラッグします。
3. 新しいスライダーを追加するには、スライダの領域内の任意の場所をクリックします。
4. スライダーの1つを削除します。
5. 左のカラースライダー黒 （スカラー値（S）= -19000）を作る。
6. 右側のカラースライダーホワイト（（S）= 15000）を作る。
7. スカラの不透明度のマッピング]ボックスで、ボックス内をクリックして新しいポイントを作成します。これは、ウィンドウに3つのポイントの合計を与える。
8. 中間点では、（S）は〜-3000、0〜不透明度（O）の値に変更します。
9. ウィンドウの右側では3番目のポイントを選択します。
10. 約32000（S）に変更し、 0.25へO。
11. 最初のポイントは、左にどこでも不透明度の値が0に設定されていると同じくらい長くなることがあります。
12. 脂肪の外観を編集する必要があり、コンポーネント2に変更します。
13. 赤に脂肪が偽カラーマップを左に色相（H）スライダーをダブルクリックしてスライドさせることによって、 赤色にカラースライダのそれぞれを変更します。他のほとんどは、脂肪の外観を調整するために必要とされるべきである。

CT、脂肪、およびオーバーレイを表示する3つのパネルの回転ムービーを作成するには、4.3：

1. あなたが直面しているバックの直立位置に被写体マウスをクリックしてドラッグします。
2. コンポーネントの重量の下で、唯一のCTスキャンを表示するには、 コンポーネント2〜0の値を設定します。
3. レビュー>カメラをクリックします 。
4. フレームのfoの数を選択しrの回転ムービー（現在のケースのために、我々は"36"を選んだ）。
5. 360度のX回転の値を変更します 。
6. 作成を選択します 。
7. ポップアップダイアログボックスで、CTという名前の新 ​​しいフォルダを作成し、回転の一連の画像が出力されたTIFF形式でファイルを保存します。
8. 個々のフォルダにするたびにそれらを保存し、脂肪画像のと同様に、オーバーレイ脂肪/ CT画像に対して、この手順を繰り返します。

4.4 ImageJのV 1.43uはVolView出力画像を使用して、回転ムービーファイルを生成するために使用されていました。

1. ImageJので、 ファイル>インポート>イメージシーケンスを選択します。
2. CTのフォルダ内の最初のイメージを選択します。ソフトウェアは自動的に他のファイルを検出し、スタックとして、それらを開きます。
3. 脂肪とオーバーレイのシーケンスを開くために繰り返します。
4. 分析でROIマネージャを開く>ツール> ROIマネージャー。
5. 不必要な背景の画素を除いた、対象マウスの周りにROIを描画します。
6. ROIマネージャで 、ROIを追加 ]をクリックします。
7. 異なるイメージシーケンスを選択します。
8. ROIマネージャで 、画像に適用するROIをクリックします 。この方法で、トリミングされた各スタックは完全に一致します。
9. ROIは、すべてのスタック上にある場合、ROI内で右クリックします。
10. 重複を選択します 。
11. 画像の残りの部分からROIを分離するために重複したスタックのチェックボックスをオンにします 。
12. イメージを拡大スタックを閉じます。
13. すべての3つの画像シーケンスに対してこの手順を繰り返します。
14. 画像に移動>スタック>ツール>一緒にスタックを結合する結合します 。
15. スタック1のCTを選択します 。
16. スタック2の脂肪を選択します。
>繰り返し、 スタック1スタック2のオーバレイのために組み合わせてスタックを選択します 。
17. 画像ウィンドウの左下隅にプレイを選択してプレビューすることができる3つのパネル、画像回転スタックが用意されました。
18. AVIにムービーを保存するには、[ファイル]> [名前を付けて保存...> AVI ...
19. [保存]をクリックします。

5。代表的な結果

3 WT（C57BL/6J）のマウスと4肥満（B6.V-LEP ^OB / J）マウスの結果Albira CTシステムを採用した脂肪/総体積比の測定値の代表例としてここに報告されています。下の図1の代表を提供しています肥満マウスCT画像のセグメンテーション（ すなわち、合計量と脂肪量）のためにVolView V3.2で作成され表示されます。

