フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

要約

この記事は、最初の臍帯静脈からヒト内皮細胞を単離するための手順を説明した後、フロー条件下で好中球の遊出を調べるために、これらの細胞を使用する方法を示します。ガラスの光学特性を有するポリマーから作られた低容量のフローチャンバーを用いて、希少細胞集団の生細胞蛍光イメージングも可能です。

要約

好中球は白血球の中で最も豊富なタイプです。彼らは、自然免疫系¹の本質的な部分を形成しています。急性炎症時に、好中球は、損傷部位に移行する最初の炎症性細胞である。第二に、微小血管の構造変化と血漿タンパク質のエスケープを血流から;損傷部位への好中球の動員は、血流を増加させる血管の最初に、拡張を含む段階的なプロセスである全体の好中球の第三の、ローリング、接着と輪廻内皮細胞、傷害^2,3のサイトでは好中球と4番目の蓄積。 in vivoおよび in vitro の方法での広い配列は、これらのプロセスの⁴の研究を可能にするために進化してきました。このメソッドは、ヒト内皮細胞間の好中球の移住に焦点を当てています。

好中球遊出に関与する分子プロセスを調べるための一つの一般的な方法は、人間のnを利用する初代ヒト臍帯静脈内皮細胞^（HUVEC）5との相互作用eutrophils。好中球の分離は、他の場所で視覚的に^6に記載されています、従ってこの記事では、HUVECの単離のための方法が表示されます。一度分離し、コンフルエンスまで増殖、内皮細胞接着と活性化分子のアップレギュレーションで得られた活性化されています。例えば、増加したE-セレクチンとIL-8発現⁷のTNF-αの結果のようなサイトカインと血管内皮細胞の活性化。 E-セレクチン媒介する好中球およびIL-8を媒介する活性化と好中球の強固な接着のキャプチャとローリング。接着好中球は転生した後。輪廻はparacellularly起こる（血管内皮細胞の接合部を介して）またはtranscellularly（内皮細胞自体を介して）することができます。ほとんどの場合、これらの相互作用は、血管系^7,8に見られるフローの状況下で発生します。

平行平板流室は広く使用されているシステムであり、そのマイルマイク流体力学的せん断は、 生体内に存在し、in vitroで ^9,10 のフロー条件の下で好中球動員の研究を可能に強調しています。いくつかの企業は、平行平板フローチャンバーを生成し、それぞれに長所と短所があります。蛍光イメージングが必要な場合は、ガラスや光学的に類似したポリマーは、使用する必要があります。内皮細胞は、ガラス上でうまく育たない。

ここでは、位相コントラスト用に匹敵する光学特性をヒト内皮細胞の急速な付着と成長をサポートしているポリマーで作られた低容量ibidiチャネルスライドを用いて好中球遊出のDICと蛍光イメージングを簡単かつ迅速な方法を提示するガラス。この方法では、内皮細胞を増殖させたとibidiのμslideで刺激した。好中球は、フロー条件下で導入され、輪廻を評価した。接合部の蛍光イメージングは​​、対傍細胞の範囲のリアルタイム測定を可能にし経輪廻。

プロトコル

1。ヒト血管内皮細胞の単離とメンテナンス

1. ヒトの血液や組織で作業する場合、レベル2バイオセーフティ手順を使用する必要があります。はさみを使用すると、胎盤から臍帯を切断し、密接に血栓と配信中にコードをクランプすることにより生じた損害についてコードを確認します。切り出し、コードのこれらの部分を破棄します。
2. 50mgのコラゲナーゼを含むチューブに暖かいコードバッファの50ミリリットルを注いで1 mg / mlを新鮮なコラゲナーゼ溶液を調製します。
3. 滅菌手袋に変更し、層流フードで滅菌鈍カニューレ、コードクランプ、はさみ、三方ストップコックとガーゼを含むオートクレーブ機器のトレイを開きます。
4. 2動脈と脊髄内の単一の静脈に存在を識別します。動脈は小さく、静脈が大きく、カニューレを挿入するのは簡単であるのに対し、しっかりとくびれになる傾向があります。静脈から血液をフラッシュするには、軽くiに接続された2つの三方活栓とカニューレを挿入しますNTO静脈の一端との位置にしっかりとそれを保持するために、カニューレの周りにクランプを配置します。静脈を介してコードバッファを灌流。流れが鮮明になるまで繰り返し、その後、コードの端をクランプします。
5. 、静脈内にコラゲナーゼ灌流コックを閉じ、10分間のウォームコードバッファとインキュベートを含むビーカーにコードを配置します。 10分後に、コードを外し、ゆっくりと静脈の内腔から内皮細胞を緩めるためにコードをマッサージします。内皮細胞培地（ECM）を含むチューブに溶液を排出します。二回、残りの細胞を除去するためにコードのバッファーで洗い流す。同じチューブ内に溶液を排出します。
6. ペレットに10分の内皮細胞は350 xgで細胞を遠心分離します。
7. 上清を除去し、ペレットにECMの10ミリリットルを追加します。穏やかにECMに細胞を再懸濁し、0.2％ゼラチンで予めコーティングされたT75フラスコに細胞を移す。ゼラチンとプレコーティングは37℃で少なくとも1時間行われました37℃で細胞を培養℃、5％が_{CO 2を} 。
8. 次の日、静かに、任意の赤血球はその後上清を除去し、暖かいハンクス平衡塩溶液（HBSS）で洗浄し取り除くために、フラスコを振る。 HBSSを除去し、暖かいECMの10mlで細胞を供給します。赤血球が削除されたことを確認するために顕微鏡下で細胞を調べます。合流と内皮細胞の形態の程度を評価します。この段階では、内皮細胞は液胞のない記号で伸長する必要があります。
9. 細胞は、1mMのEDTAを含むトリプシンの0.08％溶液を用いて、コンフルエントにし、分割細胞に到達するまで3日ごとにメディアを変更し続けています。希望のお料理のプレート内皮細胞は、0.2％ゼラチンで予め被覆された。細胞は3-6日でコンフルエントに到達する必要があります。
10. 0.2％ゼラチンで各チャンバibidi室、プレコートを使用する場合。削除過剰1.5 Xチャンバー内にECMに懸濁し、内皮細胞の10 ⁶ / mLを追加し、ゼラチンとフィブロネクチンと。 Cまで、一日おきにメディアを変更するonfluent。細胞は、脊髄に応じて2〜3日でコンフルエントでなければなりません。

