RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析<em&gt; in situで</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

要約

蛍光灯その場でハイブリダイゼーション（FISH）は、複数のメンバーを同時に転写などの多遺伝子活性の分析を可能に VAR多重遺伝子ファミリーで熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）感染した赤血球 ¹。技術が適応さや遺伝子、細胞及び生物のさまざまな種類で使用することができます。

要約

マラリア感染時のヒト内皮受容体に熱帯熱マラリア原虫感染赤血球（IE）の接着は 、var遺伝子によってコードされたPfEMP1タンパク質変異体の発現によって媒介される。

ハプロイドP.熱帯熱マラリア原虫のゲノムは1つだけですが、感染症の血液の段階で一度にセルごとに転写されると考えられていたそのうちの約60種類のvarの遺伝子を抱いている。 varの遺伝子転写のような相互に排他的な規制がどのように実現されるか、個々の遺伝子やvarの異なる受容体とPの臨床転帰の差動結合の結果に関連付けられているvarの遺伝子のサブグループの識別があるので、不明である熱帯熱マラリア原虫感染症。最近では、相互に排他的な転写のパラダイムは、個々のPに基づいて転写アッセイによって疑問に呼ばれてきたシングルinfに熱帯熱マラリア原虫の転写産物の同定Pの個々の核内寄生虫によるvarの遺伝子転写のin situハイブリダイゼーション（FISH）分析に蛍光RNAを用いてected赤血球細胞熱帯熱マラリア原虫 、IE ^1。

ここでは、Pの単核の var遺伝子転写の解析のためのRNA-FISH法を実施するための詳細なプロトコルを提示熱帯熱マラリア原虫は、ヒト赤血球に感染した。方法はジゴキシゲニンとTSA Plusの蛍光パレットシステム^2（パーキンエルマー）、顕微鏡分析と新たに選択されたPを使用してビオチン標識アンチセンスRNAプローブの使用に基づいています熱帯熱マラリア原虫のIE。 in situハイブリダイゼーション法Pのさまざまな段階で発現している遺伝子の多様性の転写および規制を監視するために使用することができます熱帯熱マラリア原虫のライフサイクルとは、他のマラリア原虫種と他の生物や細胞のタイプに適応可能です。

プロトコル

1。たての選択感染赤血球の生成

PfEMP1タンパク質の表面発現のために新たに選択したカルチャを使用しているときは、このアッセイのために、最良の結果が得られる。この特定の実験3D7 Pにおける熱帯熱マラリア原虫の系統は、前述の¹と特異的な抗体を用いて選択した。

1日目

1. Pから満員の血液細胞の収穫を200μl 熱帯熱マラリア原虫の培養は室温で8分間800×gで遠心分離することにより2から5パーセント後期IEを含む。
2. 37 2mlの血液ペレットを再懸℃の暖かい0.75パーセントゼラチン14ミリリットル滅菌チューブ内の溶液、土砂に感染していないとリングステージIEを可能にするために37℃で15〜20分放置します。
3. 後期IEを収穫、新しい14 mlチューブに、上相、 すなわち 、37℃の温かいRBC-ウォッシュメディアの10mlで2回洗浄する。
4. 特異的な抗PfEMP50μlの希釈37℃暖かいRBC-ウォッシュメディアおよび滅菌フィルタ2ml中1抗体。
5. 37℃で30分間、14ミリリットル滅菌チューブとインキュベートし、穏やかに攪拌しながらCの滅菌希釈血清で洗浄後期IEを混ぜる。
6. 室温で8分間800 xgでスピンダウンして、37℃の温かいRBC-ウォッシュメディアの10mlで2回洗浄する。
7. DynaMaq-15磁石を使用してRBC-ウォッシュメディアとサスペンション倍Dynabeadタンパク質の50μlを洗います。
8. 300μlのRBC-ウォッシュメディアでのDynabeadsを再懸濁し、洗浄された後期のIEに追加します。穏やかに撹拌しながら37℃で30分間インキュベートします。
9. DynaMaq-15磁石にチューブを転送します。 1〜2分放置し、すべての液体を除去。
10. RBC-ウォッシュメディアの4-5 mlのダイナビーズを再懸濁します。磁石の上に戻ってチューブを転送し、すべての液体を除去する前に、1〜2分間放置します。一度洗浄工程を繰り返します。
11. 25cm ^2の無菌培養fに洗浄したビーズを転送200μlの新鮮な濃厚赤血球を含むラスク。文化にAlbumaxメディアの5-6 mlを加える。 37℃、5％CO _2℃で一晩保存する

