フローサイトメトリーおよび自動化された磁気活性化細胞選別（AutoMACS）を使用して、ナイーブ膵腫瘍を有するマウスからミエロイド系のサプレッサー細胞（MDSC）の調製

要約

これは、ミエロイド系のサプレッサー細胞（MDSC）をイムノおよびGr-1を豊かにし、迅速かつ包括的な方法です ^{+白血球。このメソッドは、実行可能なGR-1に濃縮するために選別フローサイトメトリーとAutoMACSセルを使用しています +白血球と in vitroでアッセイ。}

要約

MDSCは、寄生虫感染、炎症、外傷後ストレス、移植片対宿主病、糖尿病や癌^1から7を含む病理学的条件下でリンパ系器官に蓄積される未熟なマクロファージ、樹状細胞および顆粒球の不均一な集団である。マウスでは、MDSCエクスプレスMAC-1（CD11bを）とGR-1（Ly6GとLy6C）の表面抗原^7。 MDSCはよくそれらが大幅に拡大し^、7月10日ナイーブな対応に比べて抗腫瘍免疫応答を抑制されている各種担癌宿主内で研究されていることに注意することは重要です。しかし、病態に応じて、抑制^11,12の別個のメカニズムやターゲットとMDSCの異なる亜集団が存在する。したがって、実行可能なMDSC集団を分離するための効果的な方法は、in vitroおよび in vivo で抑制のそれぞれ異なる分子メカニズムの解明において重要である。

最近、Ghansahグループは、マウスの膵臓癌モデルでMDSCの拡大を報告しています。私たちの担癌MDSCは、恒常性の損失を表示し、ナイーブなMDSC ¹³に比べて抑制機能を増加させた。 MDSC割合はナイーブ対担癌マウスのリンパ系のコンパートメントで有意に少なくなります。これは、しばしばこれらのMDSCの正確な比較分析を妨げている主要な警告です。したがって、前の蛍光活性化セルソーティング（FACS）にナイーブマウスからのGr-1 ⁺白血球を豊かにすると、純度、生存率を高め、大幅にソート時間が短縮されます。これらはソートクイックFACSのために豊富にありますしかし、担癌マウスからのGr-1 ⁺白血球の濃縮はオプションです。したがって、このプロトコルでは、我々はMDSCをイムノタイムリーにMDSCをソートするためのナイーブマウスの脾臓からのGr-1 ⁺白血球を濃縮する非常に効率的な方法を説明します。免疫C57BL / 6マウスは、マウスPanc02 CEを接種するナイーブなマウスは、1XPBSを受け取るのに対し、皮下LLS。約30日後に接種、脾臓細胞解離ふるいを使用して単一細胞懸濁液に収穫し、処理されます。脾細胞は、その後赤血球（RBC）を溶解し、これらの白血球のアリコートを、フローサイトメトリーを用いた免疫表現型MDSC割合にMac-1とGR-1に対する蛍光標識抗体を用いて染色されています。平行実験で、ナイーブマウスからの全白血球は蛍光標識のGr-1抗体、PE-MicroBeadsでインキュベートし、積極的に自動化された磁気活性化細胞選別（autoMACS）プロ区切り記号を使用して、選択した状態で染色されています。次に、GR-1 ⁺白血球のアリコートを、フローサイトメトリーを用いてMDSC割合の増加を識別するためにMac-1抗体で染色されています。今、これらのGR1 ⁺濃縮白血球は 、in vivo および in vitro での比較分析（ナイーブ対担癌）で使用するMDSCのソートFACSの準備ができている

プロトコル

開始する前に、次の解決策を準備します。

3％の染色メディア（SM）：

1Xリン酸緩衝生理食塩水で3％ウシ胎児血清（FBS）（PBS）

MACSバッファー（MB）：

- 1XPBSでウシ血清（BSA）から0.5％アルブミン

1。マウスから収穫脾臓

1. 皮下に100μlの1X PBS（; TB担癌）に懸濁し、1.5×10 ⁵マウスPanc02細胞と年齢C57BL / 6マウス（Harlan）の6-8週間を注入します。コントロールマウス（ナイーブ）100μlの1XPBSを受信します。
2. 約4週間ポスト噴射、二酸化炭素窒息によりマウスを安楽死させる。
3. 鉗子とハサミを用いて鈍的切開によるマウスから収穫の脾臓は、バランスを使用して重量を量る。別の場所の脾臓では、1×PBSを含む50 mlのコニカルチューブにラベルを付けました。

