マイクロアレイを用いた植物細胞壁ポリマーの糖鎖プロファイリング

要約

と呼ばれる手法 C omprehensive M icroarray P olymerプロファイリング（CoMPP）について説明する。この方法は、生物学的な文脈の広い範囲で発生したグリカンのスクリーニングを可能にする小型のマイクロアレイ分析プラットフォームで定義された糖鎖エピトープに対するモノクローナル抗体の特異性を兼ね備えています。

要約

植物の細胞壁は、植物の生理と発展に重要な役割を果たしており、人間社会のために原材料を提供異種糖鎖の複雑なマトリックス（ 例えば、木材、紙、繊維、バイオ燃料産業^）1,2です。しかし、これらの成分の生合成と機能を理解することは困難なままである。

細胞壁糖鎖は、化学とその構築ブロック、グリコシル残基の複雑さに起因するコンフォメーションが多様である。これらのフォームの複数の位置に結合およびリング構造が異なり、異性体またはアノマー配置されているだけでなく、無糖残基の配列で置換されている。グリカンの組成物は、単一細胞壁³の異なる細胞および/ ​​または組織型あるいはサブドメインに変化する。さらに、それらの組成物はまた、開発¹時、または環境手がかり⁴に対応して変更されます。

EXで2000遺伝子の目的税は、植物の細胞壁は、異種の糖鎖の複雑なマトリックスシロイヌナズナ ⁵で細胞壁糖鎖の生合成と修飾に関与することが予測された多数持っています。しかし、生合成遺伝子の比較的少ないが、機能的に^4,5特徴付けられてきた。遺伝子はしばしば差別的細胞型^6の間に、多くの場合、低レベルで発現しているので、逆遺伝学的ア ​​プローチが困難である。また、変異体の研究は、多くの場合、適切な細胞壁機能は^7に維持されていることを確認するために、遺伝子の冗長性または代償機構によって妨げられている。したがって、新たなアプローチが急速に糖鎖構造の多様な範囲を特徴づけるために理解と細胞壁の生合成と修飾に機能ゲノミクスアプローチを容易にするために必要とされる。

モノクローナル抗体^{（mAb）8,9は、}植物の糖鎖構造と分布を決定するための重要なツールとして浮上している。これらは、dist認識ペクチン、キシログルカン、キシラン、マンナン、グルカンやアラビノガラクタンを含む植物細胞壁糖鎖の主要なクラス内に存在INCTエピトープ。最近、それらの使用は植物や組織の種類を同時に^9,10,11の広い範囲で糖鎖の相対量を決定するために、大規模なスクリーニング実験にも拡張されました。

ここでは、複数のサンプル（100秒）が減少した試薬及びサンプル量で小型化されたマイクロアレイプラットフォームを用いてスクリーニングすることができる包括的なマイクロアレイポリマープロファイリング（CoMPP）（ 図1および^2）10,11と呼ばれるマイクロアレイベースグリカンスクリーニング法を提案する。マイクロアレイ上のスポット信号は正式に糖鎖エピトープの発生に関する半定量的データを与えるために定量することができる。このアプローチは、複雑な生物システム¹²の糖鎖変化を追跡し、細胞壁組成のグローバルな概観を提供することに適している場合は特に事前知識Ofはこれができません。

プロトコル

1。組織収集＆準備

1. 関心のある各組織には、少なくとも三重に植物組織100 mgの生体重（10 mgの乾燥重量の最小値）を収集します。次の手順では、植物組織からの細胞壁物質の調製を記載している。貯蔵組織の場合には、非指名澱粉を酵素的に前述の¹³のような細胞壁ポリマーの抽出を続行する前に削除されます。
2. 24チューブアダプタセットと3 mmのタングステンカーバイドビー​​ズ（30ヘルツ、2×30秒）で、キアゲンTissueLyserをIIを用いて液体窒素で微粉末にサンプルをホモジナイズする。唯一のいくつかのサンプルが処理されている場合、あるいは、乳鉢と乳棒を使用しています。
3. 10ミリリットルプラスチックのコニカルチューブにホモジネートを転送します。
4. 室温で10ミリリットル80パーセントv / vエタノールでホモジネートを洗浄し、2分間激しくボルテックスすることによって細胞壁材料を準備します。
5. 3500 xgでサンプルを遠心分離し、上清を捨てる。上澄みが透明になるまで70％エタノールが特にクロロフィルを含む組織のために、または少なくとも3回洗いを繰り返します。
6. 100％アセトンで最終洗浄を行い、一晩空気乾燥する際には、アルコール性残留物（AIR）を含有するペレットを残す。
7. ふるい0.4ミリメートル²メッシュを使用したAIRサンプルは罰金、均質な粉末を達成し、いつかホモジネートに残るほど、貧弱グラウンド粒子を除去する。
8. マイクロチューブ、サンプルの混合を助けるために3ミリメートルのガラスビーズを含んだそれぞれに10mgのAIRサンプルを計量する。

