微小環境マイクロアレイの作製と利用（MEArrays）

要約

細胞機能上の微小環境の分子組成の影響についての洞察を得るためのコンビナトリアル機能的スクリーニング方法が記載されている。この方法は、細胞接着および機能解析をサポートしていることを定義したコンビナトリアル微小環境の配列を生成するために、既存のマイクロアレイベースの技術を活用しています。

要約

細胞とその周囲の微小環境との相互作用が細胞挙動のために機能的な結果をもたらす。単一細胞レベルでは、異なる微小環境は、分化、遊走および増殖表現型を課すことができ、組織レベルでの微小環境は、形態形成および腫瘍形成¹のような複雑な処理します。のみならず、内微小環境への影響の細胞および分子細胞内容物をしますが、とても弾力性^2、組織の幾何学^3を行う。細胞間、ECM-、および-可溶性因子の相互作用の総和として定義されて、物理的な特性に加えて、微小環境は複雑である。組織内の細胞の表現型は、それらのゲノムコンテンツやmicroenviroment持つ組み合わせの相互作用に起因して部分的に部分的に起因している。主要な課題は、独特の行動と微小環境の成分の特定の組み合わせをリンクすることです。 ENT ">ここでは、コンビナトリアル⁴微小環境との相互作用の細胞ベースの機能的スクリーニングのための微小環境マイクロアレイ（MEArray）プラットフォームを提示します。方法は分子組成と弾性率の同時制御を可能にし、広く利用可能なマイクロアレイの使用を組み合わせと微細技術。MEArray画面では、以下のよう成体前駆細胞などの珍しい種類の細胞の機能研究を容易にアレイあたり10,000細胞、できるだけ少ない必要があります。テクノロジーの限界は、その全体組織微小環境が完全MEArraysに要約されることができないですが、との比較多数の関連微小環境に同じ細胞型の応答は、例えば特定の組織を特徴付けるECMタンパク質のペアの組み合わせは、微小環境の成分が組織特異的機能の表現型を引き出す方法についての洞察を提供します。

MEArraysは、組換えGROの多種多様を使用して印刷することができますwthの因子、サイトカイン、および精製されたECMタンパク質、およびそれらの組み合わせが含まれる。プラットフォームは、特定の試薬の利用可能性によって制限されています。 MEArraysは、時間経過の分析に適しているが、ほとんどの場合、蛍光プローブを用いた測定可能である細胞の機能のエンドポイントの解析に使用されています。例えば、DNA合成、アポトーシス、分化した状態の取得、または特定の遺伝子産物の生産は、一般的に測定されています。簡単に言えば、MEArray実験の基本的な流れは、印刷基層でコーティングスライドを準備し、印刷されるタンパク質のマスタープレートを準備することです。アレイはマイクロアレイロボットで印刷されその後、細胞培養中で成長し、接続を許可され、その後、化学実験のエンドポイントに達した時点で固定されています。従来の顕微鏡やマイクロアレイスキャナーで画像化蛍光または比色アッセイは、関連する分子や細胞の表現型を示す（ 図1）を明らかにするために使用されています。

プロトコル

1。印刷の基質の調製

ポリジメチルシロキサン（PDMS）被覆（PA）またはポリアクリルアミドコートスライドを使用するかどうかの判断は、実験的なデザインの重要なパラメータに依存する。両方のポリマーの弾性率は、PDMSのベース/硬化比、およびPAのアクリルアミド/ビスアクリルアミドの比率を変えることにより、異なる組織の剛性を模倣するように調整することができます。 PDMSは1-10MPaと（ 例えば、軟骨、角膜、動脈壁）の範囲で硬めの組織を模倣することができ、PAは100Pa-100kPaの範囲で柔らかい組織（ 例えば、乳癌、脳、肝臓、前立腺^）5を模倣^すること^ができます。 PDMSは、調製が容易で、安価であり、印刷されたフィーチャのジオメトリは、印刷のピンの頭と同じになります。したがって、特徴の大きさや形状を正確に異なるチップジオメトリとピンを使用して制御できます。 PDMSは、細胞のハンドリングとimmunos中にいくつかの課題が発生し、PA、より疎水性である手順を泰寧、といくつかの細胞株との互換性がないかもしれません。 PAは、ヒドロゲルとネイティブ非汚染面であるので、細胞は、細胞接着を支えるタンパク質が存在する箇所にアタッチされます。 PAのゲル上のプリント機能のジオメトリは正確にピンヘッドのジオメトリには従いません。通常、彼らは関係なく、使用されているピンヘッド形状の、拡散のためのサークルになります。印刷の接触時間とピン径パラメータは経験的に、PAゲル上で最適なフィーチャサイズを決定することができる。

