腎細胞内のミトコンドリアの機能と細胞生存率の評価を過剰発現するプロテインキナーゼCアイソザイム

Grażyna Nowak; Diana Bakajsova

doi:10.3791/4301

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Method Article

腎細胞内のミトコンドリアの機能と細胞生存率の評価を過剰発現するプロテインキナーゼCアイソザイム

DOI:

10.3791/4301

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January 7th, 2013

Grażyna Nowak¹, Diana Bakajsova¹

¹Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Arkansas for Medical Sciences

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要約

呼吸と酸化的リン酸化により、細胞生存率に関連するミトコンドリア機能に対するプロテインキナーゼC（PKC）アイソザイムの活性化の効果を説明する。アプローチは、選択的に初代細胞培養や細胞のミトコンドリアの機能とエネルギー状態を決定するために種々のアッセイにおけるPKCアイソザイムを過剰発現するアデノウイルスの手法を適応します。

要約

アイソザイムのプロテインキナーゼC（PKC）ファミリーは多数の生理学的および病理学的プロセスに関与している。我々の最近のデータは、PKCは、ミトコンドリアの機能と細胞のエネルギー状態を調節していることを実証している。多数の報告は、PKC-αおよびPKC-εの活性化は虚血性心とを仲介する心保護におけるミトコンドリア機能を改善することを実証した。対照的に、我々は、PKC-α、PKC-εは腎細胞でnephrotoxicant誘発性ミトコンドリア機能障害や細胞死に関与していることを明らかにした。したがって、本研究の目的は、PKCアイソザイムを選択的に活性化または酸化的リン酸化と細胞生存の制御に果たす役割を決定するために阻害されるおそれのある積極的なミトコンドリアの機能を維持する腎細胞のin vitroモデルを開発することであった。腎近位尿細管細胞（RPTC）の初代培養は水戸のミトコンドリア呼吸と活動の結果改善された条件で培養したin vivoでの RPTCと同様chondrial酵素。伝統的なトランスフェクション技術（リポフェクタミン、エレクトロポレーション）は初代培養において非効率的であり、ミトコンドリアの機能に悪影響を及ぼすので、PKC-ε変異体cDNAをアデノウイルスベクターを介しRPTCに届けられました。 90％を超える培養RPTCのトランスフェクションでは、このアプローチは結果。

1：ここでは、におけるPKC-εの役割を評価するための方法を提示します。 ATP合成に関連付けられているミトコンドリアの形態と機能の調節、および2。初代培養におけるRPTCの生存。 PKC-εが過剰発現している恒常的に活性化、PKC-ε突然変異体によって活性化される。 PKC-εは、過剰発現することにより、PKC-εの不活性変異体を阻害される。ミトコンドリア機能は、呼吸、呼吸鎖の完全性、呼吸複合体およびF ₀ F _1-ATPアーゼ、ATPの生産速度、およびATP含量の活動を調べることで評価される。呼吸がある状態3（過剰基質およびADPの存在下で最大呼吸）と非結合呼吸としてジギトニン透過性RPTCにssessed。呼吸鎖の完全性は、単離されたミトコンドリアの呼吸鎖のすべての4つの複合体の活性を測定することにより評価される。酸化的リン酸化の容量は、ミトコンドリア膜電位、ATPの生産速度、およびF ₀ F _1-ATPaseの活性を測定することによって評価されます。 RPTCのエネルギー状態は、細胞内ATP含量を測定することにより評価されています。生きた細胞内のミトコンドリアの形態はMitoTracker赤580、具体的にミトコンドリアに蓄積蛍光染料、およびライブ単層蛍光顕微鏡で調べたを用いて可視化されています。 RPTC生存率は、アネキシンV /アポトーシスと腫瘍症を決定するために、フローサイトメトリーに続いてヨウ化プロピジウム染色を用いて評価されています。

これらの方法は、個々のPKCアイソザイムの選択的活性化/阻害を可能にin vitroで再生することができる生理学的、病理学的条件の様々な細胞機能における役割を評価した。

