血漿タンパク保存用採血キットからゲノムDNAを抽出するために実用的で新手法

要約

私たちは、血漿/血清学的検査のために採取した全血からゲノムDNAを単離する新たな方法を説明しています。血漿採取した後、圧縮された血液は、通常廃棄されます。当社の新規の方法は、既存の方法に比べて大幅な改善を表し、追加の血液を要求せず、単一のコレクションからのDNAやプラズマを利用できるようになります。

要約

臨床検査は、血液の細胞または流体部分に行うことができる。別の採血管を使用することにより分析することができる血液（全血、血漿または血清）の一部を決定する。人間の疾患の遺伝的基礎を研究に携わる研究所は、ゲノム/遺伝子解析のためのDNAの供給源としてEDTA含有バキュテナーに収集凝固処理全血に依存しています。ほとんどの臨床検査室は、表現型のアウトカム調査の最初のステップとして、生化学的、血清学的およびウイルスのテストを実行するため、抗凝固処理血液もヘパリン含有チューブ（プラズマチューブ）に集められる。したがってDNAプラズマがゲノムおよびプロテオミクスデータの両方の同時並列分析のために必要とされる場合には、EDTAおよびヘパリンチューブの両方に血液を採取するのが通例である。血液は単一の管に収集し、血漿とDNAの両方の原因となることができれば、その方法は、既存のメタへ前進であると考えられるODS。プラズマ抽出後の圧縮された血液の使用は、このように処理された血液試料の量を最小化し、各患者から必要なサンプル数を減らすこと、ゲノムDNAの代替供給源を表す。これは、最終的に時間とリソースを節約できるでしょう。

血漿タンパク質保存用BD P100血液採取システムは、ヒト血液から良好なタンパク質バイオマーカーの発見およびプロテオミクス実験を可能にし、血液のタンパク質含有量を安定させるために、前の血漿または血清採血管¹よりも改善された方法として作成された。 BD P100管は、15.8、噴霧乾燥K2EDTA mlの凝固を防止し、血漿タンパク質を安定化するプロテアーゼ阻害剤の凍結乾燥された独自の広域スペクトルカクテルを含有する。また、遠心分離後、血漿および細胞ペレット間の物理的障壁を提供する機械的なセパレータを含む。いくつかの方法は、凝固した血液のsaからDNAを抽出するために考案されているmples古いプラズマチューブ^2-4に収集。これらのメソッドからの課題は、主にチューブ（ゲル·セパレータ）の内部セパレータの種類に関連付けられており、凝固した血液の回収が困難である、断片化や血栓を分散させるの不便さ、および分離ゲルによって血栓抽出の閉塞を含まれていた。

私たちは、新しいBD P100チューブに採取した血液からゲノムDNAを抽出し、浄化する最初の方法を提示する。私たちは、P100のチューブからEDTA管からそれにDNAサンプルの品質を比較。我々のアプローチは、シンプルかつ効率的である。 2）機械的なセパレータの除去は、スクロースとの組み合わせを使用して、採血のための機械的なセパレータをプラズマBD P100（BD診断、スパークス、MD、USA）管の1）を使用する：これは、次の4つの主な手順が含まれ無菌クリップ金属フック、3）及び4白血球を含むバフィーコート層の剥離）からのゲノムDNAの単離軟膜は、通常の商業的なDNA抽出キット又は類似の標準プロトコルを使用する。

プロトコル

1。試料捕集

1. 適切なインフォームドコンセントを持つ個人からの血液サンプルを収集します。個々については、P100チューブ（BD診断、フランクリン湖、NY、USA）への血液4〜を5ml描く。比較のために、同時にEDTAチューブに血液を採取。
2. BD P100管は15.8ミリリットル、噴霧乾燥K2EDTAおよび凝固を防止し、血漿タンパク質を安定化するプロテアーゼ阻害剤の凍結乾燥された独自の広域スペクトルカクテルを含有する。彼らはまた、機械的な区切り文字を含んでいます。処理が発生するまで、全血を採取した後、一晩、60分間室温で両方のチューブを保持する。
3. 室温で15分間、2500グラムでBD P100チューブを遠心する。マイクロ遠心チューブにメカニカルセパレーターの上に採取した血漿を転送します。
4. -80℃で、セパレーターの下に圧縮血を含む、P100チューブを保管°Cあなたは、DNA内線を開始する準備が整うまでraction。