2。シングルセルサスペンシオを生成します。脾臓から白血球のn

すべての手順は、生物学的安全フードや氷上で保存細胞および抗体の下で無菌環境で実行する必要があります。

1. 底に向かってカップの開口部にメッシュスクリーンを挿入することにより、細胞解離ふるいを組み立てます。次に、このような場所に画面を保持し、マイナス側でスレッドの領域に保持リングを挿入し、固定リングを締めリングキーを使用します。 10ミリリットル1×PBSを含むペトリ皿の中で組み立てられたふるいを置きます。
2. プールの脾臓および細胞解離ふるいのメッシュスクリーンに対しても、ペトリ皿に脾臓を挽くためにガラスの乳棒を使用しています。マウスの各治療群に対して、この手順を繰り返します。
3. 70μmのセルストレイナーと5ミリリットル血清ピペットを用いて50 mlコニカルチューブにフィルターを細胞懸濁液。 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）で遠心します。
4. 脾臓あたり5ミリリットル×1 RBC溶解緩衝液上清とペレットを再懸濁しを削除します。。精力的に上下にピペッティング。室温で5分間インキュベートします。 1×PBS 20 mlを加えて反応を停止します。精力的に上下にピペッティング。 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）で遠心します。
5. 20ミリリットル滅菌1×PBSで上清とペレットを再懸濁しを削除します。精力的に上下にピペッティング。
6. 50μlのは^{5×5×10 6個の}細胞（ - 2×10 ⁷細胞/ mlの1×10 ⁷細胞/ ml）と等価になるようにトリパンブルーと3％のSMの所望の濃度で再懸濁し血球を用いて細胞をカウントします。

3。フローサイトメトリーを用いてMDSCの細胞表面染色/免疫表現型

1. （; MAC-1-FITC、GR-1-APCとDAPIはありませんステイン、NS）制御と補償コントロールの実験試料と単一の汚れのために96ウェルVボトムプレートのウェルにラベルを付けます。
2. 96ウェルV底プレートのそれぞれのウェルに脾細胞を50μl/ウェルに相当する^{5×5×10 6個の}細胞を追加します。遠心分離5分間12,000 rpmで（250〜300 xg）でプレート。
3. 氷上で1.5 mlのマイクロ遠心チューブに、3％のSMで希釈したマウスのBDのFcブロック（ラット抗マウスCD16/32モノクローナル抗体）の "マスターミックス"（MM）を準備します。出発点として、1ウェルあたり50μlの最終容量に対して3％のSMで1μgのFcのブロックを使用しています。
4. 慎重に細胞ペレットを中断することなく廃棄物の容器やシンクの上に、プレート上にバックをすばやく反転させ、96ウェルV底プレートの各ウェルから上清を除去します。
5. Vortexは、簡単に5秒間のFcブロックMMを遠心分離し、96ウェルV底プレート内のすべてのペレットに50μlを加える。静かに彼らのウェルにサンプルを残して、上下にピペッティングでよく混ぜる。氷上、暗所で15分間プレートをインキュベートします。 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）でプレートを遠心分離します。
6. サンプルは、Fcブロックでインキュベートしながら、氷の上で1.5ml微量遠心チューブに3％のSMで希釈した蛍光標識抗体の "マスターミックス"（MM）を準備します。抗体は、滴定されるべき染色手順のための最適な希釈を決定します。出発点として、よくサンプルあたり、50μlの最終容量に対して3％のSMで1時25 MAC-1-FITCの希釈およびGr-1-APCの1:20希釈を兼ね備​​えています。
7. 前述のように慎重に、96ウェルV底の各ウェルから上清を除去します。
8. Vortexは、簡単に5秒間蛍光標識染色抗体のMMを遠心分離や制御、実験ペレットに50μlを加える。優しく上下にピペッティングでよく混ぜる。単染色補正のために、ウェルあたり50μlの最終容量の3％のSMは、Mac-1-FITC、GR-1-APCの1:20希釈およびDAPIの75 ng / mlで、1:25希釈を追加するそれぞれのウェルに。 （ステインはありません）も無染色に50μlの3％のSMを追加します。よく混ぜ、氷上、暗所で30分間、96ウェルV底プレートで細胞をインキュベートします。
9. 96ウェルV底プレートの各ウェルに対応するラベルのFACSチューブ（5ミリリットル、12ミリメートル×75 mmのポリスチレン丸底チューブ）。各FACSに200μlの3％のSMを追加します。チューブ。
10. 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）でプレートを遠心し、上清を除去します。各ペレットに100μlの3％のSMを追加することによってペレットを洗浄し、優しく上下にピペッティングでよく混ぜる。 5分間12,000 rpmで（250〜300×g）でプレートを遠心分離します。もう一度手順洗浄を繰り返します。
11. 前述のように慎重に、96ウェルV底の各ウェルから上清を除去します。 100μlの3％のSMの各ペレットを再懸濁し、よく混ぜる。
12. 96ウェルV底プレートの各ウェルからのそれぞれ標識したFACSチューブにペレットを再懸濁し、100μlを転送します。
13. 前のフローサイトメトリー分析には、制御と実験試料とDAPI染色、単一の補償制御を75 ng / mlのDAPIを追加します。
14. MDSC割合のフローサイトメトリーのデータ収集を実行します。負（無染色コントロール）と単一の陽性コントロールを使用して補正を行います。そのように、ログスケールの前方（FSC）対側方散乱（SSC）が表示され、ドットプロットを設定するの白​​血球集団興味を識別することができます。破片と最低前方と側方散乱の塊を除く、全ての白血球に大きなゲートを描画します。この親ゲートから、DAPI-（ライブ）細胞上でSSC対DAPIとゲートを表示する新しいドットプロットを作成します。この新たにゲート人口を選択し、ダブルポジティブ上のMac-1とGR-1とゲートが表示されます。ドットプロットを作成する（Mac-1 ⁺ GR-1 ^+）MDSC。