2。好中球の準備

1. 好中球密度遠心分離を使用して、健康なヒトボランティアの末梢血から単離した。好中球分離のための視覚的なデモンストレーションの詳細なプロトコルは、このジャーナル⁶の以前の問題で見つけることができます。 0.5パーセントのヒトアルブミンを含むHBSSで^{1×10 6} / mLの濃度を一度に分離され、再懸濁し、好中球。

3。 Ibidi会議を設定する

1. ゼラチンコートibidiチャンバー内に内皮細胞を成長させる。彼らは緊密にコンフルエントになるまで、位相差顕微鏡を使用して、毎日それらを調べます。
2. 接着と活性化分子の発現を増加させる内皮細胞を刺激します。このプロトコルの目的のために、内皮細胞は37℃で4時間、組換えTNF-αのは10 ng / mLで刺激された℃、5％CO 2。
3. 顕微鏡、視覚的に空のibidiチャンバーを使用してビーゼら¹¹で説明したようにシリンジポンプを準備します。
4. このプロトコルとビーゼ手順の重要な相違点は、°Cの温度を失い、別のを使用してからバッファを維持するためにPharMedチューブを使用して、水浴を用いて37℃でバッファを維持し、空気への内皮細胞の曝露を防止するために、事前に充填チューブを含む位相コントラストまたは蛍光でイメージングするかどうかに応じて顕微鏡での目標。
5. 一度顕微鏡が設定され、チューブをHBSSで満たされている、すべてのコックを閉じて空のibidi室を削除します。
6. TNF-αを含むibidi室がチューブに内皮細胞を刺激して接続します。

4。好中球の動員と移住

1. microscの内皮細胞単層を可視化する10倍の位相差対物レンズを用いてOPE。
2. 希望するせん断応力（典型的に0.5から2 DYN / cm ^2）をHBSSでの流れを撤回し、開始するためにシリンジポンプを設定します。
3. 三方ストップコックを回して孤立した好中球（1×10 ⁶ / ml）にHBSSから入口側、スイッチ上で。
4. DVDレコーダーのどちらかに接続したり、コンピュータに直接接続されたCCDカメラを用いて録音を開始します。好中球は、チャンバーを入力したときにタイマーを起動します。 4分の好中球を灌流。好中球懸濁液を3mlの合計は、単一の実験のために十分である。
5. 4分後、新好中球の付着を防止するためにHBSSに切り替える。合計の相互作用、ローリングと強固な接着のためのデータが必要な場合は、10秒ごとに画像6ランダムフィールドは分4と5の間に10倍の位相差対物レンズを使用します。
6. 40倍の目標に切り替えて、5〜10分の間でビューの単一のフィールドを記録します。 10分で収集し、ビューの5〜10のランダムなフィールド。
7. フローを停止し、次の部屋に移動します。

5。 Ibidiチャンバーを用いたフローの状況下では蛍光イメージング

1. 興味の蛍光プローブを用いて内皮細胞または好中球のどちらかにラベルを付けます。たとえば、アレクサ·[547]に結合した抗VE-カドヘリン抗体は、内皮細胞の接合部を可視化するために使用することができます。
2. 微分干渉コントラスト（DIC）および蛍光機能を備えた顕微鏡でibidi室を組み立てる。私たちは、環境チャンバーとFluoView 1000年共焦点（オリンパス）を使用します。 DICと蛍光灯の作業用に設計された対物レンズを用いてフォーカスします。
3. セクション4で説明した時間経過を追いながら、ベンダー提供のソフトウェアを使用して同時DICと蛍光画像を取得します。

