用ピギーバックMultibarrel電極の製造と使用<emインビボ&gt;</em神経反応の&gt;薬理マニピュレーション

要約

細胞外の間に神経アゴニストおよびアンタゴニストのイオントフォレー録音は、ニューロンの微小環境を操作するための強力な手段です。これらの操作は、最も容易にピギーバックmultibarrel電極を介して行うことができます。ここでは、それらを製造および聴覚の録音中にそれらを使用する方法について説明します。

要約

単一ニューロンからin vivoでの録音では 、調査員が感覚刺激に応答して、例えば、ニューロンの発火特性を調べることができます。ニューロンは、通常、相互に統合複数の興奮性と抑制性の求心性および/または遠心性入力を受信し、ニューロンの究極の測定された応答特性は、これらの入力の神経統合によって駆動される。神経系の情報処理を勉強するためには、ニューロンや神経系への様々な入力を理解することが必要であり、これらの入力の特定のプロパティ。与えられたニューロンが受信している特定の入力の機能的役割を評価するための強力かつ技術的に比較的単純な方法は、動的かつ可逆的にこれらの入力を抑制または排除することであり、この操作によって生じるニューロンの出力の変化を測定する。これは、薬理学的にピギーバックmultibarrelあるelectrとニューロンの身近な環境を変化させることによって達成することができるオード。これらの電極は、シングルバレル記録電極と4種類のシナプスのアゴニストまたはアンタゴニストまで運ぶことができるmultibarrel薬の電極で構成されています。薬理作用のある物質は、時間制御された送達とシナプス入力の可逆的再構成を可能にする、実験の間に望ましい時間にイオン泳動適用することができます。このように、微小環境の薬理学的操作は、神経回路の機能に関する具体的な仮説をテストするための強力な、比類のないメソッドを表します。

ここでは、ピギーバック電極が製造されている方法を説明し、そしてどのようにそれらはin vivo実験の際に使用されます。ピギーバックシステムは、治験責任医師がmultibarrel薬の電極を任意のプロパティ（抵抗、チップの大きさ、形状等）のシングルバレル記録電極を組み合わせることができます。これは、すべての樽は、多かれ少なかれ似たような形や性質を持っている標準的なマルチ電極上の主要な利点です。 Multibarrel電子lectrodesは最初、40年以上前の^1月3日に導入された、とピギーバックタイプは1980年に導入された^4,5まで設計改良^2,3の数を受けています。ここでは、最小限の損傷を引き起こす比較的薄い電極軸に起因するインビボ動物製剤で無傷の脳深部への浸透を可能にピギーバック電極の実験室での生産において重要な改善点のセットを提示。さらに、これらの電極は、低ノイズの録音を特徴とし、所望の薬理作用物質の非常に効果的なイオントフォレーシス用低抵抗薬物バレルを持っています。

プロトコル

1. ガラス電極を引く

   ガラス電極を引く
   1. シングルバレル電極を引き出します。フィラメントとキャピラリーシングルバレルガラスを使用して測定されるように約1〜2メートル、10〜12 mmのシャフトの長さ、約12 Mohmを（範囲5月20日Mオーム）の対応する電極抵抗の直径に先端を引っ張る0.9％NaCl溶液インチ下部電極抵抗はもっと背景活動になると個々のニューロンから単一の活動を単離するため、より困難になります。この電極を引っ張るため、加熱フィラメントまたは加熱コイルのいずれかで水平または垂直プラーのいずれかを使用します。
   2. multibarrel電極を引き出します。multibarrelガラスのはるかに大きな直径と全体multibarrel周りに均等な熱分布の必要性のために、より大きな直径の加熱コイルではなく、加熱フィラメントとの強力な引き手が必要とされている。 multibarrelピペットはnで加熱フィラメントの中心に挿入しなければならないoは、加熱コイルにご連絡ください。ほかに5バレルピペットは、ここで説明することに注意し、3バレルまたは7バレルピペットは、市販の選択肢です。約10マイクロメートル径の合計、以下のピペットの先端にガラスを引き出します。先端が次のステップで正しい直径に壊れていますので、正確なサイズのチップは長く、比較的薄くすべきである電極先端の全体の形状、より引き上げ工程中にそれほど重要ではありません。所望の電極先端形状については、 図1Cに画像を参照してください。非常に長くて細い電極形状（ 図1A）が曲がってしまい、したがって、それは難しい正しいに電極チップを壊すことになりますが、短いと太くて短い電極形状（ 図1B）は 、脳内に進め、組織の損傷のかなりの量が発生します直径（ステップ2を参照）。

