ゼブラフィッシュ幼生における播種性カンジダ症の非侵襲的イメージング

要約

ゼブラフィッシュの急速な発展、小型サイズと透明性感染症の自然免疫制御の研究のための途方もない利点があります ^1月4日。ここでは、真菌性病原体を用いたゼブラフィッシュの幼虫を感染させるためのテクニックを実証するカンジダ·アルビカンスマイクロインジェクションすることによって、方法論は、最近、真菌の二形の制御に食細胞NADPHオキシダーゼ活性を巻き込むために使用さ ⁵。

要約

病原体カンジダ·アルビカンスに起因する播種性カンジダ症は、入院して個人の臨床的に重要な問題であり、30から40パーセント起因する死亡率は⁶に関連付けられています。全身性カンジダ症は、通常、先天性免疫によって制御され、食細胞NADPHオキシダーゼなどの自然免疫細胞成分の遺伝的欠陥を持つ個人は、カンジダ^7月9日に影響を受けやすくなります。非常に小さなCのダイナミクスについてはほとんど知られていないin vivoでの自然免疫細胞とカンジダの相互作用。in vitro試験で広範には、ホストCの外側にあること確立していますカンジダは、マクロファージの内部で発芽し、かつ迅速に好中球^10月14日によって破壊されています。in vitro試験において 、有用なものの、サイトカイン、細胞外マトリックスの添付ファイル、および細胞間の接点¹⁰の時間依存ダイナミクスを含む生体内環境で複雑 ​​なを再現することは^できません^15から18 ゼブラフィッシュの幼虫は、感染症の研究のためのユニークで多彩な脊椎動物宿主を提供しています。開発ゼブラフィッシュ幼生の最初の30日間だけ先天性免疫防御^2、19-21のような先天性免疫に大きく依存している播種性カンジダ症などの疾患の研究を簡素化しています。ゼブラフィッシュ幼生の小型化と透明性の両方の宿主と病原体の細胞レベルでの感染動態のイメージングを可能にします。生得的な免疫細胞を蛍光トランスジェニック幼虫は感染^22から24に関与する特定の細胞型を識別するために使用することができます。変更されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（Morpholinos）は、そのような食細胞NADPHオキシダーゼなどの様々な免疫成分をノックダウンするとfungaへの応答の変化を勉強するために使用することができますlの感染^5。小さな下の脊椎動物を使用しての倫理的、実用的な利点に加えて、ゼブラフィッシュの幼虫は、イメージの両方intravitallyと色の病原体とホストの間で激戦を特有の可能性を提供しています。

ゼブラフィッシュは、ヒトの病原性細菌の数のモデル感染症に使用されており、マイコバクテリア感染^3、25の私たちの理解に大きな進歩に尽力してきました。しかし、ごく最近そのような幼虫⁵に感染するために使用されて菌類^、23、26とはるかに大きいの病原体を持っており、感染の方法論の詳細な視覚的な説明がされていない最新の状態に。ここでは、以前のプロトコルへの私たちの修正を含むプリム²⁵ゼブラフィッシュ後脳の脳室のマイクロインジェクションは、当社の技術を紹介します。真菌感染症のために幼虫のゼブラフィッシュモデルを使用して、我々の所見は、in vitro試験から分岐し、宿主-病原体interaを検討する必要性を強化ホストではなく、ペトリ皿⁵の簡素化、システムの複雑な環境でction。