2日目

12. 選択されたIEが14ミリリットル滅菌チューブにすべての文化を転送することによって、新鮮な赤血球をreinvadedた培養液からのDynabeadsを削除します。 DynaMaq-15磁石の上にチューブを入れて、1〜2分間放置します。その後、培養フラスコに、すべての液体の背中を注ぐ。
13. 5-10％の寄生虫血症まで、できるだけ少ないサイクルの文化や寄生虫はringstageにあります。
14. IEが正しい表面表現型、どちらPFD1235wのand/orPF11_0008 すなわちタンパク質の発現は^1が得られ^ていることを確認するために、FACSによって分析されるべきである。

2。プローブの調製

アンチセンスRNAプローブはPFD1235wとPF11_0008 varのほとんどの可変領域から生成された<Pから/ em>の遺伝子熱帯熱マラリア原虫 3D7ゲノムDNA。 DNAは、製造元の説明（Roche社）によると、それぞれPCRで増幅し、転写のためpSPT18または19ベクターにクローニングした。プローブ（580塩基対（bp）で、長さは590 bp）をそれぞれDIG RNAラベリングキットまたはビオチンRNA標識ミックスを使用して、ジゴキシゲニン（DIG）またはビオチンで標識した。我々は両方のノーザンブロット分析により、単一ラベルのFISH解析¹によるプローブの特異性を確認した。

3。 in situハイブリダイゼーションの前に寄生虫の薄層塗抹標本および固定

1日目

すべての手順は、RNaseフリーの環境で実行されて、すべての試薬はRNaseフリーまたはジエチルピロカーボネート（DEPC）またはRNase ZAP（Invitrogen）を用いて前処理されています。スライドとカバースリップ残留製造グリースを除去するためにアルコールで洗浄してください。ステップ間で途切れることなく、プロトコルを実行することが重要ですヌクレアーゼの混入の危険性を最小にするために。

1. 標準拡散法³により細い血管映画を作る。顕微鏡の100倍の油浸対物レンズを使用して、IEを数え、文化の中でIEの割合を計算する。寄生虫段がリングとIEサイクルの早期栄養体段階で、おおよその同期であることを確認します。これらは、事前に複製、単核生成段階、発現しているvarの遺伝子のmRNAとこのタイプの単一細胞のFISH転写アッセイに適しています。
2. 1.5ミリリットルRNaseフリーのエッペンドルフチュー​​ブに、5〜10％の寄生虫で、原虫の培養液50μlを転送します。室温で2,000 rpmで1分間遠心します。
3. メディアを取り出し、DEPC処理水に50μlのPBSのpHは7.2を追加します。優しくチューブを攪拌。メディアや細胞の破片から遊離細胞を洗浄するために二回遠心沈降ステップを繰り返します。
4. 4良質薄い塗抹標本を作成します。各スメアについては、上に1スミアを作るよくRNaseフリーフードで合計4ウェルスライド、 すなわち 4スライドガラス、（ 重要なステップ ）のいずれか11ミリメートルの直径。波は乾燥するために空気中に簡単にスライドします。特定のプローブ、RNase処理のために別のスライドと、目的の遺伝子を発現していないIEを含む3枚目のスライドを使用して、他の無関係な遺伝子のための単一のプローブ染色に陰性コントロール-1のスライドの3つの余分なスライドを作成した。 10〜20分間ベンチに乾燥するスライドのままにしておきます。
5. ウェルに4％パラホルムアルデヒド、5％氷酢酸を含む固定液の60μlを添加して薄膜を修正します。室温でベンチで10分間のままにしておきます。
6. 室温で穏やかに撹拌して5分間2×SSPEバッファでスライドを洗浄します。簡単に言えばティッシュペーパーで軽く細胞を含むウェルに触れることにより、過剰な液体を除去。
7. 37℃（ 非常に重要なステップで2分間、0.01M HCl中で0.01％のペプシンでスライドをカバー）。室温で5分間、2×SSPEでスライドを洗浄します。
8. 10μg/ mlの最終濃度までのRNase溶液を希釈。のRNase溶液60μlをネガティブコントロールスメアをカバーしています。 37℃で30分間インキュベートした後、室温で5分間、2×SSPEでスライドを洗浄してください。
9. ハイブリダイゼーション工程に即座に進みます。