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図1。脂肪のためにセグメント化された代表的なCT画像。（）肥満マウス（B6.V-LEP ^OB / J）グレースケールでのCTの総体積は、赤で（B）脂肪量、および（C）画像融合。グレースケールで（D）WTマウス（C57BL/6J）CT総量、赤で（E）脂肪量、および（F）画像融合。

合計ボリューム、FATボリューム、および計算された脂肪/総体積比は、各WTマウスとそれぞれの肥満マウスのために以下の表1に報告されています。 WT群と肥満群のための平均脂肪/総体積比は0.09と、それぞれ0.42（ 図2）であった。肥満マウス対WTマウスの脂肪/総体積比が（P = 0.001）が有意に異なることが判明した。

WT（C57BL/6J）	合計（cm 3）を	脂肪（cm 3）を	脂肪/総比	肥満（B6.V-LEP OB /​​ supの	合計（cm 3）を	脂肪（cm 3）を	脂肪/総比
動物1	28.79	3.00	0.10	動物1	66.25	26.75	0.40
動物2	33.25	3.05	0.09	動物2	61.15	26.31	0.43
動物3	30.30	2.63	0.09	動物3	64.19	25.7	0.40
				動物4	54.25	23.78	0.44

表1。合計ボリューム、FATボリューム、とWTと肥満マウスの脂肪/総体積比総脂肪ボリュームはPMOD VOI解析を用いてセグメント化された画像から得られた。

図2。肥満マウス対WTマウスの脂肪/総体積比を平均した。WTのために脂肪/総体積比の平均（C57BL/6J）と肥満（B6.V-LEP ^OB / J）がそれぞれ0.09と0.42であることが判明し表示されます。 （エラーバー=シングル標準偏差）。 WT対肥満脂肪/総体積比が（p値= 0.001）で有意差が認められた。

ディスカッション

ここでは、B6.V-LEP ^OB / Jマウスを利用して我々はAlbira CTシステムを用いた小動物モデルにおける脂肪量の測定を行うことの可能性を説明しました。これらの測定は、グループ内およびグループ間の測定値の比較のための期待と一致している。まず、代表的な結果は、これらの手順を使用して、WTと肥満マウス群のいずれにおいても脂肪/総体積比の測定に限られたグループ内の変動を強調表示しますここで提供される。第二に、WTと比較肥満マウスの脂肪/総体積比が大きく異なります。最後に、WT対B6.V-LEP ^OB / Jマウスの相対的な総脂肪量と体脂肪率について報告され、以前の値と（図示せず）の比較に基づいて、WT対の合計/脂肪体積比のために我々の測定B6.V- LEP ^OB / Jマウスは、予想される範囲^、7、8の範囲内。

ここで詳述した方法は、他のMに適用したり、適合させることができましたodelsおよび/または研究目的。復興パラメータの変更は特定の目標を達成するために必要な場合があります。たとえば、Judex ら 。 （2010）50μmの解像度の画像は、一部の地域、特定の分析のために必要であったことを報告した。イメージの一センチ方のボリュームは、 "HR"復興オプションを使用してAlbira 5.0 Suiteの再構成で35μmの再建のために選択することができます。 Albira CTシステムは、領域や臓器、特定の脂肪含量測定のために利用されていたら、CTベースの脂肪含有量分析の完全な利点は（すなわち、同時地域や臓器、特定の脂肪量の測定と縦測定）Albira CTシステムのために実現することができる。

結論：

ここでは、X線CT画像を用いた生きたマウスの脂肪含有量の測定のためのステップ法を用いて、詳細なステップを提供しています。我々は、CTデータAlbiraイメージステーションを使用して設定を取得し、その後のセグメンテーションとANAを行ったPMODソフトウェアスイートを使用して溶解。最後に、我々は全体の動物の中で容易なレンダリング、および脂肪組織分布の可視化を有効にする手順を説明しています。