ポリジメチルシロキサン（PDMS）

1. 使い捨てのプラスチックコップに10:1の比率で硬化​​剤とシルガード184シリコーンエラストマーベースを組み合わせて、30分間室温真空鐘で脱気後、圧子、木製やプラスチック製の舌と激しく混ぜる。
2. センターその後スピンコーターの真空作動チャック上の標準顕微鏡スライド、スライド面の中心に混合エラストマーポリマーの霧雨0.5ミリリットル。で回転60秒のために6,000 rpmで。
3. 70℃のオーブンで、または一晩に4時間、デジタルホットプレート（ほこりから保護されている）上にPDMSをコートしたスライドを治す。
4. 硬化したスライドはすぐに使用、またはプラスチックジップロックバッグに密封し、引き出しの中に保持されスライドボックスに数ヶ月のために保存することができます。 PDMSは、それはよく室内の空気の循環から保護されなければならないので、ほこりを集めています。
5. 注：PDMSエラストマーキットで作業するときニトリルまたは他の非ラテックス手袋を着用しなければならない。ラテックス手袋との偶発的接触は、PDMSの重合を阻害することになります。

ポリアクリルアミド（PA）

6. NaOHのエッチング：80℃のヒートブロックの上に置いてスライド℃、スライド全体の表面を覆うように確認しながら、各スライドに1ミリリットル0.1NのNaOHを加える。 （白いフィルムは、スライド表面に形成すべきである）のNaOHを蒸発させてください。 PAのゲルだけをNaOHエッチングされた表面にしっかりと取り付けることができるので、PAのゲルは、スライド全体のサーフならステップを乾燥中にデタッチされますエースをNaOHでカバーされていません。スライド表面が完全に覆われていなかった場合、1ミリリットル0.1N NaOHを添加して繰り返します。スライドはその後数日間室温（RT）で保存することができます。注意：水酸化ナトリウム·エッチングに代わるオゾンやプラズマクリーンスライドをすることです。
7. 3 - アミノプロピルトリエトキシシラン（APES）コーティング：ドラフトでは、15mlのシャーレ内の場所スライド、それぞれNaOHのエッチングされたスライドに300μlの猿を追加します。類人猿は5分間のNaOHスライドと反応してみましょう。この時間を超えると、未反応のAPES試薬を洗い流すことが困難の原因となります。スライドの両側に徹底的に脱イオン水を用いて猿2〜3回洗浄する。洗浄が完了していない場合、類人猿は、ステップ1.8のスライドに茶色の沈殿物を形成するために、グルタルアルデヒドによって酸化されます。
8. グルタルアルデヒドの酸化：スライド表面から全ての溶液を吸引します。各15 cmディッシュでは、PBSで25ミリリットルの0.5％グルタルアルデヒドを追加します。暗いエリアで30分間反応させる。 30分後、すべてのグルタルアルデヒドを吸引し、非糸くずの労働力を使うatoryワイプ（ 例：キムワイプ）を慎重にスライドを乾燥させる。次いで、スライドを1日まで室温で保存することができます。
9. ゲルの調製：30分間脱気し、以下の表によると中のアクリルアミド、ビスアクリルアミドとddH ₂ Oを含むPAの混合物を調製した後、重合を遅くするために氷の上でPAの混合物を配置した後。 APSとTEMEDを加え、ゲルを行う前に、右のよく混ぜる。スライド面と場所24ミリメートル×50ミリメートル、ペンシルバニア州の上にナンバー1のカバースリップ上にピペットでPAの混合物が挙げられる。一緒に押してカバーガラスとスライドガラスを避け、バブルが形成されるのを防ぐ。他のゲルは350μlを使用するためにゲル用> 40,000 Paは、100μlを使用しています。