2。細胞壁糖鎖の抽出

1. ペクチン、およびペクチンに関連付けられたポリマーは、各試料に50μMのCDTA液（pH7.5）500μlを加えてサンプルから抽出されます。
2. 簡潔にボルテックスチューブは溶媒が試料物質と接触していることを確認してから、8 Hzで3時間TissueLyserを用いて混合します。
3. 慎重に、12,000 xgでサンプルを遠心R4℃で上清と店を残したまま削除
4. 13000×gで残っている溶剤、ボルテックス、遠心を薄めて除去するために脱イオン水1ml中のペレットを洗浄します。ペレットを乱さずに、この手順を繰り返して、次のステップに進む前に、チューブから液体をすべて削除します。
5. CDTA抽出のために2.4 - 架橋結合型糖鎖を順次ステップ2.1で説明したのと同じ手順を使用して、0.1％（w / v）の水素化ホウ素ナトリウムと4M NaOHを500μlの残りの細胞壁ペレットから抽出されます。 NaBH _4をそれによって多糖類の剥離を防止するベースアルコールに多糖類の還元末端にアルデヒド基（またはケト基）を低減するために追加されます。
6. 遠心分離後、上清を再び除去され、4℃で保存し、ペレットは、次の抽出に進む前に、脱イオン水で2回洗浄した。
7. オプションの手順として、セルロースなどの残留性ポリマーは、500μlのcadoxen（31％v / vの1,2 - diamiで抽出する2.4 - 手順2.1で説明したのと同じ手順を使用して、0.78 MのCDOとnoethane）。代わりに、残りのペレットで絶対セルロース含有量は、酢酸/硝酸アッセイ（説明を参照してください）​​を使用して決定することができます。

3。印刷マイクロアレイ

1. 任意の粒子状物質を除去するためにxgの13000で抽出された細胞壁ポリマーを含有する上清を遠心分離します。
2. ウェルポリプロピレン384サンプルは、組織の種類と抽出の種類に応じて配置され、あらかじめデザインされたカスタムレイアウトを使用したマイクロタイタープレートに各サンプル50μlをロードします。
3. 脱イオン水で0,5、および25×シリアル希釈系列の細胞壁ポリマー試料を希釈します。
4. そのようなピンの高さなどのパラメータは、収集および滞留時間、および洗浄工程は、マイクロアレイを制御するソフトウェアで設定されます。
5. 印刷室の湿度は、サンプルの蒸発を防ぐために60％に制御されます。
6. 印刷ジョブがLabNEXTソフト制を使用して開始されreとマイクロアレイのレイアウトに対応したプログラム。
7. ロボットは機械で平板に取り付けられた20×20cmのニトロセルロース膜上にサンプルプレートから溶液をプリントする毛管チャネルピンを使用しています。アレイ上の各スポットは、溶液15 NLが含まれており、三重に印刷されています。
8. 印刷ジョブが完了した後、同一のマイクロアレイは、個々の配列への膜とカットで隣同士に印刷されます。
9. 各実験において、配列は多かれ少なかれサンプル、希釈または複製に対応するために修正することができます。

4。糖鎖マイクロアレイのプロービング

1. 印刷後、非特異的結合を低減するために2時間、室温で生理食塩水（MPBS）をリン酸緩衝に溶解し5％w / vの脱脂粉乳で個々のマイクロアレイをブロック。
2. MPBSで2時間の細胞壁糖鎖エピトープに特異的なモノクローナル抗体を用いたプローブのマイクロアレイ。モノクローナルantibの過半数細胞壁糖鎖に対するodiesは、次の3つの会社から市販されており、Biosupplies（ www.biosupplies.com.au ）、Carbosourceサービス（ www.carbosource.net ）とPlantProbes（ www.plantprobes.net ）。
3. ネガティブコントロール、のみMPBS無一次抗体と共にインキュベートマイクロアレイを含む。
4. マイクロアレイのリン酸塩で3回洗浄すると、非特異的な結合を除去するために5分間緩衝生理食塩水（PBS）。
5. 2時間MPBSにおける西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）に結合させた二次抗体を用いてマイクロアレイを探る。細胞壁糖鎖に対する最もモノクローナル抗体は抗マウスまたは抗ラット二次抗体を必要とします。
6. 非特異的結合を除去するために5分間3回PBS緩衝液での洗浄手順を繰り返します。
7. 発色（3,3 - ジアミノベンジジン）またはchemilを使用してマイクロアレイを開発uminecent（ルミノール）基板。

