タンパク質 - タンパク質相互作用を研究するために磁気ビーズを用いて液相アフィニティキャプチャーアッセイ：ポリオ-nanobodyの例

要約

この記事では、単純な、定量、液相の親和性捕捉アッセイが提示されています。それは一方では、磁気ビーズとタグ融合タンパク質（例えば、ナノボディ）との間の相互作用や他のタグ付きタンパク質と第二、標識タンパク質（例えば、ポリオウイルス）との間の親和性に基づく信頼性の高い手法である。

要約

この記事では、単純な、定量、液相の親和性捕捉アッセイが提示されています。一つのタンパク質をタグ付けすることができます提供され、別のタンパク質が標識され、このメソッドは、タンパク質 - タンパク質相互作用の調査のために実装することができます。これは、コバルト被覆磁性ビーズによるタグ付きタンパク質の認識に、タグ付きタンパク質と標識された第2の特異的なタンパク質間の相互作用で一方一方に基づいています。最初に、ラベルとタグ融合タンパク質を混合し、室温でインキュベートされています。タグを認識した磁性ビーズは、追加され、標識タンパク質の結合画分は、磁石を使用して非結合画分から分離されています。キャプチャされた標識タンパク質の量は、非結合画分に残った標識タンパク質の信号を測定することにより、間接的な方法で決定することができます。コンフォメーションの変換に敏感なタンパク質が尻である場合に記載の液相親和性アッセイは、非常に便利です。ayed。アッセイの開発とアプリケーションがポリオウイルスとナノボディ^1を認識してポリオウイルスの間の相互作用を実証しています。ポリオウイルスは、固体表面（未発表データ）に接続されたコンフォメーションの変換^2〜敏感であるため、ELISAの使用が制限されており、液相ベースのシステムは、したがって、優先されるべきである。しばしばpolioresearch ^3,4で使用されている液相ベースのシステムの例としては、マイクロタンパク質免疫沈降テスト⁵です。このテストは、その適用性を実証しているにもかかわらず、それが^6,7ナノボディで不在であるFcの構造を必要とします。ただし、別の機会として、これらの興味深いかつ安定した単一ドメイン抗体^8は簡単に別のタグを使用して設計することができます。広く（彼の_）6-tagはそのような自分の順番で簡単に磁気ビーズ上にコーティングすることができ、ニッケルやコバルトなどの二価イオンに対する親和性を示しています使用されます。したがって、我々はこの単純な定量を開発しましたコバルト被覆磁性ビーズに基づく親和性捕捉アッセイ。ポリオウイルスは、ナノボディで妨害さの相互作用を有効にして定量的な検出が可能にする³⁵ Sで標識した。メソッドは、実行が容易で、さらに効果的に再生磁気ビーズの可能性によってサポートされている、低コストで確立できます。

プロトコル

原則（）とメソッドの概要（B）は図1に示されている。

1。バッファーの調製

1. 水の中でリン酸二水素ナトリウム（50 mm）と塩化ナトリウム（300 mM）を溶解することによって結合/洗浄バッファーを準備し、pHを8.0に調整します。さらに、メチオニンツイーン20（0.01％（M / V）の最終濃度）、（2％（M / V）の最終濃度）とアルブミン（0.1％（M / V）の最終濃度）を追加し、必要なボリュームに調整します。

2。磁性ビーズの調製

取扱説明書に従って、磁気ビーズを準備します。簡潔に：

1. 渦を用いた磁気ビーズを再懸濁します。
2. 転送は、各サンプルの、チューブに再懸濁した磁性ビーズ（40 mg / ml）を10μlの。
3. 上清が透明になるまで、磁石を用いた磁気ビーズを収集する（+ / - 30秒）し、上清を注意深く除去する。
4. 洗う磁気ビーズを2回：結合/洗浄バッファー150μlでビーズを再懸濁します。磁気ビーズ上清が透明になるまで磁石を用いたチューブの一方の側に移行し、慎重に上清を除去します。
5. ビーズ（10 mg / ml）を懸濁するため、各サンプルについて、結合/洗浄バッファー40μlを使用しています。

