蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化

要約

間の共生を研究するために、 Xenorhabdus細菌や Steine​​rnema線虫、これらの方法は、線虫内細菌の存在と位置を監視するために開発されました。他のシステムに適用することができる実験的なアプローチは、エンジニアリング細菌が透明な線虫の中に蛍光顕微鏡細菌を用いて、緑色蛍光タンパク質と可視化を表現するために必然的に伴う。

要約

共生、二つ以上の生物の一緒に生活は、人生のすべての王国全体に蔓延している。地球上で最も普遍的な生物の2のように、線虫や細菌は、その範囲の有益な1 ^から 3までに病原性共生協会の広い配列を形成する。そのような関連付けはXenorhabdus細菌と共生⁴のモデルシステムとして浮上している線虫Steinernema間の相互に有益な関係である。Steinernema線虫、昆虫^5を殺すために彼らの共生細菌を用いて、昆虫である。昆虫のホスト間で伝送するために、細菌が線虫の感染幼若期^6-8の腸にコロニーを形成する。最近、いくつかの他の線虫種は昆虫の^9-13を殺すためにバクテリアを利用することが示されている、との調査は、これらのシステムにおける線虫や細菌間の相互作用を検討し始めている<> 9（商標）。

私たちは、顕微鏡で観察したときに線虫の光透過性を生かし、線虫ホスト内または上に共生細菌を視覚化するための方法を説明します。細菌は蛍光顕微鏡によりその可視化を可能にする、蛍光タンパク質を発現するように遺伝子操作されています。多くのプラスミドは、異なる波長（ すなわち、緑色または赤色）、および受信者共生細菌へのドナー大腸菌株からのプラスミドの接合で蛍光を発するタンパク質をコードする遺伝子は、細菌の広い範囲のために成功して運ぶことが可能です。記載された方法は、Steinernema carpocapsaeとXenorhabdus nematophila ¹⁴との間の関連性を調べるために開発されました。同様のメソッドは他の線虫細菌団体^9、15-18とアプローチを調査するために使用されているため、一般的に適用されます。

会ったHODは、協会と植民地化^14、16、19のプロセスの本質への洞察を提供し、開発のさまざまな段階で線虫内細菌の存在および局在化の特性評価を可能にします。顕微鏡分析は、組織^{14、16、19から21を}ホストするために細菌の人口とローカライゼーション内で両方の植民地化の頻度を明らかにする。これは、植民地化の平均的なレベルを提供することができる超音波処理²²または^23を研削などの線虫個体群内の監視、細菌の他の方法よりも優れていますが、例えば、との集団から低いシンビオント負荷頻度の高い集団を差別しないことがあります高シンビオント負荷の低周波。植民地化の表現型²¹のための細菌変異株をスクリーニングまたは特性評価する場合、周波数と植民地化細菌の負荷を判別することは、特に重要になることがあります^、24。確かに、蛍光顕微鏡を植民地化^17、18の欠陥のための細菌の変異体のハイスループットスクリーニングに使用され、超音波処理^{22、25から27}と個々の線虫郭^28、29を含む他の方法よりも少ない労力であるされています。

プロトコル

1。抱合を経由して蛍光細菌株の構築

1. 受容菌（共生者が検査する）やドナー株一夜を栽培しています。ドナー株、通常、 大腸菌（Escherichia coli）は 、共役を介してDNAの寄付や蛍光タンパク質をコードする遺伝子を運ぶこと（ 表2）プラスミドで形質転換されるべきであることが可能であるべきである。プラスミドに応じて、共役ヘルパー歪みが必要な場合もあります。そうだとすれば、この株は、また一晩増殖させなければならない。ドナー株とヘルパー菌株はプラスミドの維持を選択するために抗生物質を成長させる必要があります。
2. 媒体への文化の1:100の比率で抗生物質を欠いている栄養豊富な成長培地中にドナーやヘルパー、そしてレシピエント株を継代培養。
3. 彼らは半ばログステージ成長（OD _600〜0.6）に達するまで各菌株に適した温度で文化を育てています。 XenorhabdusとEのこの段階成長するの大腸菌thは、継代培養した後に約3〜4時間に達しています。これは歪みで、またはいくつかのケースで使用され、プラスミドによって異なる場合があります。
4. 微量遠心チューブおよび17900 XG（最もmicrofugesで13,000 rpm）で2分間遠心分離した株を混ぜる。最良の結果を得ることができ、ドナーとレシピエントの割合が異なる組み合わせに変化し、経験的に決定することが必要になることがあります。 Xenorhabdus受取人とEの大腸菌ドナーは、我々は、3:1または1:1の比率を使用しています。ヘルパー株（ 例えば大腸菌 ）が必要とされている場合は、ドナーと同じ比率で追加する必要があります。
5. 上清をデカントします。
6. 新鮮な培地30μlの細胞ペレットを再懸濁する。
7. どんな抗生物質を含まない栄養豊富な培地プレート上に懸濁液をスポットし、スポットが乾燥することができます。
8. ドナーのための受容菌と許容（およびヘルパー、適用可能な場合）に最適な温度で一晩反転板を、インキュベートする。プレートがすべき少なくとも18時間インキュベートする。
9. 選択抗生物質プレート上で単一のコロニーのためのスポットとストリークをかき集める。抗生物質は、ドナーに対して、プラスミドを含む受信者のために選択する必要があります。 1つまたは2つの追加の分離筋が純粋培養を分離する必要があるかもしれません。
10. 得られたコロニーは、コロニー形態、または受取人固有の遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応の検出など、受取人固有の表現型の存在をスクリーニングすることにより、受信者の共生者ではなく、ドナー株、であることを確認します。既知のプラスミド配列と蛍光のポリメラーゼ連鎖反応によりプラスミドの存在のためにコロニーをスクリーニング。コロニーは蛍光タンパク質に対応する正しい波長の下で蛍光を発する必要があります。