5。定量化

1. 現像後、高解像度（1,200 dpiの）デスクトップスキャナを使用して、個々のマイクロアレイをスキャンして、負の、16ビットのTIFFファイル（ 図3）のように画像を保存します。
2. 自動グリッドツールを搭載画像処理ソフトウェア（LabNEXT）Xplore使用して、各スポットの積分強度を計算します。インテグラルスポット強度は、各スポットを囲むグリッド領域内のピクセルの合計から導出されます。
3. 各マイクロアレイのグリッドデータをtxtファイルとしてエクスポートされ、手動で解析するためのExcelスプレッドシートにインポートすることができます。オンラインツール（ http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/は ）自動的に翻訳して、個々のtxtファイルからのデータを処理するために開発されました。
4. インテグラルスポット強度は '平均スポットを得るために、印刷複製し、希釈液で平均化されている各サンプルの強度"の値（ 図2）。代わりに、アレイ上のちょうど1希釈値に対応するスポット信号は、各サンプルの相対的な糖鎖エピトープの存在量を定量化するために使用されています。
5. 異なるサンプル間の相対的な平均スポット強度は、Excelまたはオンラインヒートマッパーツール（で条件付き書式を使用してヒートマップ（ 図4）として提示されているhttp://bar.utoronto.ca/welcome.htm ）。各抗体の種類のデータを100に修正され、5％のカットオフ値は、バックグラウンド信号と誤検出を​​除去するために課せられています。

結果

ニコチアナダイジョの花から6種類の組織における糖鎖の相対的な存在量（葯フィラメント、花粉、卵巣、花弁、萼片と偏見）がCoMPPを用いて決定した。図3Aは、部分的に（低）メチルエステル化homogalacturonan（HG）、ペクチン多糖類^14日に発生したエピトープに対して特異的mAb JIM5でプロービングされた代表的なマイクロアレイを示しています。 JIM5エピトープは、しかし、柱頭?...

ディスカッション

CoMPPは、数日のうちに何百もの植物由来のサンプルの糖組成をプロファイリングするための迅速かつ高感度な方法である。この方法は、レクチン、受容体、抗体¹⁶と糖結合タンパク質と糖の相互作用のハイスループットスクリーニングのためにすでに利用可能な細菌または哺乳動物糖鎖アレイ·プラットフォームを補完します。細胞壁糖鎖を検出するための利用可能なプローブの大き?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
3 mmのタングステンカーバイドビー​​ズ	キアゲン	69997
コレクション·マイクロチューブ（1.2ミリメートル）	キアゲン	19560	1.5 mlのマイクロチューブを使用することもできます
キアゲンTissueLyserを世	キアゲン	85300
3ミリのガラスビーズ	シグマアルドリッチ	Z143928
CDTA	シグマアルドリッチ	34588
酸化カドミウム	シグマアルドリッチ	202894
1,2 - ジアミノエタン	シグマアルドリッチ	03550
ニトロセルロース膜（孔径0.22μmのサイズ）	GEウォーター＆プロセス·テクノロジー	EP2HY00010	異なる大きさの細孔膜は異なるピンタイプに適しています
XACT IIマイクロアレイロボット	Labnext	001A	トランザクション配信IIのロボットは、ニトロセルロース膜が添付されているカスタム20×20センチメートルセラミックプレートが取り付けられていた
RMのマイクロアレイ上のアイコンをXTEND	Labnext	0037-350	ピンは、膜上スポッティングに適していなければならない
384ウェルマイクロタイタープレート（ポリプロピレン）	グライナー	781207
抗糖鎖モノクローナル抗体	植物プローブ/ CarboSource / Biosupplies		ウェブサイト; PlantProbes（ www.plantprobes.net ）、Carbosource（ww.carbosource.net "ターゲット=" _blank "> www.carbosource.net）とBiosupplies（ www.biosupplies.com.au ）。
抗ラットIgG（全分子） - ヤギで産ペルオキシダーゼ抗体。	シグマ	A9037	二次抗体の種類（ 例えば 、ラット、マウス、ヤギなどで提起された）を使用し、一次抗体に依存します。
SIGMA FAST 3,3 ' -ジアミノベンジジン錠	シグマ	D4293	試薬の開発のタイプは、使用される二次抗体および検出方法（colourmetric、またはchemiluminecent）に依存します。
SuperSignalウェスト·ピコ化学発光基質	Thermoscientific	34080	上記を参照
画像処理ソフトXplore	LabNext	008	自動グリッド化ツールを使用して、多くのソフトウェアの種類がありますマイクロアレイのスポットの画素値を測定します。
植物性多糖類	シグマ/ Megazyme