P100管の血（P100_DNA）から2.1

1. P100チューブを-80℃で保存するプラズマ抽出後のC。 3から4ヶ月以内に、5分（ 図1A）のための水浴中で37℃でフリーザーや解凍から圧縮された血液を含むP100チューブを取り出す。セパレーターの上に座って任意の残留プラズマを削除します。セパレーター上記P100チューブ（ 図1B）で- 17％ショ糖溶液（未発表データ社内でテスト勾配溶液）2 mlを加え。 2500グラムで20分間室温で遠心する、このプロセスは、チューブの頂部に機械的なセパレータをプッシュし、軟膜（ 図1C）を含む溶液の三層が得られる。手動steriledフック金属クリップ（ 図1D）を使用して区切り文字を抽出します。
2. 各チューブ（ 図1D）から機械的な区切り文字を取得した後、削除してdiscarDトップ蔗糖層。無菌の15ミリリットルコニカルチューブに、バフィーコート（BC）層を表す中間層を、転送します。 3ミリリットルの軟膜の量を増加させるためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を追加します。メーカーの推奨に従ってキアゲンプロトコールとトラブル血キットの試薬を用いてバフィーコートからDNAを抽出し、2500グラムの遠心速度（代わりに2000グラムの）を除いて。
3. 赤血球（RBC）を溶解して除去するために、バフィーコートの3 mlにRBC溶解9mlのを追加します。インキュベーション中時折反転と10分間、各チューブを室温で数回とインキュベートを反転。 5分間2500グラムで、それぞれの混合をスピンダウンし、上清を捨てる。 15秒のために細胞溶解液と渦の3mlで各チューブの残りのペレットを扱う。 15秒のためのタンパク質の沈殿溶液と渦の1mlで溶解液を扱う。
4. 5分間2500グラムで遠心し、含有する新鮮な15ミリリットルコニカルチューブに上清を移す100％イソプロパノールを3ml。 3分間2500グラムで新しいチューブを10回と遠心分離機を反転。上清を捨て、70％エタノール1 mlを加える。 DNAペレットを取り除くと洗浄するコニカルチューブを数回反転させる。 1分間2500グラムで遠心。ペレットを室温で3分間（逆さまにチューブを配置）するために乾燥させた後、37℃で補水液250mlでDNAを中断℃で10分間、プレラベル1.7ミリリットルマイクロチューブへの転送のためのC。 -80℃でチューブを保管°Cを使用するまで。

EDTA Ttubeの血（EDTA_DNA）から2.2

1. ルーチン免疫血液学試験のための全血をK ₂ EDTAの10.8ミリグラムでスプレーコーティングし、-80℃で保存プラスチックvaccutainerチューブに集められ管は機械的な区切りが含まれていないため、DNA抽出は、機械的なセパレーター（2.1.1および2.1.2）を含む手順は含まれていません。
2. 血液貯蔵、DNの3から4ヶ月以内カワセミフレックス（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、MA、USA）を使用して抽出される。これは、磁性粒子技術に基づく自動化DNA抽出システムであり、細胞溶解/ DNA結合、数回の洗浄工程およびDNAの溶出で構成されている。
3. DNA抽出に使用されるキットはカワセミフレックス24 DNA血液キット（Qiagen、ドイツ）である。

3。 DNA量と品質評価

ゲノムDNAの量、品質および完全性をピコグリーン、分光法及び電気泳動を含む方法の組み合わせにより評価した。

1. ゲノムDNAの濃度は、ナノドロップし、ピコグリーン定量化によって決定される。
2. 純度は、光度計、分光光度計での吸光度比260/280の測定値から決定される。
3. 試料（500ngの）も、DNAの完全性（分解）を評価するために、1％アガロースゲル上にロードされている。

4。 Genotypinグラムアッセイおよび品質管理

1. 五P100_DNAとそれに対応するEDTA_DNAサンプルをランダムにカスタムImmunochip（DNA免疫分析ビーズチップ）を使用して、さらなる分析のために選択される。 Immunochipは196524多型を含むのInfiniumジェノタイピングチップで、免疫遺伝学的研究の⁵のために設計されています。
2. 各サンプルについて、200ngのDNAが増幅され、断片化され、沈殿させ、適切なハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁した。
3. 変性した試料は、16時間の最低48℃でImmunochipsにハイブリダイズさせる。
4. ハイブリダイゼーション後、Immunochipsは、一塩基伸長反応で染色のために処理される。
5. immunochipsその後イルミナHiscanビーズアレイリーダーと正規ビーズ強度データはイルミナGenomeStudioソフトウェアにロードされ、遺伝子型に変換され、使用して結像される。遺伝子型はGenomeStudioのautocallingアルゴリズムを使用して呼び出されます。における品質管理コー​​ルレート<95％と一塩基多型の除外（のSNP）をvolves。
6. SNPコールレートはimmunochipアッセイ効率の尺度として使用される。これは、自動化された遺伝子型の割り当てを受信するのに十分な信号強度及び品質を実現チップ（各チップにエンコードされた196524個のSNP）に関するアッセイの総数の百分率として算出される。高品質のDNAは、（260/280の比が1.8以上、劣化の有無）immunochipアッセイに含まれるハップマップコントロールDNAと少なくとも同じコール·レートを達成するために期待されている。品質管理コールレート<95％の各データセット内でのSNPの排除を伴う。

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結果

DNAの品質評価と濃度測定

P100_DNAsの収率はEDTA_DNAsのもの（ 表1、表2）よりも有意に低かった。その吸光度比260/280の値で表されるDNAの純度はP100_DNAとEDTA_DNAサンプルセット（ 表1および2）の両方に類似している。光スミア（ 図2）によって示されるように、いくつかの劣化が、EDTA_DNA試料中に見られるが、DNAの品質は、サンプ?...

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ディスカッション

多くの人間の病気は、遺伝的な原因があり、人間の病気の遺伝的基礎を探求することは増加高品質のDNAが求められます。遺伝学的研究に使用されるDNAの最も一般的な原因は、全血を抗凝固される。ほとんどの臨床検査室では、生化学的な血清学、および表現型アウトカム調査の最初のステップのようなウイルスのテストを実行するので、血液がしばしばプラズマチューブに集められる。血漿?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD P100 tubes	BD Diagnostics	366448
EDTA tubes	BD Diagnostics	367863
Sucrose	Sigma	S9378
Paper clip	Office product
15 ml tube	Corning	430052
Red blood cells (RBC)	Qiagen	158389 (kit)
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Thermo Scientific	SH30256.01
BioSprint 96 DNA Blood Kit (48)	Qiagen	940054
1.7 ml microtubes	Axygen	MCT-175-C
Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit	Illumina	WG-352-1001
Bead array reader	Illumina	NA
GenomeStudio Software	Illumina	N/A