4。固定スライドへのRNAプローブのハイブリダイゼーション

1日目

1. そのようなThermoStar 100 HC4またはRNaseザップを噴霧し、それはティッシュペーパーできれいに拭いて、クリーンオーブンに入れて空のピペットチップボックスとしてハイブリダイゼーションチャンバーを準備します。スライドはハイブリダイゼーション中に乾燥しないことを確認するためにハイブリダイゼーションチャンバーまたはDEPC処理水でボックスの下部のチャンネルを埋める。 48にチャンバーと予熱を閉じ℃に
2. 12 ng /μlに、最終濃度のハイブリダイゼーション溶液中にプローブを薄める。加熱ブロック中で5分間65℃プローブ溶液°Cを変性。直ちに氷上で冷却する。
3. 簡単に言えば空気は2x SSPEの洗浄された後はスライドを乾燥させてください。慎重にティッシュペーパーで井戸の周り過剰な液体を除去。
4. ハイブリダイゼーションチャンバを開き、チャンバー内でスライドを配置します。 1またはウェルあたり60μlの総体積で両方のプローブを適用します。慎重に滅菌ピンセットを使用してRNaseフリーカバースリップで液滴をカバーしています。
5. チャンバーを閉じて、一晩、少なくとも16時間48℃でスライドをハイブリダイズする。

5。抗体結合と蛍光増幅

2日目

次の手順は、パーキンエルマーから、TSAプラス蛍光パレットシステムに基づいています。すべてのステップは室温で行われています。

1. 穏やかに攪拌しながら5分間スライドをTNT緩衝液で3回洗浄する。
2. 30分間TNBバッファー150μlのウェルをブロック。
3. 1:500の割合で、TNBバッファーで1:100の割合でTNBのバッファ内のHRP-結合のα-DIG抗体とHRP標識α-ビオチン抗体を希釈します。ティッシュペーパーを使用してスライドから余分TNBバッファを削除します。同時に2つの転写物を検出した場合、両方の抗体が一度行くことができます。ウェル当たり抗体-TNB溶液を100μlの合計額を適用し、慎重にカバースリップで覆う。 2時間スライドをインキュベートする。
4. 慎重にカバースリップを取り外します。 5分間3回のTNT緩衝液中でスライドを洗浄します。
5. 1:500の割合でチラミド増幅試薬には、FITC蛍光体を希釈し、各ウェルに溶液100μlを適用します。カバースリップでウェルをカバーし、12分間インキュベートする。
6. 慎重に滑ると穏やかに攪拌することにより、TNTのバッファーで5分間スライドを3回洗ってカバーを外します。
7. 1:500の割合でチラミド増幅試薬でCyan3 - フルオロフォアを希釈します。当たり100μlを加えこのソリューションの井戸。カバースリップでウェルをカバーし、12分間インキュベートする。
8. TNTのバッファ内に浸漬することにより素早くスライドを注意深くリンスしてからカバーガラスを外します。
9. 5分間のTNT緩衝液を用いてスライドを3回洗浄します。
10. DEPC処理水にすばやくスライドを浸す。
11. 空気乾燥したスライドを残す。 DAPIを含む抗退色試薬でスライドをマウントします。マニキュアでカバースリップの四隅をシールします。
12. スライドは現在、顕微鏡検査のための準備が整いました。実験は次の日に完成しなければならないならば4でアルミホイルや店舗で覆われたスライド℃で保管してください。スライドの側面の完全な密封は、抗フェード試薬を適用した24時間後に行うことができる。これはプロトコルが完了した後、スライドを1週間用に撮像することができるようになります。

6。ハイブリダイズしたプローブの可視化

1. 顕微鏡の電源をオンにします。標準免疫蛍光顕微鏡はsufficです実験のこの種のientが、あなたはまた、3D映像のためにこれを使用するか、またはあなたの染色された細胞のビデオを得るために共焦点顕微鏡へのアクセスを持っている場合。顕微鏡は、15〜30分間ウォームアップしてください。コンピュータとソフトウェアのスイッチをオンにします。
2. 免疫蛍光顕微鏡で染色の品質を確認してください。少数の寄生虫を含むスポットを選択してください。
3. 手動で各レーザのゲインを調整します。ピクセルは4-6 M ^{-1 s -1で} 、512×512ピクセルへのステップに住む調整します。
4. フレームラムダを使用してテスト撮影してください。レーザーゲインを再調整します。
5. 蛍光単一細胞の20良い写真の最小値を取る。 5月20日の寄生虫を含むフィールドの少なくとも2月5日の画像は正寄生虫の割合の公正な概観を得るために必要とされている。