2. 電極チップを修正

   電極チップを変更します。 2つの電極が一緒に接着する前に、、彼らが変更されなければならない。単一電極のシャフトは、それが完成したピギーバック電極の複合シャフトはできるだけ薄くあることを確認するためにmultibarrelに取り付けることができる前に曲げることが必要です。さらに、multibarrel電極の先端はイオントフォレーシス用低抵抗を確保するために破談にする必要があります。
   1. 約20度で、シングルバレル電極のシャフトを曲げてください。可能な限り最小のブンゼンバーナーの炎を使用してください。標準ラボ供給会社からの典型的な "小さな"ブンゼンバーナーは、このアプリケーションのためにはるかに大きすぎる炎のサイズを作成します。この問題を回避するには、最小の商業ブンゼンバーナーを使用して、バーナーの上部に注射針を（〜18ゲージ）を確保し、歯科用セメントを使用して接続をシールします。動作させた場合、火炎は、直径が5mm以下程度であり、背の高い約8mm、参照してくださいすることは困難である必要があります。部屋の中の空気の動きはその炎を消すので、それは内にバーナーを操作することをお勧めします密閉された部屋や、風の盾を使用する。約20度でそれを曲げるために炎を介して単一のバレルの電極を移動します。バーナーの炎が離れて電極先端から約10ミリメートルでの遷移領域でガラスを溶融することを目指している。先端が下向き、我々は電極が約45度で開催されることを示唆している電極の先端を溶融回避し、比較的早く炎を介して電極を移動します。
   2. multibarrel電極の先端を折ります。電極先端を破壊しながら視覚的なコントロール性を確保するために、最小の10倍の対物レンズと10倍の接眼レンズと顕微鏡を使用しています。眼球に挿入さ測定スケールもチップサイズを測定するために必要とされる。プレキシガラスの端が顕微鏡の視野の半分に約3分の1に見られるような顕微鏡にプレキシガラスの部分を取り付けます。我々のケースでは、プレキシガラス片は25×70 mm、厚さとカ​​スタムに確保できるねじを介して接続されている約5mmである顕微鏡ステージでスレッドを作った。それは、プレキシガラスは独立スライドの移動を可能にする設計を持つことが重要です。スライドガラス上の粘土の床でmultibarrel電極を置き、顕微鏡ステージのスライドホルダーに電極を含むスライドを挿入します。顕微鏡ステージのXYマニピュレータを使用して、静かにプレキシガラスピースに対する電極チップを移動させ、顕微鏡の接眼レンズを通して先端の破壊を観察します。きれいに約25から35マイクロメートルの累積径にmultibarrelの先端を破るしようとします。でこぼこの休憩では大きすぎる、またはヒントを絶った先端径のピペットを破棄します。我々は、望ましくない先端形状に起因する当社multibarrel電極の約30％を捨ててください。

