蛍光顕微鏡法による、複数世代にわたってライブ哺乳類細胞におけるプラスミドの複製を監視

要約

生きた細胞内の個々のDNA分子を観察する方法が記載されている。技術は目的のDNAに組み換え結合部位に蛍光標識lacリプレッサータンパク質の結合に基づいています。この方法は、時間をかけて生きている細胞内の多くの組換えDNAをたどるように適応させることができる。

要約

いくつかの天然に存在するプラスミドを、哺乳動物細胞内に保持されます。これらのうち、複数のヒト悪性腫瘍^1-3引き起こすエプスタイン-バーウイルス（EBV）およびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）を含むガンマヘルペスウイルスのゲノムは、されています。これら二つのゲノムは単一のウイルス蛋白質と細胞複製機構を使用して、それぞれの、ライセンスされた方法で複製され、その欠けている伝統的なセントロメア^4月8日にもかかわらず、細胞分裂の際に娘細胞に渡されます。

多くの仕事は、サザンブロッティングやin situハイブリダイゼーション（FISH） 蛍光 inなどのメソッドを使用して、これらのプラスミドゲノムの複製を特徴付けるために行われている。これらの方法は、しかし、制限されています。定量PCRおよびサザンブロットは、細胞集団における細胞あたりのプラスミド数の平均値に関する情報を提供します。 FISHは平均数とプラスミドの分布の両方を明らかに単一セルアッセイであるの細胞あたりの細胞集団でなく調べセルの親や子孫の情報を全く許さない、静的なものである。

ここでは、生きた細胞内のプラスミドを可視化するための方法を説明します。このメソッドは、関心⁹のプラスミド内に複数のサイトへの蛍光標識ラクトースリプレッサータンパク質の結合に基づいています。目的とするDNAをラクトースオペレーター（LACO）配列の約250タンデムリピートを含むように設計されています。 LACOは、具体的に蛍光タンパク質に融合させることができるラクトースリプレッサータンパク質（LACI）によってバインドされています。融合タンパク質は、いずれかの人工プラスミドまたはレトロウイルスベクターにより導入されたから発現させることができる。このように、DNA分子は、蛍光標識、したがって、蛍光顕微鏡を介して、目に見えるようになるされています。プラスミドが閲覧できるようになるまで融合タンパク質は、IPTGの存在下で培養することによりプラスミドDNAを結合からブロックされています。 ontentは ">このシステムは簡単にトランスフェクションし、理想的な細胞が接着されています。それらの合成の特性を明らかにし、娘細胞に分割、プラスミドは数世代を通して生きた細胞で監視することができ、大規模な核を持っているこの技術はあることを決定するために使用されていますEBV由来プラスミドの84％は、HeLa細胞に娘細胞に忠実に、各世代を合成し、新たに合成されたプラスミドパーティションの88％されており、これらのEBVプラスミドのペアがでそれらの合成の後につながまたは姉妹染色分体に関連付けられていることが観察されたS-彼らは後期¹⁰で分離された姉妹染色分として分離するのを見たまで。メソッドは現在、HeLa細胞とSLK細胞におけるKSHVゲノムの複製を研究するために使用されています。HeLa細胞は、ヒト上皮細胞を不死化され、SLK細胞が内皮ヒト不死化している段階細胞。SLK細胞はもともとKSHVの病変に由来したものの、ヒーラもSLKのセルライン自然にハーブもORS KSHVゲノム^11。ウイルス複製の勉強に加えて、この可視化技術は、合成、ローカリゼーション、および他の組換えプラスミドDNAのパーティション化に様々なDNA配列の要素の追加、削除、または変異の影響を調査するために使用することができます。