6。好中球動員の分析

1. ローリングとの相互作用、細胞の分析は、ビーゼら ¹¹に記述されています。
2. 内皮単層上を転動する好中球の割合が5秒の周期で複数のセルの直径を移動した好中球数をカウントする測定します。ローリング細胞の割合を決定するためにフィールドでの白血球の総数で、この数値を除算します。拡張機能によって、残りの細胞はしっかりと付着とみなされます。
3. 好中球は、特定の期間内に旅して、秒単位でその時間で割っ距離を計算することによって好中球の転がり速度を測定します。
4. 輪廻は、形状を変更し、組織化単分子膜¹⁰の下に移行した好中球数を数えることによって決定されます。これらの好中球は、それらが相されて明るいから変更されるという事実によって識別された場合に、組織化単分子膜¹⁰の下に相暗いことに単分子層の上に。転生細胞の数は、ビューのフィールドの合計細胞のパーセンテージとして、または、生のしびれとして表すことができる。単位面積あたりの転生の細胞の小胞体。このモデルシステムでは、一般的に好中球の50％が10分後に転生。

7。代表的な結果

刺激内皮細胞は好中球の動員をサポートしていません。対照的に、好中球の転がり、強固な接着と輪廻のTNF-αの結果と内皮細胞を刺激する。これらのデータの例は、 図1及び図2に示されています。 図1Aは、TNF-α刺激された内皮細胞と相互作用する好中球を示しています。これらの相互作用は、内皮細胞と同様に、（ 図2）にしっかりと付着、または転生ローリング好中球数との相互作用、好中球の総数を明らかにし、定量することができる。好中球の移住は、細胞の接合部や血管内皮細胞自体を介して発生する可能性があります。これらの二つの条件を区別するために、内皮細胞は、抗VE-Cで標識される adherin抗体と輪廻はparacellularly発生またはtranscellularly（ 図1BおよびC）として記録されています。このモデルでは、実質的にすべての移住は⁷傍細胞である。

図1。ibidiチャンバーを用いたフロー条件下で同時DICと蛍光イメージング。 （A）DIC画像は、新たにヒト臍帯静脈内皮細胞間で移行するヒト好中球を単離した。黄色の矢印は接着性好中球を示しています。白い矢印は、転生好中球を示しています。 （B）血管内皮細胞の接合は、アレクサ·[547]とイメージングへのコンジュゲート抗VE-カドヘリン抗体で染色した。 （C）チャネルAとBはこのモデルでは実質的にすべての転生は、傍細胞であることを明らかにするのオーバーレイを表示します。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

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図2：血管内皮細胞が刺激を受けていない残されたまたはTNF-α、10 ng / mLので刺激した。 4時間後、パラレルプレートフローチャンバーには、アセンブルされたおよび好中球は、1ダイン/ cm ^2の時を越えて灌流した。 （A）好中球の相互作用を調べ、NIHからImageJのソフトウェアを用いて測定した。総相互作用する細胞（B）は、ローリング、しっかりと付着または（C）転生のように特徴付けられた。データは3〜5の実験の平均+ SEMを表す。パネルAとCの制御およびTNFの差は有意であった（p <0.001）。

ディスカッション

研究者は定期的に好中球の動員と輪廻を研究するために別の血管床から内皮細胞を使用しています。例としては、皮膚微小血管内皮細胞^12、肝類洞内皮細胞¹³とヒト臍帯静脈¹⁰から内皮細胞に限定されるものではない。中でもHUVECため絶縁性と可用性のそれらの相対的な使いやすさ、幅広い人気を博した。 HUVECは、 生体内で発生する多くの内皮細胞のプロセ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬および装置	会社	カタログ番号	コメント
コラゲナーゼタイプ1	ワージントン	4197
コー​​ドバッファ			組成：pH7.4で1mMののNaH 2 PO 4月2日のNa HPO 4緩衝液に140mMのNaCl、4mMのKClを10mMのD-グルコース
内皮細胞培地（ECM）			ペニシリン100単位ストレプトマイシン100μgのとL-glutamine/mlの0.3 mgを含む16％ヒト血清を添加したイーグル塩とM199
M199	GIBCO	31100-035
ペニシリンストレプトマイシングルタミン酸（100X）	インビトロジェン	10378-016
Ibidi室	Ibidi	80606
TNF-α	プレテック	300-01A
ヒトアルブミン20％溶液	ジェミニバイオ製品	800120050
のCa 2 +およびMg 2 +なしHBSS	シグマ	H2487-10X
のCa 2 +およびMg 2 HBSS +	シグマ	H1387-10X