プロトコル

1。初代培養のための腎近位尿細管の単離

ウサギ、消費税両方の腎臓を麻酔し、層流フード内の無菌予備校バッファ（DMEM/F12培地）で満たされたペトリ皿の中に置いてください。
滅菌リン酸緩衝化生理食塩液、pH7.4（PBS）およびPBS-酸化鉄溶液（45ミリリットル+ 5ミリリットル）の50ミリリットル続い予備校バッファー50mlで各腎臓を灌流。腎臓を脱カプセルに入れるとデフェロキサミンを含む予備校バッファに転送します。
各腎臓の皮質を収穫。
15ミリリットルDounceホモジナイザーを用いて組織をホモジナイズする。 1リットルの無菌のビーカーの上に置か2滅菌メッシュ篩（底部に85μmで、その上に235μm）を介してホモジネートを注ぐ。デフェロキサミン含有緩衝液を用いてふるいを洗浄します。
デフェロキサミン含有緩衝液35〜40 mlを充填した無菌コニカル遠心管に85μmの篩上に残っている組織を収集します。静かに細胞懸濁液を混ぜる。
強いメートルを置き糸球体埋め鉄を除去し、サスペンションが安定できるように、管の外側agnet。パスツールピペットを用いて磁石から鉄を吸引します。このプロセスを繰り返します。
コラゲナーゼI及びデフェロキサミン含有緩衝液に溶解した0.6 mgの大豆トリプシンインヒビターの2,400-2,500単位を含有する消化培地1mlを準備します。消化培地をフィルター滅菌してください。
40ミリリットルに細胞懸濁液の量を調整し、消化培地1 mlを加える。 17分には優しく懸濁液を混合し、室温でインキュベートする、4℃で2分間50 xgで遠心℃、培地を吸引し、新鮮デフェロキサミンバッファを追加します。
鉄除去磁石と手順を数回繰り返し、再びダウンサスペンションを紡ぐ、培地を吸引し、全くグルコースを含まない培地46 mlを加える。
穏やかに混合し、2あらかじめ秤量エッペンドルフチューブに懸濁液500μlを測定します。 1分間10,000 xgで細胞をスピンダウンし、培地を吸引し、ペレットの重量を量る。湿った塊とタンパク質の総収量を算出します。
1mgのタンパク質/グルコースフリーDMEM/F12培地を用いて皿の密度で滅菌35mm培養皿で細胞プレート。 37℃（95％空気/ 5％CO _2）でインキュベーター内でオービタルシェーカー上に常に2ミリリットルグルコースフリーDMEM/F12培地中の培養細胞^。1,2

2。腎近位尿細管細胞培養

培養液は15mMのNaHCO _3、15mMのHEPES、及び6mM乳酸液（pH7.4、295ミリオスモル/ KGHを補充したDMEMとHamのフェノールレッド、ピルビン酸、グルコースないF-12栄養素ミックスの50:50混合物であり、 ₂ O）である。メディアは、L-アスコルビン酸-2 - リン酸（50μM）、ウシインスリン（10nM）を、ヒトトランスフェリン（5 mg / ml）を、ヒドロコルチゾン（50 nm）であり、セレン（5 ng / ml）の直前で補われ毎日のメディア変更。
滅菌技術を使用して皿から古い培地を吸引除去する。滅菌技術を使用して、各皿に温かい、新鮮な培地2 mlを加える。リNAL近位尿細管細胞（RPTC）めっき後、約5-6日でコンフルエントに達する^。1,2