プロトコル

1。可視プラスミドを有する細胞のエンジニアリング

1. 視覚化するプラスミドにラクトースオペレーター配列（LACO）の約250部を含むDNA断片を導入するために標準の制限酵素消化または相同組換え技術を使用しています。私たちのプラスミドは約170 kbpのバクミドだっおよびハイグロ¹²にカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスの全ゲノム（KSHV）とエンコードされた抵抗を含んでいた。
2. リポフェクタミン2000を用いたトランスフェクションにより、哺乳動物細胞へLACO含有プラスミドDNAを導入。我々は、25μlのリポフェクタミン2000、0.5ミリリットルのOptiMEM、および3.5ミリリットルDMEMで精製プラスミドDNA10μgを4時間の場合は60 mmディッシュでHeLaおよびSLK細胞をトランスフェクションした。
3. 10％ウシ胎児血清および48時間インキュベート細胞と5ミリリットルDMEMに培地を変更します。
4. プレート導入ナンプラーための抗生物質の選択を含む培地中で大きな皿や培養細胞における低密度での細胞SMID、我々は3週間300μg/ mlのハイグロマイシンを10％ウシ胎児血清を含むDMEM中で細胞を選択した。
5. 新しい培養皿にハイグロマイシン耐性コロニーを転送するために、滅菌したトリプシンに浸したろ紙の小片を使用しています。
6. トランスフェクトされたクローンは皿を埋めるために成長しているときは、プラスミドLACOのポリマーが均一に、予想されたサイズのあることを確認するブロッティング、制限消化し、サザンのためにDNAを単離する。
7. プラスミドはlacIの融合を発現するように設計されていない場合は、そのようなLacIリ-tdTomatoとして赤色蛍光タンパク質と融合ラクトースリプレッサー（LACI）をコードするレトロウイルスを適切なクローンを感染させる。我々はtdTomatoはなく長い時間¹³を介して複数のエクスポージャーから生じるであろうphotoxicityを最小限にするために緑色に近い蛍光を発するタンパク質を使用しています。
8. バインディングからの融合タンパク質をブロックするように200μg/ mlのイソプロピル-BD-ガラクトシド（IPTG）の存在下でLacIリ融合タンパク質が導入されると、細胞培養DNA。
9. 文化少なくとも3日間の細胞は、lacI-tdTomatoタンパク質の発現を可能にする。
10. バインドされていない融合タンパク質の最小限のバックグラウンドレベルとの明確なシグナルを明らかLacIリ-tdTomatoの最適レベルとのそれらのためのスクリーンのクローン（IPTGを洗い流し、下記のようにセルを表示することによって）。

2。イメージングシステムの開発

当社のイメージング·システムは、電動ステージと計画Aochromat 63x/1.4油浸対物装備ZEISS AXIOVERT 200Mで構成されています。蛍光励起光がコリブリシステムのLEDが "昼白色"によって提供されています。 1024 EMCCDカメラ：発光がCascadeIIによって検出されます。これは、信号を増幅するゲイン·レジスタを用いて冷却、裏面入射型カメラです。暗電流は、毎秒画素あたり0.061電子であり、量子効率は0.90より大きい。システムはSmartExperimentsモジュールを含む、AxioVisionの4.8ソフトウェアによって制御されます。 tdTomaの検出のための我々はそのために通過した光の85％が蛍光と放出された光の95％を励起することができるツァイスフィルターセット75HEを使用すると、発光フィルターを通過します。

1. 複数の長い時間間隔で連続して画像の自動取得のために敏感な信号の検出、特定の励起と高速シャッター、電動ステージとフォーカスアーム用LED光源、およびソフトウェア制御用倒立顕微鏡とEMCCDカメラとイメージングシステムを組み立てるZ-スタック。システムは、振動から隔離される空気テーブルの上に座ってください。
2. 37℃、加湿チャンバー内の5〜10％のCO ₂で細胞を維持するために、ステージトップインキュベーターを組み立てる。実験中に動きのアーチファクトを最小限に抑えるために安定した温度に来るシステムのための十分な時間を確保します。
3. サンプルから熱を吸い上げるから客観を防ぐために客観的なため、加熱されたカラーを使用しています。

3。標識されたDNAの可視化

1. 35ミリメートルの板細胞セルのペアが重ならずに8月16日細胞のコロニーに分割することができます10％未満の合流点の密度でガラスボトムディッシュ、。生存細胞が分裂する時間を持つようにイメージを作成する前に、この少なくとも24〜48時間を行う。
2. 撮影開始前に1〜3時間、選択的薬剤およびIPTG両方を欠いている培地でプレートを3回すすいでください。この手順では、離れて、非生存細胞を洗浄およびlacI融合タンパク質はプラスミド中LACOサイトをバインドすることができます。
3. 10％ウシ胎児血清および25mM HEPESで2ミリリットルDMEMで培養液を交換してください。
4. 35mmディッシュ用取付リングに延伸CultFoilと培養皿の上部を元に戻します。このカバーは、時間をかけて塩濃度を増加させ、細胞を殺す培地の蒸発を抑制します。
5. セルを表示し、ビューの複数のフィールド内のセルの上部と下部の焦点面を決定する微分干渉コントラスト（DIC）のイメージングを使用しています。各フィールドで、セルの上部から焦点面に道の約1/3を下に移動します。 x、yを保存し、zが保存されてステージ位置のリストに座標。
   注：プラスミド信号は細胞があるlacI融合タンパク質を適切な波長のLEDによって照らされる接眼レンズを介して表示されない場合があります。弱い信号だけ時間をかけて信号の統合を可能にし、したがって効果的に弱い信号を増幅EMCCDカメラの使用、と見えるかもしれません。
6. 顕微鏡制御ソフトウェアでは、保存された各ステージの位置で実行される画像のzスタックを定義します。 z次元¹⁴に近似ナイキスト·サンプリングにあなたをできるようになります0.35から0.50μmのAZのステップサイズを選択してください。細胞周期の間の細胞の動きに従い、これらのスライスは、検出を可能にし、また画像スタックの取得後の処理（デコンボリューション）で使用され、細胞が置かれている面の上下に "余分な"スライスが含まれています。この包含は意志セルの厚さに応じて、40から60までの画像をスタックにつながる。
7. 顕微鏡制御ソフトウェアでは、（プラスミドを可視化するための10から60分間隔で30分間隔（長時間にわたって細胞分裂および移行を追跡するため）と蛍光画像でZ-スタックの明視野像を収集するために、時系列の実験を定義細胞内で）。それは長い間実験の過程で光毒性を不必要に細胞を公開することができます標準の明視野像、より多くの光を必要とするため、実験中にDICのイメージングを使用しないでください。
8. ソフトウェア制御の実験を開始します。システムが妨害されないことを確認します（等、過剰な室内光にさらされ、バンプ）実験中。
9. 必要に応じて、実験中に加湿システムで水を補給してください。