プロトコル

すべてのゼブラフィッシュのケアのプロトコルや実験は動物実験及び利用委員会（IACUC）プロトコルA2009-11-01の下に行われた。

1。モルホリノおよび幼虫インジェクション料理

実験期間：*（10-15分）

難易度：*

1. 卵の注射用滅菌水と電子レンジで2％アガロース溶液を調製。解決策は、それが半分になるまで、余分な深いペトリ皿（フィッシャーサイエンティフィック）にその一部を注ぐ冷却したとき。氷上で冷却し、プレートが水平であることを確認してください。
2. 皿を冷却した後、2％アガロース15mlの最上層を注ぐ。スプレーボトルから滅菌水でプラスチック金型（適応科学のツール）を溝卵注入をスプレー。慎重に熱いアガロースに金型の溝側を下に置きます。アガロースが冷却されたとき、AGAから金型を解離する金属フラットへら（VWR Scientific）を使用上昇した。徐々にアガロースからグリッドを削除します。ラップ胚の注入パラフィルムで料理（VWRサイエンティフィック）とストアは、4℃で反転
3. 魚の幼虫の注射については、前述のように2％アガロース溶液を調製。標準サイズのペトリ皿（VWRサイエンティフィック）に溶液を注ぎ、それが固化するまで置いておきます。パラフィルムとストア内のラップ幼虫注入皿は4℃で反転

2。真菌培養の準備

実験期間：**（30分）

難易度：**

1. 10グラム/リットル、酵母エキス、20g /リットル、ペプトン、20g /リットルデキストロース、および20グラム/リットルの寒天に、オートクレーブ：酵母エキス - ペプトン - デキストロース（YPD）寒天プレートを準備します。 YPD液体のために10グラム/リットル、酵母エキス、20g /リットル、ペプトン、20g /リットル、ブドウ糖、オートクレーブ121℃20〜30分℃を準備する
2. 魚の感染症への2日前までは、冷凍からストリークプレートを準備単一のコロニーを得るためにYPD寒天上にカンジダ·アルビカンスの文化を取り揃えております。
3. 37℃で一晩インキュベートします。
4. 16×150 mmの培養管（VWRサイエンティフィック）に5 mLのYPD培地を入れてください。
5. 魚の感染症の前日には、木製のダボ（VWR Scientific）をしたYPD寒天培地上で1つの小さなコロニーを選択します。 YPD液体に再懸濁コロニーの周囲に培養管と渦に棒を入れてください。
6. 14インチ試験管ホイール（ニューブランズウィックサイエンティフィック）を搭載したTC-7組織培養ローラードラム上で37°Cで一晩成長する。
7. 次の日に、1.7 mlチューブに1分（Axygen）に14000x gで培養液1 mLをスピンダウンする。上清を除去し、ボルテックス（VWRサイエンティフィック）は、ペレットを残液中で再懸濁します。
8. 追加1 mLの1×リン酸緩衝生理食塩水（VWRサイエンティフィック）と前述のようにスピン。
9. PBS洗浄を3回繰り返します。
10. 1X PBSで1:100に希釈液を希釈して（洗浄したC. albicansの10μL990μL1×PにBS）。
11. 血球（VWR Scientific）を頼りに。
12. 10 ⁷細胞/ mLに希釈する。