3. ピギーバック電極を組み立てる

   ピギーバック電極を組み立てます。
   1. 位置電極は。顕微鏡ステージからステップ2.2で使用プレキシガラスピースを削除します。完了確保スライドガラス上に粘土にmultibarrel電極、若干上向きの先端。上向き、ステップ3.2、2つの電極の接着のために重要であろう。上向きのヒントは接着剤が接着電極チップを避けて、先端から離れて実行させる。カスタムメイドのマイクロマニピュレータ（ 図2）の電極ホルダに曲がったシングルバレル電極を挿入します。 multibarrel電極の上にシングルバレル電極を下げ、まず視覚的なガイダンスを使用して、次に顕微鏡指導。単一電極は約5〜10マイクロメートルでmultibarrelチップの先端を突き出し、その先端で、5バレルの配置によって形成された溝に直接引き下げるべきである。シングルバレルを下げる際に、密接に二つの電極の間に形成される角度を観察します。最善の結果のためのヒントがバラバラ互いに指すのではなく、その先端と完全に平行あるいはマルチの上に単一の電極を低くしようとする任意の角度を避ける非常にわずかな "くさび"配置を形成する第1 multibarrelに触れる。シングルバレル先端は非常に柔軟であるので、それは先端がマルチバレル電極の上面に達した後、単一の電極を内蔵バネ作用量が少ないクリーンな複合チップを形成、さらに少し低下したときに曲がりますそれは一緒にヒントを保持するのに役立ちます。ただし、単一のバレルとmultibarrel電極との間の角度が急峻すぎる場合（くさびのあまり）、バネ作用が高くなりすぎると電極配置を下向きに曲がります。
   2. 結び付ける電極シャフト。のり一緒に2つの電極のシャフトを使用してシアノアクリレート（瞬間接着剤）。グルー·ドロップフラットつまようじとタッチ電極アセンブリの小さな側へ接着剤の小滴を配置します。ヒントの最も遠位の位置から開始し、徐々に電極先端に向かって極軸に沿って接着剤のドロップとつまようじを移動します。あまりにも多くの接着剤を使用して、または糊トンを適用電極チップにオブジェクト指向に近い、少なくとも部分的に機能しない電極をレンダリング、接着電極の開口部をもたらすでしょう。
   3. 歯科用セメントとの合弁安定させる。小さな使い捨てのプラスチック製の皿の中に歯科用セメントと歯科用アクリル少量のミックスやフラットつまようじを使用して、ボートの重量を量る。セメントは成形可能になるまで待ってから、ジョイント（ 図3のピンクの材料）を安定化するために2つの電極間の接合部に少量を適用します。約15分間乾燥させます。
   4. 電極を取り外し、保管してください。慎重完了ピギーバックマニピュレーターホルダーから第1電極を除去した後、スライドガラス、及び防塵容器内のストアから切り離す。

4. 電極塗りつぶし溶液を調製

   電極フィル溶液を調製する。イオントフォレーシスは、荷電分子を必要とするので、ほとんどのエージェントは、通常、酸性またはアルカリ性の環境（のどちらかで溶解しなければならないそれぞれtaは、約3から4のpH、または約8-10のpH）。多くの場合、イオントフォレーシスで使用されている化学物質の数は、 表1に記載されています。表に記載されていないエージェントの場合、それは分子が帯電した保つために、酸性またはアルカリ性の環境で分子を使った方が簡単な場合、それに応じて溶解するであろうかどうか、pKa値から決定する。最良の結果を得るには、毎日新鮮なすべてのソリューションを混ぜる。

5. 記入し、電極を準備

   記入し、電極を準備します。シリンジフィルターとシリンジに取り付けられた34ゲージの針 - ちょうど電極を使用する前に、炭素繊維28を用いて、それぞれの薬剤と各バレルを埋戻し。バランスバレルとして選択薬と5-バレル構成の4アウターバレル、および3M NaClを中心バレルを記入してください。同様に、3M NaClでシングルバレル記録電極を埋める。そのような速いグリーンまたはフェノールレッドとして、NaCl溶液に色素を追加すると、それが簡単に電極チップを見ることになります脳表面に電極の配置中。録画設定の電極ホルダーに電極を挿入し、適切なガラスバレルにすべてのワイヤを挿入します。断熱材の約1cmの先端に除去された絶縁された銀線を使用しています。 multibarrel電極（4薬物バレルと1バランシングバレル）に加え、記録シングルバレル電極に挿入する必要があるアンプ線用5線があるはずです。