結果

図1に、主な手順やRNA FISH法の持続時間を示すフローチャートである。

シングルPを使用してよく、不十分保存ステンドmRNAのFISH実験の代表的な一連の画像熱帯熱マラリア原虫のIEを図2に示します。この細胞内原虫はDAPIで青色に染色されている小さな（1〜1.5μmの直径）は核を持っています。二十四時間Pの赤血球侵入後

ディスカッション

のRNA FISH分析は、例えば、ノーザンブロットおよびRT-PCRなどの方法とは対照的に、単一細胞レベルで特定のmRNA転写物の識別を可能にします。これにより、P.、この例では、転写活性および不活性細胞を区別することができ寄生原虫は、ヒト赤血球内原虫。このような全細胞の観察はしばしば必要であり、重要かつ新規な転写パターン^1を解明することがあります。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	注釈
酢酸	シグマ/アルドリッチ	338826〜100ミリリットル
Albumaxメディア：RPMI 1640グルタミンソリューション	ロンザ	BE12-115F	500ミリリットルのRPMI 1640 5 mlのグルタミンソリューション
Albumaxメディア：ゲンタマイシン硫酸Albumax溶	ロンザ	BE02-012E	2.5ミリリットルゲンタマイシン硫酸塩 50ミリリットルAlbumax溶
Albumax-ソリューション：ヒポキサンチン	シグマアルドリッチ	H9377	0,8グラムヒポキサン​​チン
Albumax-ソリューション：AlbuMAX II	私nvitrogen	11021-037	200グラムAlbumax
Albumax-溶液：RPMI 1640	ロンザ	BE12-115F	4リットルRPMI1640中 maxで磁石で溶かす。 50℃フィルタリング殺菌し、アリコートで-20℃で保管してください。
アンバーライト	シグマ	A5710-110G	脱イオンホルムアミドをする樹脂。
抗ビオチンヤギpAbのペルオキシダーゼコンジュゲート	カルビオケム	203206
抗DIG抗体	Novusの生物学的製剤	NB100-41330
DAPIでアンチフェード試薬	インビトロジェン	P36931	マウントメディアを完全にスライドを密封する24時間前に硬化されています。
ビオチンRNAラベリングミックス	ロシュ	11685597910
デジタルカメラ	Nikonデジタル視力DC-F11
カバースリップ	メンツェル·グレイザー	631-1570
培養フラスコ25cm 2の Nunclon面	ヌンク	156340
DEPC	フルカ/シグマ	32490〜100ミリリットル	千ミリリットルdeinonized水で1mlのDEPC。攪拌棒を追加し、12時間撹拌した。 30分間オートクレーブ。
デジタルカメラ	Nikonデジタル視力DC-F11
ダイナプロテイン	インビトロジェン	10002D
DynaMaq-15マグネット	インビトロジェン	123-01D
ホルムアミドbioultra 99パーセント	フルカシグマ/	47671〜1リットル-F	脱イオン化ホルムアミド：ホルムアミド100ml当たりのイオン交換樹脂が5グラム。 30分かき混ぜる。ワットマン濾紙でろ過。
ゼラチン0 75％溶液：ゼラチン	シグマアルドリッチ	G2500	500ミリリットルRPMI 1640中3.75グラムゼラチン。 〜56℃に加熱溶解する。ときに56℃殺菌フィルタリング分注して-20℃で保存。
。ゼラチン0 75％溶液：RPMI 1640	ロンザ	BE12-115F	500ミリリットルRPMI 1640中3.75グラムゼラチン。 〜56℃に加熱溶解する。ときに56℃殺菌フィルタリング分注して-20℃で保存。
グルタミン溶液：L-グルタミン	シグマアルドリッチ	G3126	500ミリリットル0.9％NaCl中14.6グラムのLグルタミン。溶かし、フィルターのterilizeとアリコートで-20℃で保管してください。
グルタミン溶液：塩酸	シグマ	H1758	500ミリリットル0.9％NaCl中14.6グラムのLグルタミン。溶解、滅菌フィルタし、アリコートで-20℃で保管してください。
ハイブリダイゼーション溶液：ホルムアミドバイオ超99パーセントSSCの20倍	フルカ/シグマ	47671〜1リットル-F	合計20ミリリットルは、アリコートで-20℃で凍結させておく 10ミリリットル脱イオン化ホルムアミド
ハイブリダイゼーション溶液：デンハルト50倍濃縮	シグマ	D2532	5ミリリットル20xSSC