3。親和性捕捉アッセイ

注：（宇宙の）バックグラウンド放射能（0％放射能）を測定するには、no放射標識されたウイルスは対照試料1に追加されていません。代わりに、同じボリューム結合/洗浄バッファーが追加されます。

注：100％の放射能が、すべてのコンポーネントがnanobodyのを除いて追加されるように制御サンプル2で定義されています。代わりに、同じボリューム結合/洗浄バッファーが追加されます。

1. 96ウェルマイクロタイタープレートに80μlに結合/洗浄バッファーで希釈した（β-放射）ポリオウイルスセービン株の種類^1〜9、標識された³⁵ Sの2000 CPMをもたらします。
2. 10＆mを追加するU;ウェルにnanobodyの希釈lの。
3. シェーカーを使用して約10秒間混ぜる。
4. サンプルは室温で1時間インキュベートすることができます。
5. 洗浄した磁気ビーズ懸濁液40μlを追加し、連続的に振盪し、室温で10分間インキュベートします。
6. ビーズとマグネットを使用して上清を分離し、チューブにクリアし、上清を移す。

4。放射能の測定

1. カウントフラスコに、ステップ3.6からの上清50μlを転送します。
2. シンチレーション液と混合の3ミリリットルを追加します。 β-シンチレーションカウンターで放射能を測定します。

5。ビーズのリサイクル

1. 2分間500 xgで、または透明な上清が得られるまで、チューブと遠心分離機で使用される磁気ビーズを収集します。
2. 上清を除去し、6ミリリットル、0.5 M NaOHでビーズを再懸濁します。
3. multiplに懸濁液を移す電子管と5分間超音波浴中でインキュベートします。
4. 磁気ビーズを収集し、上清を除去するために磁石を使用しています。
5. 各チューブに1 mLの2％SDS-ソリューションを追加し、ボルテックスを用いて再懸濁します。 5分間沸騰させる。
6. ビーズを収集し、上清を除去します。 1ミリリットルの0.2 M EDTA（pH = 7）でビーズを再懸濁します。
7. 5分間超音波浴中でチューブをインキュベートし、もう一度、上清を除去します。
8. 各チューブに1 mlの水を追加して、ビーズを懸濁します。ビーズを収集し、上清を除去します。二回の洗浄ステップを繰り返します。
9. 上清を除去し、1mlの10mMのCoCl ₂溶液中でビーズを再懸濁します。 10分間シェーカー上に置く。
10. ビーズを収集するために磁石を使用して上清を除去し、結合/洗浄バッファー1 mlに再懸濁します。
11. 上清を除去し、20％（v / v）エタノール1 mlを用いて2回ビーズを洗浄
12. 20％の元の体積（v / v）の他にビーズを再懸濁し40 mg / mlの濃度で再生ビーズを得るためにhanol。

6。結果の解釈

1. ない放射性標識ウイルスを添加しなかった対照試料1は、バックグラウンド放射能を修正するために、0％の放射能値を設定するために使用されます。 nanobodyのが含まれており、その結果、すべての放射標識されたウイルスは上清に残っている、されないコントロールサンプル2は、100％の放射能値として設定されています。
2. nanobodyので放射性標識ウイルスの - 上清中の放射能の割合（=％）が全体の降水量（％= 100）の測定値です。