3。ゼブラフィッシュ感染

実験期間：****（1-3時間）

難易度：****

1. セクション5と卵を水の店、滅菌脱イオン水で60 mg / Lのインスタント海塩（フィッシャーサイエンティフィック）に従って胚を収集します。
2. そのようなオリンパスSZ61（オリンパス）、感染症の日dechorionate胚として解剖顕微鏡を使用します。チップの袋を開いたり、穏やかに絨毛膜に閉じた位置にピンセットを突く、その後徐々にそれらを開くように絨毛膜^27を引き離すためにデュモンDumoxelピンセット（VWR Scientific）を使用しています。魚は絨毛膜のうち右に表示されるはずです。
3. 皿の中心に魚を移動する上で渦蓋付き余分な深いペトリ皿を。ディッシュの蓋に魚を移します。卵水を除去し、新鮮な培地と交換してください。メディアに魚を追加します。
4. 28℃インキュベーター内で暖かい幼虫注入料理℃、魚を麻酔では200μg/ mlでtricaineメタンスルホン酸（西洋化学社製）希釈を準備します。
5. 感染症（20-50魚）の幼虫の希望数をカウントします。 tricaineメタンスルホン酸溶液中で魚を入れて、彼らは移動を停止するまで1-2分待ちます。
6. MPPI-3射出ユニット（応用科学機器）の電源をオンにします。圧力スイッチは、 "パルス"にあり、 "パルス持続時間は、"バックプレッシャ·ユニットの3 PSIを9に設定されていることを確認してください。射出ユニットの圧力が30 PSIを読み取るまで窒素タンクにバルブを開きます。
7. 1×10 ⁷細胞/ mlの濃度でボルテックスCandida albicansの5μLで引っ張らマイクロピペット^28をロードします。マイクロピペットホルダー（応用科学機器）のマイクロピペットを置きます。水と空の余分な深いペトリ皿を埋める。私は先端まで、マイクロピペットを移動ビュー内のsはちょうど顕微鏡解剖を経由して水の表面に触れると引っ張らピペットの先端から3mm程度の針をクリップするデュモンDumoxelピンセット（VWR Scientific）を使用しています。
8. 針が切り取られていることを確認するためのフットスイッチ（応用科学機器）を押します。あなたが成功した場合、液体が分散しているはずです。液体ボーラスの直径は²⁵プリムゼブラフィッシュの幼虫（0.21ミリメートル、容積は4.9 NLの球が得られる）の瞳孔の直径よりも大きくなるべきではありません。液体ボーラスが大きすぎるか小さすぎる場合に応じて圧力を調整します。
9. tricaineメタンスルホン酸塩の魚（200μg/ mLの）を麻酔。魚一旦移動、渦巻魚が中心になるまで、上の蓋と皿を停止しました。転送ピペット（フィッシャーサイエンティフィック）を使用して、50魚を集める。先端に向かって魚を解決するためのピペットの側をタップします。できるだけ液として使用して幼虫のアガロースの皿の上にそっとピペット魚。
10. 滑らかなガラス棒（それらを粉砕しないように注意してください！）で魚を並べる。料理の可能性からできるだけ液体として吸引します。すべての水分を逃がすためにキムワイプを使用しています。
11. あなたが同時に魚や針の良い眺めが得られるまで、顕微鏡下で魚​​の幼虫のアガロースの皿を置きます。魚に向かってガラス針を移動します。あなたは魚に向かって針を置くと魚と針の両方で拡大します。慎重に第一の魚の耳胞^27、29（耳）にガラス針を移動します。あなたは魚に針を移動した後、あなたはフットスイッチ（アプライド·サイエンティフィック·インスツルメンツ）を押したときに、後脳の脳室がわずかに持ち上げますので、あなたは知っているよ。
12. フットスイッチ（応用科学機器）を押すと、液体は魚の後脳室²⁷の内部に分散させる監視します。魚から針を撤回し、次の魚に移動します。お皿に魚のすべてを注入するまでの手順を繰り返します。任意のdを削除します。EADの魚（50魚）番号が正しい保つために代替品を注入します。 50魚のグループごとに新しいマイクロインジェクションニードルを準備する必要が注入された、 または C カンジダは、ニードルの底に沈殿し、それを下駄、または注入された濃度をオフにスローされます。
13. 皿を釣り、60 mLの卵水を含むきれいな余分な深いペトリ皿に魚の上に卵水を噴霧することにより料理の魚を洗​​い流してください。それよりも長い15〜20分間アガロース上で魚を残すことは重要ではありませんか、彼らは乾燥して死んでしまう。
14. 終了するまで全体の注入プロセスを繰り返します。 PBSおよび非病原性の注入されたコントロールを忘れないでください。
15. 終了したら、28で魚を保つ℃に
16. 窒素タンクのバルブを閉じます。タンクラインの圧力を緩和するために "連続"に "パルス"から射出装置のスイッチを移動し、圧力は、この時点でゼロに削除する必要があります。 "パルス"に戻って射出装置を切り替えます。射出ユニットの電源をオフにして、作業領域をクリーンアップします。