6. イオントフォレーシス用ポンプモジュールの電源をオンに

   イオントフォレーシス用ポンプモジュールの電源をオンにして、すべての樽をテストします。各ポンプモジュールの電極テスト機能は、電極バレルが機能しているかどうかを判断するのに役立ちます。使用しないときは、分子電荷と反対極性の保持電圧を印加する必要があるときにバレルからの薬物の漏出を防止する。

結果

この実験では、グリシン受容体拮抗薬ストリキニーネ塩酸塩は、イオン泳動適用した。通常はグリシン阻害をブロックすると、神経細胞での焼成が増加します。 図4は、応答動物の耳に届け増加強度の正弦波音の刺激に記録された聴覚ニューロンからサ ​​ンプルデータを示しています。この種の実験は、ニューロンの放電率対強度関数と呼ばれます。大きな音は、より高いスパイク率（黒線）となりました。この実験中に使用された初期のイオントフォレーシス電流は15 nAのだった。現在のスイッチがオンにされたとレート強度関数の変化は彼らの新しいレベル（濃い青の曲線）で安定していた、現在の吐出が徐々に45、30に増加し、60 NA（オレンジ、緑、水色の曲線の後それぞれ）。それぞれのケースでは、音の強度の同じ範囲にわたってニューロンの応答はdischaの変更後に記録した電流が安定化した新たな排出に応じてRGE率強度の関数。現在、これらのレベルは、もはや違ったニューロンの応答を変更しないため、この例で使用することは現在の最も適切な排出は45 nAから60 nAのだった。この結果は、45 nAの電流で、そのニューロンのすべてのグリシン受容体が既にストリキニーネ塩酸によってブロックされていたことを示唆している。現在、さらにストリキニーネを解放排出のさらなる増加は、ニューロンの放電レートレベルの機能のさらなる変化をもたらさなかった。プロトコルが完了した後、排出電流がオフになっていた。ベースラインに戻って神経反応の回復は約25分（赤線）後に達成された。これには数秒、数分、数十の間、排出薬剤の種類や量に応じて、時間がかかる場合があります。

薬	濃度	溶液のpH	溶剤	会社	猫。 ＃	典型的な保持電流	典型的なイジェクトカレンツ
GABA	500mMの	3.5から4.0	のdH 2 O	シグマ	-2129	-15 nAの	100 nAから5 nAの
グリシン	100mMの	3.5から4.0	のdH 2 O	シグマ	G-7126	-15 nAの	100 nAから5 nAの
ビククリンのMethiodide	10mMの	3.0	のdH 2 Oで0.165 MのNaCl	シグマ	B-6889	-15 nAの	60 nAから5 nAの
ストリキニーネ塩酸塩	10mMの	3.0	のdH 2 Oで0.165 MのNaCl	シグマ	S-8753	-15 nAの	80 nAから5 nAの
L-グルタミン酸	500mMの	8.0	のdH 2 O	シグマ	G-1251	30 nAの	-10 nAから-150 nAの
L-アスパラギン酸	500mMの	8.0	のdH 2 O	シグマ	- 8949	30 nAの	-10 nAから-150 nAの
カイニン酸	1mMの	9.0	のdH 2 O	シグマ	K-0250	30 nAの	-100 nAから-10NA

溶解し、濃度に対してpHは表1。一般的に使用される薬剤。表は、イオントフォレーシスで使用される最も一般的に使用されるシナプスのアゴニストおよびアンタゴニストを示しています。トンを分極する必要性のためにアカウントを記載されているpH環境ヘセエージェント、および異なる薬剤間の有効性の変動のための提案された濃度を占めています。