2。無菌線虫卵の生産

1. 一晩自然な共生細菌の5ミリリットルを栽培しています。培養を開始するために、細菌は溶原性ブロス（LB）、または他のCUに接種することができるそのまま冷凍保存しておいたストックからまたは条痕板からltureメディア。
2. 10ミリメートル脂質寒天（LA）のプレート上に細菌培養600μlの^29を広げた。八から十プレートはほとんどの種のために十分な線虫が得られます。
3. 2日間25℃で湿気なしで暗闇の中でインキュベートする。
4. 細菌の芝生にメディア500μlに、使用されている線虫に応じて5000感染幼若虫、または他のステージを追加します。 3日間25℃でプレートをインキュベートする。
5. 成人線虫や卵の有無をごプレートを確認してください。顕微鏡スライド上に水20μlを置きます。細菌の芝生からスクレープアップ少量線虫の滅菌スティックを使用。水の中に棒を置き、線虫がオフに泳ぐことができます。低倍率でスライドショーを見てください。外観の詳細については、議論と図2を参照してください。
6. 卵とメスが表示されている場合は、続行し、それ以外の場合は、25＆dでプレートをインキュベート例えば、Cと適切な開発のためのチェック6月12日すべての時間。メスは卵が含まれている場合は、プレートの表面に水を数ミリリットルを置く。静かに回してプレートを、50 mlコニカルチューブに水を注ぐ。線虫はプレートから外れており、もはや、板面上には表示されません。いくつかのリンスが必要になることがあります。
7. 線虫はチューブの底に沈ませます。
8. 線虫を洗い流す。管の上部から余分な水分を切っピペット。きれいな水を補充し、大人の線虫が落ち着くことができます。過剰の水をピペットで。
9. 卵液でコニカルチューブを埋める。卵液を追加したら卵液とすべてのステップのタイミングはまったく同じ最大卵収率についての説明に従って処理しなければなりません。やさしく正確に10分間振とうしながらチューブをインキュベートする。ほとんどの線虫は、インキュベーションの終わりまでに解散すべき。
10. すぐに（これは高速化するために遠心分離機を育てる含む正確に10分間1250×gでコニカルチューブを遠心はなく、ダウン0×gである。 ）ブレーキを使用しています。
11. 直ちに上清をデカントします。
12. すぐにピペッティングにより卵液でペレットを再懸濁する。
13. すぐに卵液で円錐管を埋めると反転3-5回でよく混和する。その後すぐに2.10のようにスピン。
14. 直ちに上清をデカントします。
15. ピペッティングによりLBでペレットを再懸濁、洗浄工程の間に改善されたペレットに15 mlコニカルチューブに移す。 LBはSteinernema属のための標準規格です。他のバッファは（最小塩培地など ）バッファが線虫や細菌のどちらかに害を与えてはいけないを念頭に置いて、線虫や細菌に応じて使用することができる。
16. 2.10のようにLBとスピンでチューブを埋める。
17. 上清をデカントし、LB中で再懸濁する。
18. 2.14と2.15を繰り返すことによって、線虫を3回の合計をすすぐ。
19. 適切なボリュームに再懸濁した線虫の卵を希釈します。マイクロリットル当たり少なくとも10個の卵があるはずです。例えばgsは、植民地化細菌の増殖を阻害する抗生物質を添加し、パラフィルムでプレートをラップすることによって、少なくとも4日に5 mlのLBで6 cmのシャーレに保存することができます。卵は細菌の前の芝生の上に接種することに一度15mlのLB（2.13と2.14のように）で洗浄する必要があります。卵はこの時期に孵化し、植民地化アッセイに使用した場合、発達同期されない可能性があることに注意してください。