4。イメージングのための魚を準備する

実験期間：**（30分）

難易度：**

1. （200μg/ mL）を以前と同じようにtricaineメタンスルホン酸溶液を調製します。感染した魚を取り出すと、tricaineにそれらを転送します。
2. 卵を水に47.9 mLの0.4パーセントの低融点アガロース（VWR Scientific）を準備します。電子レンジでソリューションを加熱する。 37℃まで冷却し、混合物に追加tricaineメタンスルホン酸（200μg/ mL）を
3. 一度魚がtricaineメタンスルホン酸塩、0.4％低融点アガロース（VWR Scientific）を含むペトリ皿（VWR Scientific）をピペット個々の魚に固定化されています。
4. 次に、イメージングのためのガラスボトムディッシュ（マテック株式会社）の個々のウェルに低融点アガロースから魚を移動します。魚が皿の底に平らになるので、できるだけ少ない低融点アガロースとして使用します。のみを満たすのに十分なtricaine-アガロースを使用しガラスボトムディッシュのNERサークル​​。

5。 Joveのプロトコルに関連する変更

マイクロインジェクション用マイクロピペット

実験期間：*（10-15分）

難易度：*

1. Yuan らによるとザ·フレーミング·ブラウンマイクロピペットプラーモデルP-97（サッター·インスツルメンツ^）30を使用^して BF120-69-10（サッター·インスツルメンツ）中空ガラス棒を引き出します。以下の条件を熱= 470、ベロシティ= 120時間= 200でプログラム＃7を選択してください。その結果、針は8ベベルから先端までmmと、一度は、約10μmの直径を有し、先端から3 mm上でクリッピングされます。
2. ブラケットにガラスマイクロピペットをロードします。 "プル"を選択します。加熱フィラメントは、プログラムパラメータとガラス棒に応じて針が2引っ張らマイクロピペットに分離され加熱されます。ピペットの収納ボックス（SuttのストアマイクロピペットERの楽器）。

胚コレクション、モルホリノ注入とメンテナンス

実験期間：***（1-2時間）

難易度：***

3. Rosen らの方法に従って胚を収集します^31。産卵水槽（水​​生生息地）から卵を収集するためにプラスチック製のふるい（ナッツの用品）を使用します。余分深いペトリ皿の上に逆さまにふるいを保持し、卵を収集するためにタンクの水で洗い流してください。
4. モルホリノの準備のため、モルホリノ、300ナノモル（GeneTools、LLC）を300μLの滅菌水を追加します。これは、1.0 mMの作業用ストックを提供します。
5. 光度計（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用してモルホリノの濃度を確認します。 "核酸と、サンプルの種類を変更する"を選択して265に他の "と波長absorptivitで割った1000モルホリノの分子量を乗じて定数を入力します。yは係数モルホリノオリゴプロパティ·シートに記載されている。
6. 2μL0.1 N HClで空白光度計。 0.1 N塩酸（20倍希釈）を95μLにモルホリノ溶液5μLに希釈する。光度計台座をクリックし測定上の希釈の2μLを配置します。希釈率（20）で濃度を乗算します。これは、モルホリノのワーキング濃度を与える。ミリモル濃度を計算するには、モルホリノの分子量によって得られた濃度を割ります。
7. Danieauバッファー（58 mM塩化ナトリウム、0.7 mMの塩化カリウム、0.4mMのMgSO _4を 、0.6 mMのカルシウム（NO _3）2、5.0 mMのHEPES、pH7.6）で、0.01％フェノールレッド（VWRサイエンティフィック）にモルホリノの作業用ストックを準備します。
8. モルホリノ注入作業のためにローゼンら ^31、Yuan ら³⁰に従ってプロトコルに従ってください。 15分間28°Cで卵と水と暖かいとモルホリノ注入料理をすすぎます。注入料理とラインアップ1-Cから水を除去ピペットで注入皿の溝（第1節から調製された）にエルステージの胚。各プレートには約250卵を保持します。モルホリノ1〜2細胞期胚を注入します。卵は15分²⁷の1細胞期のままになります。
9. 余分深いペトリ皿に注入し終えた卵と水と卵（60 mg / Lのインスタントオーシャン塩と滅菌脱イオン水）と60 mLの卵水に場所を洗い流す。モルホリノ注入皿を再利用することができます。終了したら卵を水ですすぎ、4℃で保存し反転
10. 胚の保存のために60mLの卵を水皿に追加します。 60mLの卵を水で別々の余分な深いペトリ皿に転送ピペットで110の胚をカウントします。 28で微生物の増殖とインキュベートした胚を防ぐために、メチレンブルー℃、0.00003パーセントを追加します。
11. 胚の開発をスピードアップするには、胚は頭部に開発することができ、キンメルら ²⁷による24時間のステージに33°Cでの胚の料理を保つ75℃（プリム25ステージ^27）のトランク角度。
12. 幼虫の感染症の仕事のためにCで注入した後28°Cでの胚を保つカンジダ。
13. 毎日、60 mlの新鮮な卵を水で胚の料理を交換してください。