希望の弾性率（Pa）で	アクリルアミド％	ビスアクリルアミド％	40％の在庫からアクリルアミド（ミリリットル）	2％の株式からビスアクリルアミド（ML）	脱イオン水（ml）を	APS（μL）	TEMED（μL）
480±160	3	0.06	0.75	0.3	8.95	100	10
4470±1190	5	0.15	1.25	0.75	8	100	10
40400±2390	8	0.48	2	2.4	5.6	100	10

^6,7からの適用。

10. PAのゲルが2時間重合させてください、そして、次に脱イオン水の下にカバースリップを削除します。
11. 未反応のアクリルアミドを削除するには、一晩水に大COPLANジャー（〜8時間）でのPAゲルスライドを洗浄します。
12. 2から4時間、またはPAゲルまで、37℃のオーブン中で乾燥したスライドが完全に硬化する。
13. PAゲルスライドは密封されたスライドボックスで1ヶ月間、4℃で保存することができます。

2。タンパク質原版の準備

1. すべてのタンパク質shoulDプロバイダが推奨するバッファに10Xソリューションの株式に分注し、-80℃で保存することほとんどのECMタンパク質は、脱イオン水に可溶であるが、pHは酢酸の滴で調整する必要があります。最も成長因子、サイトカイン、および組換え受容体細胞外ドメインは、BSAをPBS中で調製されていますが、メーカーの条件が異なります。 0.45μmで保存する前に4 mmのナイロンシリンジフィルター（Nalgene）を介してタンパク質のアリコートをフィルタリングします。
2. 所望のタンパク質の組み合わせと、希釈に従ってマスタープレートを設計します。接着細胞は通常、細胞接着を媒介するために少なくとも1つの互換性のあるECMの存在に依存しますが、細胞表面エピトープに対する抗体はまた時々アタッチメントを媒介することができる。これは、配列は後で簡単に配向させることができるように、よくうちの少なくとも一方にフリーのFITC染料またはfluorphore共役タンパク質を追加することをお勧めします。
3. 100mmの構成印字バッファを持つタンパク質の組み合わせを希釈することにより、マスタープレートを準備Tris-acetate/20％glycerol/0.05％トリトン-100X pHは5.2。典型的には384ウェルプレートの各ウェルには10以上の液が含まれていません。
4. タブ区切りのデータ·ベース·ファイル内の各マスタープレートの各ウェルの内容を記録して、一意の識別番号で各マスタープレートを提供する。デザイナーのイニシャルが続く6桁の日付は、しばしば目的（MMDDYYinitial）提供しています。よくボリュームが小さいので、タンパク質のアリコートは、レプリケートプレートの大規模な番号を生成するために効率的に使用することができる。これは、マスタープレートを-80℃で保存することをお勧めします℃、各マスタープレートが2つ以下の凍結融解サイクルを受けるべきである。

3。 MEArray印刷

1. MEArraysは、ほとんどの従来のマイクロアレイプリンティングロボットで印刷することができます。シリコーンまたはステンレス鋼製のピンのいずれかを使用クイルピンプリンタがうまく動作しますが、蛋白質の粘度が問題になることがあります。彼らは仕事としてキャピラリープリンタは、このアプリケーションのための理想的なマイクロアレイプリンティングロボットですよく粘性タンパク質溶液である。
2. アレイ内で良好な統計的検出力を達成するために、それぞれの微小環境の10から12複写スポットが推奨されます。このような設計は、単純なT-検定統計量を使用して、同じアレイ内の別の微小環境における活性の比較は相対的なことができます。 Dunnetteのテストは、他の微小環境との統制環境での活動を比較するために使用できます。機能的な表現型がMEArray実験を行う前に、コントロールの微小環境に関連付けられている場合は、このデザインが最も適しています。
3. 湿度は50％前後に維持されるべきである。湿度が低く、ピンの内側または印刷基質上で非効率的な堆積を引き起こすマスタープレートのウェル中の溶液を乾燥させることができるので、湿度管理が重要です。湿度は非多孔性プラスチックシートを備えたロボットを立体裁断し、50％の湿度を維持するように設定加湿器およびデ加湿器の両方を使用して効果的に制御することができる。冷却印刷plattensはUSEFすることができますいくつかのタンパク質を保持するためのULが、注意がスライドに結露が生じるのを避けるために注意しなければなりません。
4. 印刷された各アレイは、3桁の数字（MMDDYYinitial-nnn）が続いてマスタープレートの識別子で構成されてシリアル番号を使用してエンコードされたフリーザー防スライド標識で標識されるべきである。すべての配列が使用または配布されたように、彼らの実験的な治療の詳細については、データベース内で維持されるべきである。印刷の日付とマスタープレートの凍結融解サイクル数を追跡することで再現性を維持するための最適な条件を識別するのに役立ちます。
5. プリントMEArraysは一箇月-20℃で密閉されたスライドボックスに格納する必要があります。再現性が著しく低下し、その後。