4。 GR-1 ⁺白血球の磁気濃縮

1. 5分間12,000 rpmで（250〜300 xg）で適切に標識されたFACSチューブと遠心分離機にアリコート^{1×10 7}残りの染色白血球。
2. 1.5 mlのマイクロ遠心チューブ内でのGr-1-PE抗体のMMを準備します。 10 ^7個の細胞までについては、サンプルあたり50μlのMB、にのGr-1-PE抗体の1:10希釈を使用しています。大きなセル番号については、それに応じてボリュームをスケールアップ。簡単に言うと、5秒間遠心FACSチューブ内の白血球に加え、4℃、15分暗所でインキュベートします。
3. 、FACSチューブにMBの2ミリリットルを追加し、5分間12,000 rpmで（250〜300 xg）で遠心し、上清を捨てる。
4. 1.5 mlのマイクロ遠心チューブに抗PE MicroBeadsはMMの準備をします。 10 ^7個の細胞までは、サンプルごとに、200μlのMBでの抗PE MicroBeadsでの1:4希釈を使用しています。大きなセル番号については、それに応じてボリュームをスケールアップ。簡単に言うと、5秒間遠心FACSチューブ内の白血球に加え、4℃、15分暗所でインキュベートします。
5. 、FACSチューブにMBの2ミリリットルを追加し、5分間12,000 rpmで（250〜300 xg）で遠心し、上清を捨てる。 SBの3 mlのペレットを再懸濁します。新しい、標識された50 mlコニカルチューブに70μmのストレーナーを介してフィルタリングします。
6. 作成し、内閣総理オートMACSプロセパレータ。適切なソリューションと空の廃液ボトルと詰め替えはすべてのボトルは、必要に応じて。楽器の電源を入れ、初期化後に液体容器や列（s）の状態を調べる。すべてのシンボルは緑色でなければなりません。メニューには、上部から "分離"を選択してくださいメニューバーには、下のメニューバーから "今すぐ洗い"が続く。プライミング処理を開始するために "実行"に続いてポップアップオプションから "すすぎ"を選択します。プライミング処理が正常に完了すると、測定器は、それが[ステータス]メニューの下の "分離のための準備"であることが表示されます。
7. 行Bの否定的なフラクションコレクションと行のCの肯定的なフラクションコレクションのために15 mlコニカルチューブの行、50 mlコニカルチューブに磁気標識した細胞をチューブのサイズと場所に適した冷却したチューブのラック50mlコニカルチューブを選択します。
8. サンプルから区別するモードで標識した標的細胞のポジティブセレクションのための "POSSEL_S"細胞分離プログラムを選択します。磁気標識した標的細胞をオートカラムに保持されます。非標識細胞は磁石の自動後退の行Bに負の分数のコレクションチューブに放出され、標識した標的細胞は、チューブの行Cで正のコレクションチューブに放出されます。ラック。

5。 GR-1 ⁺充実した白血球のポストソート分析

1. GR-1 ⁺とGR-1を再集計^-トリパンブルーと血球計を使用した画分を。 3％の染色培地中の所望の濃度で再懸濁した細胞を50μlの^{5×5×10 6個の}細胞（1×10 ⁷細胞/ ml - 2×10 ⁷細胞/ ml）と等価であるように、それに応じて標識されたFACSチューブに50μlを転送します。
2. サンプルあたり50μlの最終容量の3％のSMで1:25希釈で、唯一のMac-1のMMを準備します。細胞を染色し、フローサイトメトリー分析用G​​R-PEは、Mac-1 FITCおよびDAPIの単一の染色補正を準備します。前述のように200μlの3パーセントのSMとDAPI生存染料を追加します。
3. パーセンテージもMDSC割合事前·事後autoMACS濃縮を比較する^{- GR-1 +}とGR-1を決定するためにフローサイトメトリーのデータ収集を実行します。