3。蛍光菌との共培養アッセイ

1. 必要に応じて、プラスミドを選択し、一晩蛍光バクテリアを育てています。
2. 滅菌スティックで10ミリメートル脂質寒天プレート上に細菌培養物600μlを広める。 2日間25℃でインキュベートする。
3. 各脂質寒天プレート上に100から400μL（200μlで最適に2000線虫）の合計で行わ500-5,000無菌線虫の卵を。
4. 25℃で水分のない暗闇の中でインキュベートIJS、または関心、フォームの他の段階まで、C。 IJSはFUとして表示されますプレートの端にzzy白いリング。他のライフステージを見るには、プロトコル4を参照してください。
5. 修正されたホワイトトラップ³⁰にプレートを置きます。脂質寒天プレートの蓋を外し、空の100ミリメートル×20mmのペトリ皿の底に底に置く。小さなプレートを囲むように、水と大型ペトリ皿、または線虫に適した他のバッファを埋める。水位は、小さなプレートの約半分の高さでなければなりません。
6. 子孫IJSバッファに浮上しているまで水トラップをインキュベートする。
7. 感染少年線虫は、組織培養フラスコに水に保存することができます。

4。スクリーニングのための早期ライフステージのコレクション

1. アッセイをセットアップするために3.4を介して手順3.1を使用してください。
2. 希望のライフステージが設置されるまで、プレートをインキュベートする。毎日の目視検査のタイミングを決定する必要があるかもしれません。プレートを検査するには、議定書2.5に記載されている手順を使用します。 Sのcarpocapsae XとM> eggsgrown LAプレート上nematophila、妊娠したメスは4-5日中に存在するであろう、少年は7日中に存在するであろう、と感染少年は15から17日までに生産され始めます。
3. 希望のライフステージが存在しているとき、あなたのサンプルを収集します。 200μLのPBSまたは他の適切な緩衝液を用いて96ウェルプレートのウェルを埋める。優しく線虫が含まれている細菌の芝生の一部を削り取る。豆粒大の量（約50mg）がF1子孫が生成されれば少なくとも数百線虫を提供しますが、もっと早い時点で必要になるかもしれません。よく含まれているバッファの中に棒を置きます。
4. 分〜30秒間インキュベートする。スティックを取り出し、残りの残渣を掻き。井戸から任意の寒天を除去するためにスティックを使用しています。線虫は、バッファ内で表示されるはずです。きれいな微量遠心チューブに緩衝液混合物を移動します。
5. レバミゾールまたは他の麻痺剤を用いて線虫を扱う。 30＆ムーにレバミゾール数粒を溶かす、水のリットル。サンプルの各50μlを、このミックス中1-2μlを添加する。レバミゾール処理後の線虫は、非現実的であろう。
6. サンプルは後日閲覧される場合は、この手順で説明したように、固定してください。されていない場合は、4.6に進みます。 1X緩衝液と4％パラホルムアルデヒドを含む固定液を200μlを加える。静かに混和し、ピペッティングで溶解するために繊細なライフステージを引き起こす可能性があります。ホイルでカバーし、少なくとも18時間、低オンシェーカー上で室温でインキュベートする。
7. 試験管ラックにチューブを置き、線虫はチューブの底に沈殿することができます。
8. 背景を削除するには、線虫を洗い流す。余分な液体をオフピペットと200を追加 - バッファー500μl、穏やかに混合する。繰り返します。これは、必要に応じてより詳細な背景を削除するには、数回繰り返してもよい。
9. 線虫はチューブの底に沈殿し、目的のボリュームに再懸濁することができます。
10. 線虫が固定されていない場合は、すぐに画面が表示されます。固定された線虫は、最大冷蔵庫に保存することができる2週間である。暗闇の中で保管してください。

