腰椎運動ニューロンおよび成体マウスでそのモーターユニットによる力の同時細胞内記録<emインビボ&gt;</em

Marin Manuel; C.J. Heckman

doi:10.3791/4312

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要約

この新しい方法は、単一の成体マウスの運動ニューロンとその筋線維による力の測定を同時に細胞内記録を可能にします。正常および遺伝子改変動物における運動単位の電気的および機械的特性の組み合わせ調査は、神経筋システムの研究のための画期的な製品です。

要約

それは独特の特性（1）は、容易に識別可能ターゲット（筋線維）を有するため、非常によく知られた機能を有するもので、中枢神経系のニューロンであるため、脊髄の運動ニューロンは、長い神経機能を研究するための優れたモデル系であった（筋収縮を制御する）、（2）それゆえ、多くの脊髄と降順ネットワークの収束目標、 "最終的な共通経路"の名であること、（3）それが可能鋭い細胞内電極を用いて、それらを貫通するようになり、大きなソーマを持つ。さらに、in vivoで検討したときに、同時に運動ニューロンとその筋肉のターゲットによって開発された力の電気的活動を記録することができる。したがって、同時に、勉強することができるというユニークな立場に実験者を置くin vivoで運動ニューロンの細胞内録音の実行"を参照してモータユニット"（運動ニューロンに与えられた名前は、その軸索のすべてのコンパートメント、およびそれは^{1を神経支配}筋線維）：運動ニューロンに衝突する入力は、運動ニューロンの電気生理学的特性、及び運動ニューロンの生理的機能のこれらのプロパティの影響は、そのモータユニットで発生する力、 すなわち 。準備が麻痺することはできませんので、細胞内記録のための機械的安定性が低下するので、このアプローチは非常にやりがいがあります。したがって、この種の実験は、ネコやラットでは達成されています。それは、正常および遺伝子改変マウスで同様の実験を行うことが可能であった場合は、脊髄運動系の研究は恐るべき飛躍を作ることができます。

技術的な理由のために、マウスの脊髄ネットワークの研究は主に運動ニューロンと脊髄ネットワークが未熟、運動ニューロンは、そのターゲットから分離され、スライスで研究されているin vitro標本で新生児に限られていた、MOtoneuronsは、それらの入力の大部分から分離されています。最近まで、唯一のいくつかのグループは、私たちは成体マウスの生体内で ^5,6を運動ニューロンの非常に安定した録音を取得するために許可された新たな準備を発表し、私たちのチームも含め、 生体内^2-4に運動ニューロンの細胞内の録音を実行するために管理していた。しかし、これらの録音は、 すなわちこれらの運動ニューロンの力出力を記録する可能性がなく、麻痺した動物で得られた。ここで我々は運動ニューロンの電気生理学的特性とそれらのモータユニットにより開発力の同時録画を得ることができましたこのオリジナルの準備の延長を提示。それは、私たちは彼らの力のプロファイルに基づいて、運動ニューロンの異なるタイプを識別し、それによって、その機能を明らかにすることができますので、これは重要な成果である。遺伝的モデルは、脊髄分節回路^7-9を乱し、又はヒトdiseaをreproductingと相まって^10,11 SE、我々 ^はこの手法は、脊髄運動系の研究のために不可欠なツールであることを期待しています。

プロトコル

1。ステップワン

プリ麻酔薬：麻酔導入前に10〜15分間、それぞれ流涎および浮腫を防ぐため、アトロピン（0.20 mg / kg）及びmethylprenidsolone（0.05 mg）を皮下に注射する。

2。ステップ2

麻酔導入：ペントバルビタールナトリウム（70 mg / kg）をまたはケタミン/キシラジンの混合物（それぞれ100 mg / kgおよび10 mg / kgの）腹腔内に注入します。マウスがないつま先のピンチ反射が得られないことができるようになるまで下に行きましょう。麻酔が軽すぎると思われる場合は、投与量の1/4で補う。

3。ステップスリー

*注：この手術は、端末の手順です。

麻酔の外科平面に達したときは、腹臥位で提起された暖かい毛布の上にマウスを移す。

100ミリリットル/分の周りの流れに純粋なO _2を提供_するマスクを使用してマウスの鼻をカバーしています。
はバリカンを使用して、首筋から尾の付け根に背部を剃る。
また、右後肢を剃る。
仰臥位にマウスを裏返しますが、代わりに酸素マスクを残すために世話をする。