3。 RPTCのアデノウイルス感染

アデノウイルス感染症は、日常のメディア変更後RPTCの合流は、消費文化の中で行われる。ドミナントネガティブのPKC-ε変異体は（dnPKC - ε）の交換によって構築された：1）ATP結合部位と偽基質ドメインの2）の位置でグルタミン酸とアラニン159の位置436のアルギニンとリジン。これらの変異は、PKC-εの活性コンフォメーションを変化させずにコンストラクトのキナーゼ活性を破壊した^{。3、PKC-ε}はその阻害偽基質ドメインの残基154から163の欠失によって恒常的に活性化しました^。4
PKC-＆epsilの大幅な増加をもたらす感染症の希望の多重度（MOI）を得るために、各皿にcaPKC-εcDNAまたはdnPKC-εcDNAを運ぶアデノウイルスの原液を追加で、タンパク質レベル。 24時間アデノウイルスでRPTCをインキュベートする。さらに24時間のメディアおよび培養細胞を変更します。リン酸化および総PKC-εタンパク質の有意な増加レベルはアデノウイルスベクターcaPKC-εをコーディングの25-50のMOIを用いて得ることができる。アクティブ、PKC-εのレベルでさらに大きく増加MOIが大きくなりますが、それは急速な細胞死と喪失によるRPTCは推奨されません。非アクティブのPKC-εタンパク質の有意な増加レベルは副作用を生じることなくRPTCにMOIを50から100までを使用して取得できます^。5
感染48時間後に、吸引メディアでは、PBSで単層を洗浄し、PKC-εのタンパク質レベルを決定するために、イムノブロット分析のために細胞を収集します^。5

4。 RPTC呼吸の測定

状態3呼吸を測定するためのアッセイ緩衝液を準備します（120のKCl、5mMのKH ₂ PO _4、10mMのHEPES、1mMのMgSO _4を、および2mM EGTA、pH7.4）に。複合体I-3結合した状態の呼吸を測定するために、5 mMのグルタミン酸、5mMのリンゴ酸塩、0.1 mg / mlのジギトニンでアッセイバッファーを補足するものです。複合体II結合状態3呼吸のために、10mMのコハク酸、0.1μMのロテノン、および0.1 mg / mlのジギトニンでアッセイバッファーを補足するものです。複雑なIVの結合状態3呼吸のため、1mMのアスコルビン酸、1mMのN、N、N '、N'-テトラメチル-p-フェニレンジアミン（TMPD）、および0.1 mg / mlのジギトニンでアッセイバッファーを補足するものです。 37℃の水浴中でソリューションを配置します。
RPTC単層を含む培養シャーレから培地を吸引、暖かい状態3呼吸緩衝液2mlを加え、穏やかにゴム製のポリスマンを用いて皿から細胞をこすり、クラーク型電極を搭載した酸素消費量室に懸濁液を移す。
メジャー状態2呼吸（ADPが存在しない場合）。最終濃度0.4mMにADPを加えることによって、状態3呼吸を開始します。最終concentrにオリゴマイシンを追加することにより、状態4呼吸を開始0.5μg/ mlのation。脱共役呼吸状態3で呼吸する細胞に0.5μMのFCCPを追加することによって測定されます^。6,7
、チャンバーからの細胞懸濁液を回収過塩素酸を用いてタンパク質を沈殿させ、沈殿物をスピンダウンします。細胞ペレット中のタンパク質濃度を決定します。

5。ミトコンドリア膜電位の分析（ΔΨm）

無菌培養培地中の0.5mMのJC-1の溶液を調製します。
ゆっくり5μMの最終濃度を得るために、各皿に、JC-1溶液20μlを追加します。渦巻徹底的に色素を混ぜて皿。 30分間インキュベーターに皿を返します。
氷、吸引メディアに皿を入れて、氷冷PBSで2回単層を洗浄する。吸引PBSは、新鮮な1mlのPBSを加え皿から細胞をこすり取るとエッペンドルフチューブに移す。上下にピペッティングすることによって、それらを単一細胞に単分子膜を破る。
2分、ASP、1,000 xgで懸濁液をスピンダウン上清を怒った、ペレットに1mlのPBSを加え、それが単一の細胞懸濁液を得るために再懸濁する。必要に応じて再度この手順を繰り返します。
2分間、1,000×gで細胞をスピンダウンし、上清を吸引し、PBS 0.5 mlを追加し、ペレットを再懸濁する。 488-nmアルゴンイオンレーザーで励起を用いたフローサイトメトリーによって蛍光を分析します。 2つの独立したチャンネル、590nmにおける525nmのFL1とFL2の発光をお読みください。ミトコンドリア膜電位はFL2/FL1蛍光比として表されます^。6