5。顕微鏡による細菌協会のスクリーニング線虫

1. あなたの混合物の少量のサンプルを除去することにより、顕微鏡下で表示するためにいくつかの線虫を選択します。
2. 線虫は絵のために残っていることを保証するために、プロトコル4.5で説明されるように麻痺剤を用いて治療する。あなたは写真を撮っていないか、または線虫が既に固定されている場合、このステップはスキップしてもよい。
3. あなたの顕微鏡スライドに水で線虫の20から30μlを加え、その上にカバースリップを置く。
4. 線虫は視野にないことを保障するために光学顕微鏡を用いて全体の線虫を見る。
5. 細菌によって発現蛍光に相当顕微鏡で蛍光設定を使用して線虫を見る。
6. 細菌の局在を同定するために、蛍光灯の設定と光顕微鏡設定で線虫の写真を撮り、その後画像を重ね合わせる。写真は、同じ金融商品取引法である必要がビューのd。それは細菌を見つけるために線虫のいくつかの倍率とビューを試す必要があるかもしれません。
7. 線虫のコロニー形成の分布は、線虫の個体数を数えて細菌の有無を得点し、植民地パーセントを計算することにより定​​量することができる。集団内の少なくとも30線虫が各カテゴリーにカウントされるまで我々は信頼性の高い値を得るために（植民地化の有無にかかわらず）をカウントすることをお勧めします。
8. 人口の少ない線虫が植民地化されている場合、それは30が観察される前に、数千の線虫数をカウントする必要があるかもしれません。高スループットの計数については、以下の手順を使用します。
9. 代わりに、個別にマルチウェルプレートにアリコート人口（24ウェルプレートなど ）は線虫を数える。線虫が皿の底に沈殿した後、各ウェルを顕微鏡でスキャンすることができ、植民地線虫の数が得点することができます。
10. 線虫iの総数NAの人口は井の中の線虫の連続希釈により同定することができる。例えば、線虫の1mlをピペットチップを用いて攪拌することにより十分に混合し、ウェルに添加することができ、3μlをウェル内の総人口の定量化のために削除され、カウントすることができます。
11. 植民地線虫の割合は、井の中の線虫の総数によって植民地数で除して得られることができます。

6。代表的な結果

Xenorhabdus細菌に関連付けられている線虫Steinernemaの例の顕微鏡像を図3に示します。 図3Aに見られる合成画像を作成するには、位相コントラスト画像は、蛍光像を重層した。 図3Aの矢印は、細菌が感染幼若虫（バー=100μm）の内に存在することを示します。 図3Bは、同様の方法で構成され、幼若虫wiを描いた番目の緑色蛍光タンパク質標識された細菌（緑棒）は線虫腸管腔（バー=20μm）を全体に局在した。 2メディアから線虫の人口は共生細菌（ 表1）でカウントされ、植民地化の得点が記録されました。ロバスト統計のためには、少なくとも30は各カテゴリに落ちて試料ごとに少なくとも100線虫をカウントするのが最善です。 表1に見られるように肝臓腎臓寒天上に成長させたときの脂質寒天と68.6パーセントで成長させた場合、これらの線虫は約14.6％のレベルで植民地化されています。他の線虫や細菌種が植民地化のさまざまなレベルを有することが示されている。例えばX用nematophilaはSの99％に定着carpocapsae感染少年（マルテンス2003）、およびP. luminescensはHの26％に定着bacteriophora感染性少年（Ciche 2003）。

図1。方法の概略概略。 A.細菌は、蛍光タンパク質を発現するように設計されています。Bの線虫卵は無菌の線虫を生成するために成人線虫から分離されています。C.無菌の線虫は、蛍光バクテリアと共培養されています。D.は、得られるライフステージが下に見られる線虫内細菌の存在を評価するための顕微鏡。

図2。卵を含む成人女性の描写。 A.は、回路図では、Steinernemaの女性の一般的な外観を示しています。挿入図：SのDIC像feltiaeは女性の妊娠。黒い矢印は外陰部を示しています。白い矢印は、目に見える卵を示しています。画像は20X倍率であり、スケールバーは100μmを表しますが、開発された卵からかえっていないSのBの DIC画像線虫の卵をfeltiae。画像は40X倍率であり、スケールバーは50μmを表す。卵のC. DIC像を単Sから10Xの倍率で虫をfeltiae。スケールバーは100μmである。

線虫、細菌関連の図3の例顕微鏡画像。 A. S. puntauvense線虫は、その共生細菌、Xに関連付けられていたbovienii、GFPを発現。画像は同一視野から蛍光像と位相コントラスト画像を重ねて合成画像です。矢印は、線虫の宿主内での蛍光共生細菌を示しています。スケールバーは100μmを表します。B.この画像はSを示していますGFP発現Xとcarpocapsae少年線虫nematophilaは、線虫の腸内に局在。この画像は、微分干渉コントラスト画像の上に蛍光画像をオーバーレイを通して構築した。スケールバーは20μmを表す。