4。ステップ4

手足に巻回され、作業面の四隅に固定縫合のある場所でマウスを固定します。

5。ステップ5

マウスのコア温度を監視する温度プローブを挿入します。 36℃と38℃の間でコア温度を維持するために、加熱毛布/ランプ電力を調整する

6。気管切開と人工換気

鈍はさみを使用して、気管の上にカットして、両側の肌を引き出します。
気管を覆う二つの薄い筋（胸骨舌骨）を露出するように鈍い鉗子を用いて、唾液腺を引き裂く。
2 MUSC別、鈍鉗子を用いて気管を明らかにするために彼らの内側に沿って分離レ。
デュモン7鉗子を用いて、気管の下に4.0絹縫合糸の2つの長さをスライドさせます。
2軟骨のリングの間で気管内横断カットしてではなく、セクション気管を完全に世話をする。
気管ダウン気管チューブを挿入し、その上に糸を結ぶことにより、挿入口の両側に固定します。気管チューブは、マウス人工呼吸器（SAR-830/AP、CWE社）とカプノグラフ（μcapstar、CWE社）に接続されています。人工呼吸器は、純粋なO ₂のソースに、コンプライアンス袋を通して、接続されています。マウスは人工呼吸と戦っておらず、呼吸終期PCO _2が 4と5％の間で安定しているように、人工呼吸器（呼吸速度100から150拍、呼吸終期の容積170から310μL）のパラメータを調整します。

7。静脈ラインの配置

鈍的剥離技術を使用して、頸静脈を露出首の片側の静脈。このレベルでは、頸静脈は、2つの主要なトランク、前部と後部の顔面静脈に分割されます。
これらのトランクのそれぞれについて、1回のセットを次の手順を実行します。
1. デュモン4または5の鉗子を使用して、その周囲の結合組織から静脈を慎重に分離します。
2. デュモン7鉗子を用いて、静脈の下に6.0絹縫合糸の2つの長さをスライドさせます。静脈の長さに沿って可能な限りそれらを分離。
3. 静脈（心臓に近い側）の近位側にある小さな血管クリップを配置し、静脈の遠位側をオフに接続します。
4. 非常に微細なアイリスはさみを使用して、完全にセクションに静脈を細心の注意を払っていない取って、静脈内に小さな横切開を行います。
5. アップ血管クリップに、開口部にプレフィル1FRカテーテル（premicath、Vygon）を挿入します。
6. 、デュモン4鉗子で一緒に静脈カテーテルを保持して慎重に血管クリップを削除し、その後いくつかのMORカテーテルをプッシュ静脈へのeはミリメートル。
7. 挿入の両側の両方の縫合糸とそれを結ぶことによってカテーテルを固定します。
カテーテルの一つは、注射器や麻酔の補足投与、必要に応じて（通常は毎年10月30日分）を注入するシリンジポンプに接続されています。 IV用量は、ペントバルビタールナトリウムまたは1250年40μg/ kgの/ケタミン/キシラジン¹²分のいずれかの6 mg / kgである。他のカテーテルをNaHCO _3（1％）とplasmion（14％）を含む4％グルコース溶液をゆっくり静脈内注入（50μL/ HR）のシリンジポンプに接続されています。

8。針および縫合糸と首の皮膚を閉じて、腹臥位にマウスを返す

9。後肢の筋肉と神経の解剖

はさみを使って、太ももの上からアキレス腱に切り込みを入れる。血管を傷つけないように注意しながら、下層にある筋肉から皮膚を分離。必要に応じて焼灼する。
の腿を走って白い線として現れる大腿二頭筋の前縁を識別します。はさみを使って、慎重に膝からのラインに沿って腰の骨へのすべての道を開く。筋肉を区切ります。坐骨神経は現在、大腿二頭筋の下に表示されます。
慎重に大腿二頭筋を解剖。出血を防ぐために、必要に応じて/リガチャーを焼灼する。大腿二頭筋は完全に削除されたり、単に坐骨神経と下腿三頭筋の筋肉を露出させるためにリクライニングすることができます。
腓腹神経を解剖する。
8/0絹糸を使用し、総腓骨神経の遠位部を縛って、結び目の遠位にカットします。できるだけ腰に近づけて、神経のすべての方法を解剖する。
総腓骨、腓腹神経間における脛骨神経を識別します。脛骨神経の別の支店の中では、（以下、脛骨神経とも呼ばれる）深く行く枝からトライセップス·下腿を支配ブランチを識別する。
8/0シルクを使用した枝はトライセップス·下腿を支配そのまま維持しながらスレッド、脛骨神経のすべての支店を結びつける。結び目に対して遠位脛骨神経をカットし、可能な限り神経を解剖する。
次の手順に進む一方dessicationを防止するために生理食塩水を吸収させたガーゼで全体の後肢をカバーしています。