4。機能解析のためのMEArrays上で培養哺乳類細胞

1. 培養チャンバーを取り付け：メディアとMEArrays上での細胞培養に必要な数のボリュームを制限するために、プラスチック製のチャンバーはf印刷された配列を囲むようにitted。多くのアレイでは、4.2 cm ²の面積が含まれている2 -チャンバースライド（Nunc）中から単室を使用することができます。製造チャンバースライドからチャンバーを取り外して、カミソリの刃で半分にチャンバーを切った。 MEArrayの表面上室と報道のエッジに水槽シリコーンの薄いビード（DAP）を適​​用し、3mlの注射器を使用しています。アレイの機能に適用された水槽のシリコーン室を配置することは避けてください。
2. ブロッキングとリンス：MEArraysは細胞毒性ができます未反応モノマーを除去するために、よくすすぎ洗いする必要があります。 PDMSコートスライドを使用した場合は、印刷された特徴の間における領域は、第1の細胞接着を防ぐために、非汚コーティングでブロックする必要があります。水中の1％プルロニックF108（BASF社）または2％BSA中でアレイをインキュベート真空下で15分間水。 PAゲルスライドはブロッキング工程を必要としません。すべての場合において、（メディアの選択は異なります5分間の細胞培養培地を使用して配列3回すすぎ使用される細胞に応じますが、抗生物質の使用）は関係なく、メディアやセルの推奨されます。 PAのゲルは、ゲルを再水和するためにメディアに、さらに30分間のインキュベーションを必要とします。
3. 細胞接着：4〜5アレイは滅菌シャーレシングル15cmの内部に収めることができます。配列は無菌維持する蓋付きペトリ皿をカバーしています。 10,000〜1,000,000細胞/ mlの最終濃度になるように培地中の細胞を加えることによってMEArrayへの最終的なメディアボリュームの半分を追加します。細胞は、印刷された微小環境の組成に応じて異なる速度で印刷された機能にアタッチされます。 15から20分間隔で反転ステージ顕微鏡を通して配列を表示することにより、均一な添付ファイルをチェックします。優しく前後にMEArraysを揺することによって、パターン化された方法で取り付ける細胞が浮遊、付着していない細胞と区別することができる。
4. バインドされていない細胞の除去：PA-コーティングさMEArraysで、未結合の細胞を吸引することができ、メディアが適切なボリュームに置き換えることができます。 P上DMS-コーティングさMEArrays細胞が完全に乾くとほぼすぐに死ぬため、メディアは完全にウェルから除去することはできません。 PDMSでコーティングされたMEArrays上の任意の未結合の細胞が取り除かれるまで顕微鏡検査によって決定されるようにこのようにして、結合していない細胞は、メディアの容量の半分の連続交換のプロセスによって除去されなければならない。血清含有培地が定義されているメディアに比べて使用されており、BSAをプルロニックF108に比べて印刷されていない領域をブロックするために使用されているとき。PDMSのデウェッティング効果はそれほど顕著である
5. 細胞は、通常のメディアの変化と何日も15cmのペトリ皿の内側に配置MEArrays上で培養することができます。 PDMSのスライド上のメディアの変更は、メディアボリュームの半分の連続変化して行う必要があります。
6. 例えばパラホルムアルデヒド、メタノール/アセトンなどの一般的な固定剤は、MEArrayシステムと互換性があります。 PA-コーティングさMEArraysで細胞を染色する場合には、固定剤を添加することができると、彼らは従来の染色方法であるのと同じように流され。しかし、PDMSコーティングされMEArraysで細胞を染色する際に、表面が濡れても、固定の間でなければなりません。メディアの半分を吸引除去し、固定液と交換してください。ウェルが固定の過半数で満たされるまでプロセスを数回繰り返します。固定後、固定液を徐々に分析の次のステップのために適切であるブロッキングバッファーと同じように置換されます。
7. 免疫染色では、一般的に細胞機能を解析するために使用されます。の染色ルーチンは異なりますが、PDMSのMEArrays上で作業するときに、1つのニーズはすべて洗浄し、上記のように吸引ステップを実行するように、徐々にソリューションを変更し、デ·ウェットな面を許容することはありません。ディウェッティングは、染色におけるアーチファクトの原因となります。
8. チャンバーは、カミソリの刃を用いて除去することができる。カバースリップをFluoromount™を-G（サザンBiotech）を用いて染色されたMEArraysの上に取り付けることができます。検出はほとんど多色蛍光マイクロアレイスキャナでまたはモーターと共焦点顕微鏡で行うことができますタイル張りの画像取得モード。