6。ミトコンドリアの単離

緩衝液（10mMのHEPES、225 mMのマンニトール、75mMのスクロース、0.1mMのEGTA、pH7.4）を、緩衝液B（含むプロテアーゼ阻害剤をバッファー、1mMのNa ₃ VO _4、1mMのNaF）を、およびバッファ：アイソレーション·バッファを準備C（10mMのHEPES、395 mMスクロース、0.1mMのEGTA、pH7.4）に。氷の上のすべての手順を実行します。
氷冷PBS緩衝液で2回RPTC単層を洗浄します。エッペンドルフチューブに単分子膜をこすり、それをスピン5分間、500×gで。緩衝液Aを1mlのペレットを洗浄
バッファBの1ミリリットル中にペレットを再懸濁され、2ミリリットルダウンスホモジナイザーに懸濁液を移す。
顕微鏡下で検査したときにホモジネート中のほとんどの細胞が壊れているまでDounceホモジナイザーで細胞をホモジナイズする。
4℃で5分間、1,000×gでホモジネートを遠心上清を採取し、4℃で10分間、15,000×gでそれをスピンダウン℃まで
4℃で10分、15,000 xgで上澄み液をスピンダウンし、緩衝液C 1ml中のミトコンドリア上清と再懸濁ペレットを含む粗を捨てるペレット2回以上の洗濯を繰り返します⁵
呼吸複合体の活動を測定するために、液体窒素中でアッセイ緩衝液および凍結の50〜100μlのミトコンドリアペレットを再懸濁する。氷の上でゆっくりとサンプルを解凍します。

7。 NADH-ユビキノン酸化還元酵素の活性の測定（複合体I）

10mMのKH ₂ PO _4、5mMのMgCl _2、pH7.2中：アッセイ緩衝液を準備します。それぞれ、最後の0.25パーセントの濃度と0.25mmを得るために脂肪酸フリーBSAおよびNADHを追加します。 2μg/ mlの最終濃度にアンチマイシン溶液（1 mg / ml）を2μlを添加する。
48ウェル透明板のサンプルを実行します。すべての追加はありませんが、ミトコンドリアを持つ空白のサンプルが含まれています。各ウェルに、付加およびミトコンドリアでのアッセイバッファー500μlを添加し、5分間混合しながら30℃で静置します。
各ウェルに3.25 mMのユビキノンの10μlを加えて反応を開始します。 20秒間隔で3分間吸光度（340 nm）を記録します。各ウェルにロテノン溶液5μl（1 mg / ml）を追加し、さらに2分間吸光度を記録。ロテノン感受性のNADHの酸化のような複雑なI活性を計算します⁷

8。コハク酸ユビキノン酸化還元酵素の活性の測定（複合Ⅱ）

脂肪酸フリーのBSA、20mMのコハク酸カリウム、0.25mMの2,6 - ジクロロ、2μg/ mlのアンチマイシン、および10μg/ mlのロテノン0.25パーセントを含むアッセイ緩衝液を準備します。
すべての追加はありませんが、ミトコンドリアを持つ空白のサンプルを含む48ウェル透明板で重複でサンプルを実行します。各ウェルに、付加およびミトコンドリアでのアッセイバッファー500μlを添加し、2分間混合しながら30℃で静置します。
各ウェルに3.25 mMのユビキノンの10μlを加えて反応を開始します。 20秒間隔で3分間吸光度（595 nm）を記録します。 2,6 -ジクロロの削減に従うことによってコンプレックスII活性を計算します⁷