10。椎弓切除術

はさみを使って、骨格に沿って切り込みを入れる。下層にある筋肉から皮膚を分離します。
皮下の筋肉を分離するために椎骨の両側にある2つの切開を行う。次に、それぞれの側の椎骨の側に取り付ける筋肉の各腱を切った。
鈍鉗子と罰金キュレット使用して、明らかに個々の椎骨を特定するために棘突起の周りの脊椎の背側の筋肉の残りの部分を削除します。
椎骨T13とL1を識別します。 T13は取り付けリブを持っている最後の椎骨である。脊柱ワット病気カニンガム脊髄脊椎のクランプ（株式会社Stoelting）を使用して固定化する。 T13とL1のそれぞれの側に脊髄クランプを置きます。脊髄を圧迫しますが、縦軸にテンションを少しかけないように注意してください。脊柱はよくピンセットで軽く押し下げて固定されていることを確認してください。
細かいrongeursを使用して、それによって脊髄を露出し、T13とL1を介してその後ラミナを脊髄プロセスを削除します。
乾燥を防ぐために、生理食塩水を吸収させ、綿またはspongelの小さなビットで露光脊髄をカバーしています。
脊髄を取り巻く、背中の上にプラスチック製のお風呂を作ったカスタムを置きます。 4/0絹糸を使ってその場でお風呂を固定します。浴はクイック·キャストシーラント（WPI）とそれを封止することで防水であることを確認します。
クイック·キャストが乾燥した後、脊髄を覆っている綿を除去し、ミネラルオイルと一緒にお風呂を埋める。
デュモン5鉗子、非常に微細な虹彩のはさみを使って、優しく硬メイトを引っ張るrは脊髄を囲むと、両方の方向に可能な限りそれを開きます。脊髄の両側にある硬膜を折る。
それが椎クランプによって中断保つようにマウスがそう嘘をついている上げられたプラットホームを下げます。
動物の背中の領域をサポートするために仙骨部の棘突起をクランプするために別の椎クランプを使用しています。
第3のクランプは、右後肢と足首を固定するために使用され、膝で90°の角度で屈曲。

11。アキレス腱解剖

手足が膝と足首は90°に曲げて、後肢領域をカバーガーゼを除去し、周囲組織の自由なアキレス腱を解剖。だけでなく、周囲の組織からできるだけ多くの下腿三頭筋を解剖。
踵骨に近い足底筋の腱を切断し、その後完全に腱を削除するには、もう一度それをカット。
スレッドニードルを使用して、目を通って6/0絹糸を添付電子アキレス腱と腱の周りトリプル結び目を作る。
結び目に近い力変換器を配置し、腱の遠位部をカットし、絹糸を使用して力変換器に取り付けます。
上腕三頭筋の下腿筋の筋膜の下にステンレス鋼線の2つの長さを挿入します。これらの配線は、筋電図記録用外ACアンプに接続されています。
2バイポーラフック電極上に総腓骨神経と脛骨神経を置きます。
陽極は周辺の筋肉に触れると、フック電極の陰極上トライセップス·下腿の神経を置きます。
分離ユニットにすべての刺激電極を接続する。
脊髄背電位を記録するために外のACアンプに接続されている脊髄の後面には、ボール電極を配置します。背中の筋肉と接触したAg / AgCl参照電極を配置します。

12。ステップ十二

上腕三頭筋の下腿の神経を刺激する最大収縮振幅が観察されるまで、低周波（<1 Hz）での増加強度の50μsecの方形パルスを使用しています。ゆっくり収縮の振幅が最大に達するまで攣縮反応の振幅を監視しながら、筋肉をストレッチする力変換器を移動します。

13。運動ニューロンの細胞内記録

この時点から、標準的な電気生理学的手法、細胞内電極を準備脊髄ニューロンを貫通し、運動ニューロンとしてそれを識別するために使用されます。

ピペットプラー（P-97マイクロピペットプラー、サッターInstruments）を用いて約1μmの先端にガラスマイクロピペットを引き抜きます。 KClの3M溶液（MΩ電極10から20までの抵抗）で電極を埋める。
マイクロポジショナーを使用して、脊髄に細胞内のアンプに接続し、マイクロピペットを、（Axoclamp 2B、アクソン·インスツルメンツ）を駆動する。 eの刺激によって誘発される局所電場電位を監視ACHは神経トライセップス·下腿のモータープールを検索する。
微小電極の抵抗を監視しながら、推定上の運動ニューロンを慎重に近づく。膜に押し付けたときに、抵抗が増加します。浸透はいつか細胞内のアンプの "バズ"機能を使用することにより容易に行うことができる。

14。安楽死手順

実験の最後に、動物を断頭続いペントバルビタールの過剰投与（210 mg / kgをIV）によって安楽死させています。