イメージング

実験期間：*****（1-5時間）

難易度：***

14. 前述のようにガラス底イメージング料理（マテック株式会社）でtricaineと低融点アガロース（4.2節に従って）で魚を準備します。オリンパスIX-81（オリンパス）倒立顕微鏡ステージ上に皿を置きます。微分干渉コントラスト（DIC）の光の下で4倍の倍率で焦点に魚を持参してください。画像が4X、20X、およびDIC、TRITC（テトラメチルローダミンイソチオシアネート）、及びFITC（フルオレセインイソチオシアネート）フィルタ設定の40倍の倍率でキャプチャすることができます。
15. FV-1とオリンパスIX-81倒立顕微鏡を使用します。000レーザー有賀らによると共焦点システムをスキャンする^32。 1から1.5μmのスライス感染の時間ごとにZ-スタックを設定することにより、40倍の倍率でのタイムコースを実施しています。
16. 2時間以上の長い時間のコースイメージングのために、イメージングの皿の魚2〜3時間おきの上に低融点アガロースの層を配置します。これは乾燥し、それを撮影されている間に魚を粉砕からアガロースを防ぐことができます。魚の数が少ない長い時間のコースでは、感染時に28°Cを維持するために、加熱ステージ（Bioptechs社）を使用します。

6。代表的な結果

成功した後脳室Cの例5時間後の感染症（HPI）と24 HPIにおけるゼブラフィッシュ幼生におけるカンジダ感染症は、（ 図1）に示されています。飲み込まCとマクロファージ様細胞カンジダは 5 HPIにおける後脳の心室で見られている。 24 HPI、C.カンジダは、マクロファージ様細胞の内側にある播種性カンジダ症の指標と背尾組織のだ。この感染症の結果は10-15酵母形C.の正確な注入に大きく依存後脳の脳室にカンジダ 。感染した魚のスクリーニングは、直ちに注入後は、これを確保することができます。

図1トランスジェニックFLI1：EGFP ^22、33幼虫は、フッ化カルシウム- yCherry カンジダ·アルビカンスに感染し、共焦点顕微鏡によってintravitally結像される。 （AC）5時間感染後、感染部位（後脳室）スケールバー= 100μmのマクロファージ様細胞をEGFP発現した（）感染幼虫。同じ魚の（BおよびC）高倍率画像を、C.を示す食細胞内カンジダ 。スケールバー= Bは100μmとC.（DF）フッ化カルシウム- yCherry Cと播種性カンジダ症で24時間感染後（D）感染幼虫のためには10μm EGFP MAC内部のカンジダ背尾組織のrophage様細胞。スケールバー= 100μmである。同じ魚の（EおよびF）高倍率画像を、C.を示す尾部組織におけるカンジダ 。スケールバー= 100μmである。