力む	acteriaで線虫の数	合計線虫は数え	線虫の割合はolonized
S. puntauvense脂質寒天	30	205	14.60パーセント
S. puntauvense肝臓腎臓寒天	72	105	68.60パーセント

表1。細菌の存在のための線虫個体群の例の得点。この実験では、無菌S. puntauvense線虫は植民地化の欠陥をテストするために彼らのGFP発現の異なる増殖培地上シンビオント（脂質寒天と肝臓腎臓寒天^32）で増殖させた。少なくとも1 hundreの合計サンプルあたりのD線虫は細菌の存在のために数えられると採点した。統計的検出力は、3つの実験では、各カテゴリに落ちる少なくとも30線虫を用いて計数されるべきであるが複製されます。

表2。プラスミドを含有する蛍光タンパク質。共生細菌に蛍光タンパク質を挿入するための潜在的なプラスミドのリストはプラスミドの名称で記載されて与えられます。含まれる他の情報は、プラスミド、メンテナンスのために使用される蛍光タンパク質エンコードされ、抗生物質カセット、使用するために他の命令、プラスミドの源です。括弧内に付記濃度はX用の使用される抗生物質の濃度であるnematophila。これらのプラスミドのそれぞれはXenorhabdusまたはPhotorhabdusどちらかで正常に使用されています。追加情報は、指摘の引用から入手することができます。応じてテストされている細菌で、いくつかのプラスミドは、蛍光タンパク質、抗生物質の選択、挿入部位、または複製の起点に基づいて動作しない場合があります。上記のプラスミドは、関心のある細菌での使用を可能にするかもしれないさまざまな機能が含まれています。たとえば、染色体のattTn7サイトにミニTN7-KSGFP挿入、しばらくXにpECM20挿入相同組換えによる染色体nematophila。あるいは、pPROBEプラスミドを体外に維持し、プラスミド各pPROBEは同じバックボーンおよびフルオロフォアを持っていますが、分類学上または変異の経歴にそれを使用するために、レプリケーションの異なる選択マーカーまたは起源を持っています。

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ディスカッション

ここで説明されたプロトコルは、線虫ホスト（ 図1）内の細菌を光学的に検出するための方法を提供する。この方法では、線虫のホスト（ 図3）内細菌の in vivo解析に有効に、線虫の光透過性と蛍光ラベル細菌に能力を活用しています。具体的には、このアプローチは、そのホスト内細菌の局在を識別します。細菌の存在のための線虫個体数およびスコア...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
脂質寒天 （滅菌）			8グラム栄養ブロス、15グラム寒天、5グラムの酵母エキス、890ミリリットルの水、10ミリリットル0.2グラム/ミリリットルのMgCl 2。 6H 2 0、96ミリリットルコーンシロップソリューション*、4 mlのトウモロコシ油* プレートを注ぎながら、メディアをかき混ぜる *オートクレーブ滅菌した後に成分を追加
コー​​ンシロップソリューション （滅菌）			7ミリリットルコーンシロップ、89ミリリットルの水 ミックスおよびオートクレーブ
卵液			16.6ミリリットル12％次亜塩素酸ナトリウム、5ミリリットル5M KOH、水80ml
溶原性ブロス （滅菌）			5グラムの酵母エキス、トリプトン10グラム、5グラムの塩、1Lの水 ミックスおよびオートクレーブ
フュージ	フィッシャー	13-100-675	マイクロチューブを保持する任意の微量が動作します
遠心	ベックマン	366802	15 ml及び50 mlコニカルチューブを保持している大規模なテーブルトップ遠心機
無菌の60ミリメートルX 15ミリメートルペトリ皿	フィッシャー	0875713
50mlの遠心管	フィッシャー	05-539-6
15 ml遠心チューブ	フィッシャー	05-531-6
無菌の100ミリメートルX 20ミリメートルペトリ皿	フィッシャー	0875711Z	標準のペトリ皿よりも深い
24ウェルプレート	グライナーバイオワン	662000から06
顕微鏡			顕微鏡はあなたのフルオロフォアと互換性蛍光機能を使用する必要があり
パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡学	15710
PBS （滅菌）			8gのNaCl 0.2gのKCl 1.44gのNa 2 HPO 4 0.24gのKH 2 PO 4 1Lの水 7.4と水に1LのオートクレーブのpHに調整する
マイクロチューブ	フィッシャー	05-408-138	2ミリリットルまたは1.5 mlチューブ
シェーカー			液体はそっと移動させる任意のシェーカーは動作します
ジアミノピメリン酸	シグマ	D-1377	必要に応じて、濃度または1mMにメディアを補完