9。ユビキノール - シトクロムc酸化還元酵素（複合体III）の活性測定

シアン化合物0.1パーセント脂肪酸フリーのBSA、80 mMのカリウムコハク酸、10μg/ mlのロテノン、および0.24 mMのカリウムを含むアッセイ緩衝液を準備します。
サンプルを実行するすべての追加はありませんが、ミトコンドリアを持つ空白のサンプルを含む48ウェル透明板に重複インチ各ウェルに、付加およびミトコンドリアでのアッセイバッファー291μlを添加し、5分間混合しながら30℃で静置します。
各ウェルにシトクロムcを酸化さ6mmの3μlを加えて反応を開始します。 20秒間隔で3分間吸光度（550 nm）を記録します。各ウェルにアンチマイシン溶液（1 mg / ml）を5μlを加え、さらに2分間吸光度を記録。アンチマイシン敏感なシトクロムc還元などの複雑III活性を計算します⁷

10。シトクロム酸化酵素の活性測定（複合体IV）

シトクロムcの9 mM溶液にアスコルビン酸ナトリウムを添加し、4℃で一晩ソリューションを透析によって減少シトクロムcを準備°5mMのMgCl _2を含むリン酸緩衝液を1LのC（10mMのKH ₂ PO _4、pH7.2）で。含むアッセイ緩衝液を準備します。0.1パーセント脂肪酸フリーBSA及びアンチマイシンA（2μg/ ml）を。
すべての追加はありませんが、ミトコンドリアを持つ空白のサンプルを含む48ウェル透明板のサンプルを実行します。各ウェルに、付加およびミトコンドリアでのアッセイバッファー233μlを添加し、5分間混合しながら30℃で静置します。
減少シトクロムc（90μMの最終濃度）を添加することにより反応を開始します。 20秒間隔で3分間吸光度（550 nm）を記録します。各ウェルにKCN溶液2μlを（8μg/ ml）を加え、さらに2分間の吸光度を記録。 KCN-敏感シトクロムc酸化のような複雑なIV活性を計算します⁷

11。 F ₀ F _1-ATPアーゼ（ATP合成酵素）の活性測定

F ₀ F _1-ATPaseアッセイ用緩衝液（10mMトリス-HCl、200mMのKClを、2mMのMgCl _2、pHは8.2）を準備します。アッセイ緩衝液中でミトコンドリアペレットを再懸濁し、リキでミトコンドリアのサンプルを凍結dは、窒素と氷の上でゆっくりとサンプルを解凍します。
48ウェル透明板で三重にサンプルを実行します。各治療群では、2ウェルをオリゴマイシン鈍感ATPase活性を測定するために合計ATPase活性（アッセイ緩衝液275μlを、5μlのミトコンドリア懸濁液、95％エタノールを5μL）とよく1を測定するために実行されます（275μlのアッセイバッファー、5μlのミトコンドリア懸濁液、95％エタノールで1 mg / mlのオリゴマイシン溶液を5μl）。
定数に振盪しながら10分間31℃でインキュベートする。 100mMのATP溶液（pH7.0）を16μlのを追加し、定数に振盪しながら5分間31℃でインキュベートする。
3 M TCAの50μlを含むチューブにインキュベーション混合液200μlを移す。氷上で10分間サンプルをインキュベートし、4℃で5分間、10,000×gでそれらをスピンダウン℃までそれぞれ、リンおよびタンパク質の含有量を決定するために、上清とペレットを使用しています。
使用上清中のリン酸含量を決定無機リン酸アッセイ。 3.75 H ₂ SO ₄ 10mlに0.88グラムのFeSO _4を追加し、H _{2 O}で90mlに調整することにより、サムナー試薬の100ミリリットルを準備H ₂ SO ₄のFeSO ₄の溶液にモリブデン酸アンモニウム溶液10ml（0.66メルトmlのH ₂ O）を追加します。光から保護してください。
と写しの各上清50μl -各リン酸標準液50μl（1,000μMのKH ₂ PO _4、0）を使用した負荷を96ウェルプレート。各ウェルにサムナー試薬250μlを加えると一定に振とうしながら15分間30℃で静置します。
室温で595 nmの吸光度を記録します。 F ₀ F _1-ATPase活性は、我々は前述のようにATPから_P iのオリゴマイシン感受性の放出を測定することにより決定されます^。7,8、合計を計算し、オリゴマイシン鈍感F ₀ F _1-ATPase活性。オリゴマイシン感受性のATPアーゼACTIを計算するにはVITY、合計ATPase活性からオリゴマイシンと小文字を区別しない活動を差し引きます^。8,9