5。代表的な結果

プリントクイルピンマイクロアレイプリンティングロボットに四角い先端がシリコンピンを使用してMEArray PDMS-フリーランでパターン化されたタンパク質の沈着の例を図2に示します。印刷されている様々なタンパク質の沈着は免疫蛍光抗体を用いて（ 図2A）によって確認することができます。マスタープレート内のタンパク質溶液の希釈液は、印刷基層面（ 図2B）上に堆積される量（蛍光強度）を反映している。細胞が明らかなパターン化された方式です（ 図2C）のプリント機能に添付しなければなりません。

2微小環境タンパク質の逆希釈が人間多能性乳腺上皮p内のタンパク質濃度依存的に特異的ケラチン発現プロファイルを誘発していることを示すMEArray実験の例rogenitor細胞株（D920細胞）は、 図3に示します。バブルプロットは、特定の表現型が希釈系列の複製機能に関する細胞に課せられているかどうかを判断するのに役立ちます。微小環境における特定の分子が異なる表現型を引き起こす場合例えば、、一度有益な成分が表現型を変更または消えるはず中立ECMの背景に十分に希釈された。ケラチン8およびケラチン14中間径フィラメントタンパク質の免疫蛍光検出はアクソン4200a（Molecular Devices）をマイクロアレイスキャナーを用いて行った。十二複写希釈系列を各MEArrayに印刷され、ケラチン14〜ケラチン8のlog ₂比率は、蛍光強度は、信号のばらつきや再現性の現実的なアイデアを与えるためにバブルプロットとしてグラフ化されたことを意味した。細胞が付着した、結合していない細胞が流された（ 図3A）、およびcultuの24時間後にした後に修正されましたMEArrayからも示されているデータ再（ 図3B）。この比較的小さな分析のために、一方向ANOVAは両側t-検定を決定するために使用された各時点での平均信号から偏差値を算出するために使用され、グループ化されたかどうかのタイプの異なる希釈I型コラーゲンおよび組換えヒトP-カドヘリンは、ケラチン発現の変化を引き起こした。ただ装着後機能に関する細胞間の平均値からの変動はありませんでしたが、異なる微小環境への曝露の24時間後の細胞の間でケラチン発現の有意な差が認められた。 t検定では、高P-カドヘリンの濃度が24時間後に強いケラチン14の信号を誘発に対し、高いI型コラーゲンの濃度は、高いケラチン8の発現を誘発したことを確認しました。この結果は、P-カドヘリン含有微小環境は双方向強力な乳腺前駆細胞が^4日にK14を発現する上皮表現型を課すという以前の報告と一致した。

全体scanneの例4万PaのPAゲル上にプリントD MEArrayを図4に示します。

図1 MEArray手順のフローチャート。まず、印刷基層は、PDMSやPAのいずれかで製造される。第二に、マスタープレートは、データベース内に準備されたと注釈が付けられます。第三に、MEArraysがプリントされ、シリアル番号でエンコードされます。第四に、培養チャンバーが装着されており、表面はブロックおよび/またはすすぎ、その後セルが接続を許可されて、結合していない細胞が洗い流されています。第五に、細胞は実験的な設計に基づいて潜伏期間の後に染色またはバイオアッセイを用いて治療することができる。最後に、MEArrayの画像が得られ、適切なスキャナとソフトウェアを用いて解析することができます。