ディスカッション

ここで紹介するゼブラフィッシュマイクロインジェクション法は、Gutzman らとは異なります。ここではその³⁴我々は36から48 HPF幼虫の後脳室に耳胞を介して注入を示しています。我々は記述方法が減少し組織の損傷と後脳の脳室に10月15日酵母の一貫性の注入を可能にします。このプロトコルは、24 HPI（ 図1）と有意な死亡率/罹病率⁵の結果から、体全?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
産卵水槽	水生生息地	2L
1.7 mLチューブ	Axygen	MCT-175-C
インスタントオーシャン	フィッシャー·サイエンティフィック	S17957C
余分深いペトリ皿	フィッシャー·サイエンティフィック	08から757-11Z
標準のペトリ皿	VWRサイエンティフィック	25384-302
転送ピペット	フィッシャー·サイエンティフィック	13から711-7M
酵母エキス	VWR ScientiFIC	90000-726
ペプトン	VWRサイエンティフィック	90000-264
デキストロース	フィッシャー·サイエンティフィック	D16-1
寒天	VWRサイエンティフィック	90000-760
使い捨て血球	VWRサイエンティフィック	82030-468
リン酸緩衝生理食塩水	VWRサイエンティフィック	12001-986
デュモンDumoxelピンセット	VWRサイエンティフィック	100501-806
木製のダボ	VWRサイエンティフィック	10805-018
キムワイプ	VWRサイエンティフィック	300053-964
メルト低いアガロース	VWRサイエンティフィック	12001-722
注射料理のアガロース	VWRサイエンティフィック	12002-102
ブラウンマイクロピペットプラー燃える	サッター·インスツルメンツ	P-97
中空ガラス棒	サッター·インスツルメンツ	BF120-69から10	ブンゼンバーナー上に加熱することにより、滑らかなガラスのガラス棒のために
ピペットの収納ボックス	サッター·インスツルメンツ	BX10
MPPI-3噴射システム	適用された科学計測	MPPI-3
背圧ユニット	適用された科学計測	BPU
マイクロピペットホルダーキット	アプリエド·サイエンティフィック·インスツルメンテーション	MPIP
フットスイッチ	適用された科学計測	FSW
マニピュレーター	適用された科学計測	MM33
マグネットベース	適用された科学計測	マグネットベース
Tricaineメタンスルホン酸塩	西洋ケミカル株式会社	MS-222
解剖の範囲	オリンポス	SZ61トップSZX-ILLB2-100ベース
共焦点顕微鏡	オリンポス	FV-1000レーザー走査共焦点顕微鏡システムとIX-81
14インチ試験管ホイールとTC-7組織培養ローラードラム	ニューブランズウィックサイエンティフィック	TC-7
イメージング料理	マテック株式会社	P24G-1.0-10-F
針をロードするためのピペットチップ	エッペンドルフ	930001007
プレート注ぐグリッド	適応科学ツール	TU-1
加熱ステージ	Bioptechs株式会社	デルタT-5
平らなヘラ	VWRサイエンティフィック	82027-486
プラスチック製のふるい	ナッツオンラインの用品	12センチメートル
パラフィルム	VWRサイエンティフィック	52858-000
渦魔神	VWRサイエンティフィック	14216-184
16×150 mmの培養管	VWRサイエンティフィック	60825-435
光度計	サーモフィッシャーサイエンティフィック	ND 2000
フェノールレッド	VWRサイエンティフィック	97062-478
塩酸	VWRサイエンティフィック	87003-216
NaClを	VWRサイエンティフィック	BDH4534-500GP
塩化カリウム	VWRサイエンティフィック	BDH4532-500GP
MgSO 4で	VWRサイエンティフィック	BDH0246-500GP
のCa（NO 3）2	VWRサイエンティフィック	BDH0226-500GP
HEPES	VWRサイエンティフィック	BDH4520-500GP
Morpholinos	GeneTools、LLC