12。細胞内ATP量の測定

氷上RPTC単層を含む場所培養皿、培地を吸引除去し、氷冷PBS緩衝液で2回単層を洗浄する。各単層に1 mlのPBSを加え、PBSに各単層をこすり、そしてエッペンドルフチューブ中の細胞懸濁液を収集します。 5秒間微量のエッペンドルフチューブを軽くスピン。
ATPの生物発光アッセイキットHS II（Roche）および製造者のプロトコルを用いてルシフェラーゼ法により各RPTC試料中のATP含量を決定します。各サンプル中のタンパク質濃度を測定し、mgタンパク質当たりのATP濃度を計算します^。8

13。ミトコンドリア形態の可視化

培地を変更します。各皿にMitoTrackerレッド580の100μM溶液（最終濃度100nM）の2μLを加えincubatoに食器を返す30分間R。
水浸対物レンズを用いて蛍光顕微鏡下で単層のライブを調べてください^。5

14。細胞生存率の分析

検定を開始する前に、24時間後にはアポトーシスの陽性コントロール（アネキシンV陽性細胞）となる細胞を治療するために、シスプラチンの50mMの溶液を調製します。また、腫瘍症の陽性コントロール（プロピジウム陽性細胞）となる細胞を治療するためにtert-ブチルヒドロペルオキシドの500mMの溶液を調製します。
50mMのシスプラチンの2μl 及び tert-ブチルヒドロペルオキシド500mMの2μLで2皿で2皿を扱う。無染色のコントロールのための1皿を捧げます。
シスプラチンとTBHPによる治療後24時間後に、結合緩衝液（10mMのHepes、140mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgCl _2、1.8 mMのCaCl _2）、ヨウ化プロピジウム（PI）溶液（50μg/ mlの）を準備結合バッファーインチ
バインディングバフで一度単層を洗浄しますえー。氷冷緩衝液1mlと無染色とアネキシンV陽性細胞を除いて各皿にPI溶液の50μlを追加します。皿をカバーし、穏やかな軌道振盪しながら氷上で15分間インキュベートする。
結合バッファー（10分）と単層を洗浄し、無染色、PI陽性細胞を除いて各皿に結合バッファー1mlおよびアネキシンV-FITC溶液2μlを添加する。皿をカバーし、穏やかな軌道振盪しながら室温で10分間インキュベートする。
バッファーを吸引除去し、穏やかな軌道振盪しながら10分間氷上で氷冷結合緩衝液1mlで単層を洗浄する。洗浄工程を繰り返します。
結合緩衝液を吸引除去し、各皿に結合バッファー500μlを添加する。穏やかにゴム製のポリスマンを用いて細胞をこすり取るとフローサイトメトリーチューブに細胞を移す。上下のサンプルをピペッティングすることによって単一の細胞懸濁液に細胞を分散させる。任意の細胞塊を壊す。
FLOによって直ちにPIおよびアネキシンV-FITCの蛍光を定量化するワットサイトメトリーは、それぞれPIとFITC用590と530nmで488nmおよび発光で励起を用いた。各サンプルの10,000イベントをカウントします。
X軸およびフローサイトメトリードットプロット図のY軸上のPIの蛍光でFITC蛍光を置く。 PIのアネキシンVの正と負の細胞がアポトーシスとみなされます。アネキシンVのPIの正と負の細胞が膠質とみなされます^。10,11