6。代表的な結果

ここでは、rを示す MDSC（ 図1）の並べ替え、その後のFACSのためにプールされた、ナイーブ脾臓からのGr-1 ⁺白血球のautoMACS濃縮用epresentative結果。 ^{1×10 6}ナイーブ白血球前autoMACSのソートに、BD LSRII器を使用してMDSC割合を識別するには、Mac-1-FITCとGr-1-APC抗体で染色した。 ^{1×10 7}ナイーブ白血球はその後autoMACS Proの区切り記号を使用して、GR-1 ⁺白血球の濃縮のためにAnti-Gr-1-PE抗体およびPE-MicroBeadsを用いて染色した。ポストautoMACSの濃縮は、GR-1 ⁺とGR-1 GR-1の割合^-収集した画分はフローサイトメトリーを用いて評価した。 1×10 ⁶のGr-1 ⁺白血球は、フローサイトメトリーによって腫瘍を白血球をプールし、非濃縮する濃縮のMDSC割合、プールされたナイーブな白血球を分析し、比較するには、Mac-1-FITC抗体で除去し、染色した。

fig1.jpg "/>
ソートMDSC FACS用ナイーブGR-1 ⁺白血球の図1。AutoMACS濃縮。脾臓、膵臓腫瘍を有するとナイーブなマウスから採取し、単一細胞懸濁液に加工された。ナイーブな白血球表面のフローサイトメトリー分析の前autoMACS濃縮（）には、Mac-1とGR-1蛍光標識抗体で染色した。 GR-1 ^+（B）とGR-1のフローサイトメトリー分析^{- GR-1-PE}抗体と抗PE MicroBeadsで染色し、プールされたナイーブleuckocytesからのGr-1 ⁺細胞の（C）分画のポストautoMACS濃縮。 MDSCおよびGR-1のフローサイトメトリー分析のGr-1 ⁺の割合はポストautoMACS濃縮担癌マウス（E）から非濃縮プールされた白血球（ナイーブマウス、n = 5の場合と比較して、プールされたナイーブな白血球（D）から⁺細胞、担癌マウス、n = 3）で。 MDSCおよびGr-1の割合は、代表的なコンタープロットとヒストグラムのゲートがあります。

ディスカッション

これは、様々な動物モデルから別のリンパ組織にも適用可能であるMDSC集団を処理し、immunophentypingの詳細な方法です。特に、autoMACSの濃縮は、脾細胞⁴のGR-1の枯渇、脾臓細胞、リンパ節⁵から骨髄のサブセットの精製、CD8の骨髄好中球¹⁴の単離および精製⁺脾臓からT細胞を含む種々の白血球集団の分離に使用することができますとリンパ節^15。かかわらず?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬	COMPANY	カタログ＃	コメント
1Xリン酸緩衝生理食塩水	サーモフィッシャーサイエンティフィックハイクローン	SH30028.02	のCa 2 + / Mg 2 +を /フェノールレッドフリー
ウシ血清（BSA）からアルブミン	Sigma-Aldrich社	A7906	BSAをPBSに邪魔されずに溶解させ、無菌環境
ウシ胎児血清（FBS）	サーモフィッシャーサイエンティフィックハイクローン	SV3001403HI	不活化熱、無菌環境
ラット抗マウスCD16/32モノクローナル抗体（FCブロック）	BDバイオサイエンス	553142	無菌環境
抗マウスCD11bをする（Mac-1）のFITC	eBiosciences	11から0112	無菌の環境
抗マウスLy6G（GR-1）APC	eBiosciences	17から5931	無菌環境
抗マウスLy6G（GR-1）PE	eBiosciences	12から5931	無菌環境
DAPI	インビトロジェン	D1306	希釈無菌環境
細胞解離ふるい	Sigma-Aldrich社	CD1-1KT	使用前にオートクレーブ
70μmのストレーナー	BDバイオサイエンス	352350	無菌環境
1X RBC Lysis Bufferを	eBiosciences	00-4333-57	無菌環境、使用前に室温に暖かい
ペトリ皿	フィッシャー·サイエンティフィック	08-757-12	無菌環境
50ミリリットルCONiCalの管	サーモフィッシャーサイエンティフィック	339652	無菌環境
5ミリリットル12X75mmポリスチレン丸底チューブ	BDバイオサイエンス	352054	FACSチューブとして知られている。無菌環境
96ウェルV底プレート	コー​​ニング	3897	無菌環境
トリパンブルー	Cellgro	25から900-CI	無菌環境
PE MicroBeadsは	ミルテニーバイオテク	130-048-801	無菌環境
AutoMACS Proのセパレータ	ミルテニーバイオテク	130-092-545
AutoMACS列	ミルテニーバイオテク	130-021-101
ランニングバッファーAutoMACS	ミルテニーバイオテク	130-091-221