7。代表的な結果

この親和性捕捉アッセイの代表的な結果は、 図2、図3と図4に示されています。 図2では、PVSS38C、ポリオウイルスのためにnanobodyの、特定の、の親和性が示されています。 PVSS38Cの親和性はpoliovの3つの異なる抗原に対してテストされていますirus：ネイティブ抗原（N-抗原）、加熱抗原（H抗原）と14Sサブユニット。 N-抗原は感染性である無傷のウイルスです。ウイルスは加熱（56時20分°C）または固体表面（未発表データ）、ウイルスRNAの（部分的）損失とキャプシドタンパク質VP4の結果カプシド変更のコンフォメーション、空に接続されている場合キャプシドは、その後、H抗原と呼ばれるが形成される。 14Sサブユニットは、アセンブリの中間体である。これらの抗原は、免疫後¹⁰抗体の異なるセットで認識されるため、異なるエピトープと抗原部位を持ってしています。図では上清中に見つかった放射能の割合はnanobodyの濃度の関数として表されます。それは放射性標識14Sサブユニットを含むサンプルの上清中の放射能はnanobodyのPVSS38C濃度の増加とともに減少することがわかる。これは、14Sサブユニットの消費ポリオウイルス量の増加のように変換することができますnanobodyのPVSS38Cおよび間接的に磁気ビーズに接続されています。キャプチャ価（放射性標識ウイルスの50％を捕捉するために必要なnanobodyの数=濃度）がグラフィカルに0.099 nMのように計算することができます。ポリオウイルスのN抗原とH抗原性フォームのPVSS38Cの親和性が観察されていません。これらのデータからそれがPVSS38Cは、ポリオウイルスの二つの他の抗原フォーム上の排他的に14Sサブユニット上に存在していないエピトープと相互作用していると解釈されます。

上清からの放射能の消失だけで、その抗原に対するnanobodyの特定の親和性によるものであることを示すために、同一のアッセイは、スルホロバスsulfataricusのlrpB転写制御因子に対して生成されたnanobodyの、NB1で行われ、との相互作用を持たないことが知られていた任意のポリオウイルス抗原。このアッセイの結果を図3に示します。すべての放射性標識ウイルスのない反応がないことを示す上清に残っているポリオウイルスの3抗原の形態に対してNB1。

結果の再現性は、別の日に一つ与えられたnanobodyの（すなわち、PVSP29F）の8回の合計で実験を繰り返すことで、異なる人によってテストされています。結果を図4に示されています。上清中の放射能の割合の平均値は、各nanobodyの濃度を算出し、その標準偏差に対応して表されます。

図1。アッセイの原理（A）の概要と方法（B）。 A. Hisタグ特異的に特定のポリオウイルスの抗原を認識ナノボディは、コバルト被覆磁気ビーズと対話することができますし、放射標識されたウイルスを沈殿させます。 B. Hisタグナノボディは、放射性標識したポリオウイルスを添加し、インキュベートする。コバルト被覆磁気ビーズです。追加され、バインド/非結合抗原の磁気分離が実行されます。上清の放射能が測定され、キャプチャされた抗原の量を導出することができます。

図2。 nanobodyのPVSS38Cによって異なるポリオウイルス抗原の磁気ビーズをアフィニティーキャプチャー 。上清中に見つかった放射能の割合はPVSS38Cの濃度の関数として表されます。 14S用濃度 - 反応関係は14Sに排他的に存在するエピトープとPVSS38Cの相互作用を示す、見つけることができます。非常に高濃度で無視非特異的取り込みが注目されているものの、N-、また、H-抗原との有意な相互作用が検出できません。

図3。 nanobodyのNB1によって異なるポリオウイルス抗原の磁気ビーズの親和性のキャプチャ 。上清中に見つかった放射能の割合は、NB1の濃度の関数として表されます。 NB1は、任意のポリオウイルス抗原またはサブユニットとの相互作用を持たないことが知られています。放射能の100％が上清中に検出されたので、どんなウイルスが非特異的にNB1にバインドされませんでした。 図2中の放射能の消失は、したがって、その抗原に対するnanobodyの特定の親和性のみによるものである。

図4。アッセイの再現性 。上清中の放射能の割合の平均値はnanobodyの濃度の関数として表されます。実験は、異なる日に、別の人による8回繰り返した。標準偏差は、縦棒として表されます。

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ディスカッション

プロトコルでは、nanobodyのと相互作用する抗原の放射能を上清からの放射標識されたウイルスの損失として定義されています。したがって、沈殿した放射能（= 1​​00 - ％）の量は、（磁気ビーズに結合した）上清中の放射能（=％）で間接的な方法で推定することができます。その一方で、それは500 mMのイミダゾールを用いた磁気ビーズから免疫複合体を溶出することにより直接的な方法で?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ダイナHisタグの単離とプルダウン	インビトロジェン	101.03D	磁気ビーズ
Optiphase 'HiSafe 2'	パーキンエルマー	1200 - 436	シンチレーション流体