ゼブラフィッシュ胚骨格筋のレーザー招いた傷害

Cécile Otten; Salim Abdelilah-Seyfried

doi:10.3791/4351

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要約
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要約

ここで紹介する方法は、高エネルギーのレーザーパルスと時間でこれらの損傷とその回復のその後の分析でライブゼブラフィッシュ胚の正確な傷害を含む。我々はまた、遺伝的に単一標識又は骨格筋細胞のグループが中に、レーザー光誘起損傷後に追跡することができる方法を示しています。

要約

様々な実験的アプローチがmyotoxin注射（ブピバカイン、心臓毒性またはnotexin）、筋移植（除神経·脈管切除再生を誘導した）、激しい運動ではなく、ネズミ筋ジストロフィーのモデルを含む、筋肉の再生を研究することを目的として筋損傷を誘発するためにマウスに使用されてきたmdxマウス（これらの方法の見直しのための^1を参照）など。ゼブラフィッシュでは、遺伝学的アプローチは、筋ジストロフィーの表現型（例えばrunzel ²またはsapje ³など）を展示し、筋ジストロフィーに関連する遺伝子の発現^をブロック⁴オリゴヌクレオチド、アンチセンスモルフォ変異株が挙げられる。加えて、化学的アプローチは、それによって最終的に筋ジストロフィー⁵につながるhypercontraction、その結果、また、ガランタミン、化学阻害する化合物とアセチルコリンエステラーゼなどが可能です。しかし、遺伝的および薬理学的アプローチグラム物理的に与えた傷害の程度がより簡単に空間的にも時間的に制御されているのに対し^、1 enerally、個々の内のすべての筋肉に影響を与えます。ローカライズされた物理的な損傷は、内部統制として、反対の筋肉の評価を可能にする。別のグループは最近、非常に局所的に個々の胚ゼブラフィッシュの筋肉の細胞膜にダメージを与える二光子レーザー（822 nm）での使用を報告しながら、実際、我々は最近、ゼブラフィッシュ胚⁶に骨格筋の再生を研究するためにレーザーを介する細胞アブレーションを使用細胞^7。

ここでは、ゼブラフィッシュ胚における骨格筋細胞傷害に対してmicropointレーザー（アンドールテクノロジー）を使用する方法について検討する。 micropointレーザーは435 nmの波長での標的細胞の切除に適している高エネルギーのレーザーです。レーザー顕微鏡を同時にfで使用できるような方法で顕微鏡（我々のセットアップで、ツァイスの光学顕微鏡）に接続されているまたは試料上および創傷（明視野、蛍光）の効果を可視化するためのレーザー光を当てた。レーザーパルスを制御するためのパラメータは、波長、強度、パルス数を含む。

その透明性と外部の胚発生に起因して、ゼブラフィッシュ胚では、レーザ誘起損傷の両方のためとその後の回復を研究するために非常に適しています。 1〜2日後の受精、体節、骨格筋細胞が徐々にテール^8,9にトランクから体節形成の進行による後方から前方に成熟する。これらの段階で、胚は、自発的にけいれんや水泳を開始します。ゼブラフィッシュは、最近、組織再生の研究のための重要な脊椎動物のモデル生物として認識されている、組織のように多くの種類（心臓、神経、血管など）が成人ゼブラフィッシュ^10、11の損傷後に再生することができる。

プロトコル

1。単一細胞を標識

β-アクチンプロモーターの制御下でGFPをコードするプラスミドまたは他のGFP融合タンパク質と1細胞期胚を注入します。開発中に、GFPはその後モザイク様式で発現されています。 、β-アクチンプロモーターの制御下にα-アクチニン-GFP融合タンパク質を置きます：ここでは、トランスジェニック構築TG [α-アクチニン-GFPのβ-アクチン ]を使用していました。

2。胚の埋め込み

ゼブラフィッシュ胚を採取し、28 HPF（ステージングが¹²による）まで、通常の条件下で維持します。
鉗子（デュモン＃5）と実体顕微鏡下で胚Dechorionate。
ワセリンリング付き顕微鏡スライドを準備します。
E3の培地で1％低融点アガロース/ 10％tricaine溶液を調製：液体および均質アガロース溶液を得るために10ミリリットルのE3溶液中で沸騰100mgのアガロース、アリコートとストアさらに使用するために-20℃で未使用のアガロース溶液。すぐに使用するときは、ゆでたソリューションが冷えるとmaxで維持することができます。 39℃ 10パーセントtricaineの最終濃度を得るためにtricaine原液を追加します。 tricaineとアガロースの両方が胚の動きを防ぐために必要です。
胚が側に自然に敷設して、ワセリンリング内の1％低融点アガロース/ 10％tricaine / E3の媒体における単一胚を埋め込む。優しくだけの場所で胚を維持し、凸を避けるためにカバーガラスで覆う光を壊してしまう表面。理想的には、ターゲットとなる胚筋組織は、カバーガラスに触れるべき。

3。胚レーザー負傷

micropointレーザーと顕微鏡を準備します。
1. 顕微鏡と組み合わせて設定し、レーザーを使用する方法の詳細についてはmicropointレーザーマニュアルを参照してください。
2. 正しいを選択435 nmの波長のレーザ光を生成するための染料。
3. 減衰スライダを使って、レーザーパワーを調整します。レーザーパワーは、単一パルス（これをテストするサンプルのカバーガラス上などフォーカス）でガラス表面を壊すに十分な強さがあります。これは、細胞アブレーションに必要なレーザーパワーである。
顕微鏡の接眼レンズに搭載されたレチクルを用いて関心領域またはセルにフォーカス。 20倍の対物レンズを（40Xより正確なダメージが可能になりますが、多くの場合、作動距離がこのレンズのために十分ではありません）を使用します。

注1：レーザーが唯一の焦点面内の細胞を傷つけることなく、上記のセルとレーザービーム内にある下にはありません。レーザーが最適に設定し、z軸内の最大の焦点に合わせて調整されていることを実験前に確認してください。どのセルを知るために、実験を行う前に、レーザー損傷の深さを決定するのが最善ですsは正確に怪我をされます。

蛍光標識された細胞を標的とした場合、通常の使用のために、明や蛍光：実験を視覚化するために必要な光を設定します。
けがの所望の程度に応じて対象地域、またはいくつかのパルスにレーザ光のパルスを送信します。

4。傷つけおよびリカバリの分析

必要に応じて、レーザー損傷の手順は、ライブ（ 例えば Metamorphソフトウェアのストリーム取得オプションを使用して^）6を記録することができます
すぐに負傷した後、胚はピンセットでアガロースから優しく除去し、回復のために卵水に戻さなければなりません。

注2：筋活動は、（水泳やけいれん）骨格筋の回復のために特に重要です。胚がtricaine曝露と硬いアガロース埋め込みのために移動することはできませんので、recommeないあまりにも長い間、スライドとカバーガラスの間に胚を維持するために又、作業。

示されるように、回復した後、胚は、光、蛍光または共焦点顕微鏡によって固定されており、必要に応じて分析することができます。