ハイブリダイゼーション溶液：酵母tRNARocheブロッキング試薬	シグマ	R-6750	2ミリリットル50倍デンハルト 酵母tRNAミリリットル当たり250μlの20 mgの
ハイブリダイゼーション溶液：サケ精子DNA	フルカ/シグマ	31149-106GF	0.4グラムロシュブロッキング試薬 mlのサケ精子DNAあたり10mg（：変性サケspermDNA 96で5分間℃のハイブリダイゼーション溶液に添加する前にクリティカル）の1ミリリットル
ハイブリダイThermoStar 100 HC4	Quantifoilインスツルメンツ社	1004-0011	ハイブリダイゼーションオーブンとDEPC水で水増しRNaseフリーのハイブリダイゼーションチャンバーに置き換えることができます。
浸油UV透過蛍光無料	シグマ	10976-1EA
免疫蛍光または共焦点顕微鏡	ニコンD-EclipseのTE2000C
Nailpolish	任意のドラッグストアで利用可能
PBSで20倍：塩化ナトリウム KClを のNa 2 HPO 4×2H 2 O KH 2 PO 4 DEPC脱イオンH 2 O			pHを7.4にアジャスト 160グラム 4グラム 23グラム 4グラム 1リットル
パラ4パーセント	フルカ/ chemika	76240	80ミリリットルのPBS / DEPCで4グラムPFA。 65℃の熱PFAが溶けるまで。 20ミリリットルのPBSを加え、溶液が冷却させます。 pHを7.4に調整してください。フィルター。 -20℃でアリコートで保管
パラ4パーセント/酢酸五パーセント			950μlのparaformaldhyde +50μlの酢酸
ペプシン	シグマ/アルドリッチ	P7000
ペルオキシダーゼ標識抗ビオチン	カルビオケム	203206
RBC-ウォッシュメディア：RPMI 1640グルタミンソリューション	ロンザ	BE12-115F	500ミリリットルのRPMI 1640 5mlのグルタミンソリューション
RBC-ウォッシュメディア：硫酸ゲンタマイシン	ロンザ	BE02-012E	2.5ミリリットルゲンタマイシン硫酸塩
アーゼ	シグマ/アルドリッチ		10 mg / mlの原液を作る。
RNaseフリーの1.5 mlチューブ	アンビオン	AM12450
RNaseのザップ	アンビオン	AM9780
4ウェル11ミリメートルスライド	サーモサイエンティフィック	MENZXER306W
SSCの20倍：塩化ナトリウム	シグマ/アルdrich	S9625	3 MのNaCl（175グラム/リットル）0.3MのNa 3クエンX、H 2 O（88グラム/リットル）は、1M HClでpHを7.0に調整し
SSCの20倍：クエン酸ナトリウム水和物	シグマ/アルドリッチ	W302600	3 MのNaCl（175グラム/リットル）0.3MのNa 3クエンX、H 2 O（88グラム/リットル）は、1M HClでpHを7.0に調整し
20X SSPE：NaClを	シグマ/アルドリッチ	S9625	175.3グラムのNaCl
SSPE 20X：のNaH 2 PO 4	シグマ/アルドリッチ	S0751	27.6グラムのNaH 2 PO 4。
SSPE 20X：4 EDTA粉			9.4グラムのEDTA粉 DEPC処理水を加え、pHを7.4に調整。オート20分間オ​​ートクレーブ
TNBバッファー：TNTバッファー			10ミリリットルのTNTバッファー
TNBバッファー：ブロッキング試薬			0.05グラムブロッキング試薬 ブロッキング試薬を溶解するために、攪拌しながら1時間60℃に溶液を加熱する。 -20℃で保存する。 （パーキンエルマー社TSA-プロトコルから派生したもの。）
TNTバッファー：トリス/ HCl	シグマ	T1503	1Mトリス/ HCl、pH8.0で
TNT緩衝液：塩化ナトリウム	シグマアルドリッチ	S9625	100ミリリットル
TNT緩衝液：ツイーン20	シグマ	93773	5 M NaClを30ミリリットル 1ミリリットルのDEPCのdH 2 O869 M1の 室温でpHを7.5に調整してください。 （パーキンエルマー社TSA-プロトコルから派生したもの。）
TSAはプラスCyanine3 /フルオレセインシステム	パーキンエルマー	NEL753000IKT	実験を開始する前に、慎重にTSAからプロトコルプラス蛍光パレットシステムをお読みください。
滅菌チューブ14ミリリットル	Almeco - CM LABのAP	91016