図2。Depositionとプリントタンパク質の相対量は、従来の細胞接着への免疫染色で確認することができます。 A）は、IV型コラーゲンおよびラミニン-111を認識する抗体はMEArrayの印刷機能で自分の存在を確認するために使用されていました。 B）は200μg/ mlのタンパク質溶液から出発して、NIH ImageJのソフトウェア、希釈系列全体に2つのタンパク質の相対存在量の平均ピクセル強度解析機能を使用すると、定性的に評価することができる。印刷されたPDMSでコーティングされたMEArray正方形の機能に接続されているD920細胞のC）位相顕微鏡写真。

図3：時間と微小環境の機能として多能前駆細胞ラインでケラチン発現の変化を用いてMEArray分析の一例。各バブルは、FEAに添付10月15日細胞からケラチン8およびケラチン14タンパク質レベルの比を表すMEArrayでトゥーレ。発現は免疫蛍光プローブを用いて測定した。 A）はちょうど取付け後細胞におけるケラチン比率を示し、AとB）を並列に播種したアレイ上の24時間後にケラチン比を示している。両方のタンパク質の最大濃度は200μg/ mlの2倍に希釈した。バブルの直径はケラチン8とケラチン14平均強度のlog ₂比の大きさを表し、オレンジと白のカラーコーディングは、それぞれの値> 0、<0を示します。一方向ANOVAおよびt検定のP値、および比較集団を同定する矢印付きブラケット、のF値が示されている。

図4 MEArrayスキャンの例は、共焦点レーザ走査型顕微鏡でタイル張りの取得モードを使用して取得しました。 HCC1569細胞は、私たちは前に固定に4時間のためのDNAアナログEDUを組み込むことができました。DAPI（青）とEDU（赤）が示されている。

ディスカッション

ここに提示されMEArrayの方法は、細胞と組み合わせ微小環境との相互作用⁴の機能解析を可能にします。 MEArray分析は、基本的な微細化技術、細胞生物学、および多くのマルチ施設で利用可能なマイクロアレイプリンティングロボットや分析装置の使用を兼ね備えています。無血清培地製剤は添付ファイルを向上させることができますBSAまたは<1％の血清を含むようにいくつかのケー?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
ガラスは、25ミリメートル×75ミリメートルをスライド	VWR	48311-600
ガラスカバースリップ（その1）24ミリメートル×50ミリメートル	VWR	48393-241
染色皿（またはCOPLAN瓶）	VWR	25461-003
ペトリ皿（15センチ）	BDファルコン	351058
のNaOH（1.0N）	シグマアルドリッチ	S2567
APES（> 98％（3 - アミノプロピル）トリエトキシシラン）	シグマアルドリッチ	A3648
グルタルアルデヒド	シグマアルドリッチ	G7651	水中の50％
APS（> 98％過硫酸アンモニウム）	Sigmaアルドリッチ	A3678	ddH 2 Oで10パーセントの作業溶液を調製
TEMED（N、N、N '、N'-テトラメチルエチレンジアミン）	シグマアルドリッチ	T9281
アクリルアミド（40％）	シグマアルドリッチ	A4058
ビスアクリルアミド（2％w / v）の	フィッシャーBioReagents	BP1404-250
0.45μmのシリンジフィルター4mmのナイロン	ナルゲン	176-0045
FITC	シグマアルドリッチ	F4274
PDMS（ポリジメチルシロキサン）	ダウコーニング	3097358-1004	エルズワース接着剤を介して、シルガード184エラストマーキット
2チャンバースライド	NUNC	177380
プルロニックF108	BASF	30089186
AQUariumシーラント	ダウコーニング	DAP 00688
Fluormount-G	サザンバイオテクノロジー	0100から01
使い捨てのプラスチック製コップ
舌圧子
ニトリル手袋
プラスチック製の顕微鏡スライドボックス
スピンコーター	WS-400B-6NPP/LITE	Laurellテクノロジーズ株式会社
オーブン
デジタルホットプレート
384ウェルプレート			マイクロアレイロボットに適したブランド
マイクロアレイプリンティングロボット
逆位相と蛍光顕微鏡
軸索マイクロアレイスキャナー	分子デバイス		複数のコンフィギュレーションが存在し