4。画像の取得後の処理

1. 各zスタックと時間ポイントの画像を確認してください。の不要な領域を切り抜く次のステップでコンピュータの処理時間を短縮するための画像。
2. 各zスタック¹⁵で原点の画素に信号強度を再割り当てするにはデコンボリューションアルゴリズムを使用します。このデコンボリューションは、イメージングシステムのための理論的な点広がり関数に基づくこ​​とができますが、それは、イメージング蛍光ミクロスフェアによる特定のシステムの点広がり関数を測定し、デコンボリューションアルゴリズムでは、この測定値を使用することが好ましい。私たちは、イメージングシステムの点広がり関数を測定し、適用AxioVisionのソフトウェア（AxioVisionのソフトウェアの説明、ツァイス）の最尤反復アルゴリズムを拘束されています。
3. 細胞周期と娘細胞へのプラスミドのパーティションの分割中にプラスミドの強度変化と動きを追跡するために画像を調べます。

結果

代表的な実験で取得したZ-スタックの最大強度の予測を図3に示します。典型的なプラスミド信号は、単一またはプラスミドのクラスタを表しているかどうかに応じてzスタックの3-8スライスに存在しています。細胞が分裂期に達するまでのEBVおよびKSHV由来プラスミドの場合、信号が細胞内でゆっくりと移動します。細胞自体は、実験のコースを上に移行されます。彼らはまた...

ディスカッション

ここで説明する方法は、複数の世代にまたがる時間をかけて生きた哺乳動物細胞におけるプラスミドをフォローするために使用できます。励起光への曝露を制限することによって、我々は、少なくとも72時間、3細胞分裂を表す16から32細胞のコロニーを通って新しく分割ペアからセルをフォローするために、これらの技術を使用している。これらの実験は、このような定量的PCR、サザンブロッ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	注釈
DMEM	GIBCO	11965
OptiMEM中	GIBCO	31985
ウシ胎仔血清	Hyclone社	SH30910.03
ペニシリン	シグマ	P3032
硫酸ストレプトマイシン	シグマ	S9137
ハイグロマイシン	カルビオケム	400050	SLKのための400μg/ mlの、HeLa細胞では300μg/ mlの
イソプロピル-BD-ガラクトシド（IPTG）	ロッシュ	10 724 815 001	最終濃度が200μg/ mlの
リポフェクタミン2000	インビトロジェン	11668-027
HEPES	GIBCO	15630
ガラスボトムディッシュ	マテック	P35G-1.5-10-C
CultFoil	Pecon	000000-1116-08
AXIOVERT 200M	ツァイス
コリブリ	ツァイス	423052-9500-000
中性の白色LED	ツァイス	423052-9120-000
フィルターキューブ75 HE	ツァイス	489075-0000-000
プラン·アポクロマート63x/1.4客観	ツァイス	440762-9904-000
CascadeII：1024 EMCCDカメラ	Photometrics	B10C892007
Tempcontrolミニ	ツァイス/ Pecon	000000-1116-070
Tempcontrol 37から2デジタル	ツァイス/ Pecon	000000-1052-320
CTIコントローラー3700デジタル	ツァイス/ Pecon	411856-9903
客観ヒーター	ツァイス/ Pecon	440760-0000-000
ステージ加熱インサートP	ツァイス/ Pecon	411861-9901-000
ステージトップインキュベーターS	ツァイス/ Pecon	411860-9902-000
加湿システム	ツァイス/ Pecon	000000-1116-065