図1。異なるチップの長さを持つ3つのmultibarrelピペット：この5バレル電極の先端部が長すぎて、薄い引き出されている。先端が曲がって、非常にソフトであることに注意してください。先端のこのタイプは、所望の直径を破ることは非常に困難です。 B：この電極の先端が短すぎると太くて短いです。深く脳の領域に進出した場合、この電極は、電極はチップ後わずか数ミリメートル比較的厚くなっているという事実に起因する不要な脳の損傷の原因となります。 C：正しく引っ張ら先端を持つ電極の一例。長くて細いながら、先端が依然として堅調であり、所望の先端径を容易に破壊することができます。

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図2。電極マニピュレータアセンブリのデッサン。マニピュレータアセンブリは、ピギーバック電極を組み立てるために顕微鏡と一緒に使用されます。灰色でマークのついた項目は、市販製品であり、 表2に示します。青で表示されているアイテムは、我々の施設のマシンショップでカスタムを機械加工した。彼らは、ニューポートのステージ423ドリル用の穴付き1/4インチのスチール板サイズ43x26 cmのニューポートで提供される穴のパターンに応じて）1、そこにいて、任意の角度で組み立ての傾動を可能にする2）傾斜ステージ、3）トップ並進ステージに電極ホルダーをマウントコネクタ。

図3。サンプルピギーバック電極の写真 。シングルバレル記録エルと一緒に組み立て、完成した5バレルの電極ectrode。脳深部の録音を可能に約7mmの長軸に注意してください。

図4。放出電流の滴。グラフは、動物の耳が様々な強度のトーンで刺激しながら、単一の聴覚ニューロンから記録速度強度の関数を示します。大きな音は、より高い発射速度を引き出す傾向にあった。医薬品申請前に、ニューロンのレート強度関数は、最も低いスパイク率（黒線）を示した。徐々に高く放出電流が徐々に高く発射率で、その結果、神経細胞で次第にグリシン受容体を遮断した。このニューロンの現在の最適な吐出が45から60 nAのだった。これらの放出電流を使用すると、すべてのニューロンのグリシン受容体の完全な閉塞が達成された。実験プロトコルの終了後、イオントフォレーシスは終了し、ニューロンをさせて頂きました回復します。回収率強度の関数は初期プレ薬回復機能にマッチしたときに完全な回復が達成された。 KLUG ら 、1995年から、アメリカ生理学会の許可を得て、再現しました。

ディスカッション

実験操作中に、ニューロンの応答の記録を可能にすると同時に、我々は、in vivoでの単一ニューロンのマイクロ回路の操作を可能にする手法を説明します。神経回路がシナプスのアゴニストおよびアンタゴニストのiontophoreticalアプリケーションを介して操作されます。圧力駆上トフォレーシスの主な利点は、イオントフォレーシスは、神経組織への電極からの流体の物理的な動きを必要としないということです、したがって、印加された圧力や流体体積を通して組織の損傷を引き起こす心配がありません。この手法の主な制限は、組織内の絶対的な薬物濃度、および組織の影響を受けたボリュームに関する情報の欠如である。イオントフォレーシスと排出薬理作用のある物質の量ははるかに小さいですし、圧力排出よりもはるかに正確に制御できるので、しかし、、薬物アプリケーションからの回復がはるかに速く、典型的にはdははるかに完全な。 Microiontophoresisが正常神経系、感覚と他人の数が使用されており、ほとんど、あるいはまったく本質的な処理をする脳領域で最も正常に適用されています。その理由は、排出薬剤のいくつかが適用部位から隣接ニューロンに拡散し、また、隣接ニューロンの応答特性を操作することができるということです。

シングルおよびマルチバレル電極の別の製造は任意と無関係のプロパティを持つ電極の組み合わせを可能にします。一緒に電極バレルを引っ張ってくるとイオントフォレーシスの目的のために記録し、いくつかのいくつかを使用すると、電極の先端が、いずれかの薬物のアプリケーションに対して単一細胞記録には大きすぎる、または小さすぎるであろうと、このような非常に類似の特性を有する電極チップを生産するでしょう。また、単一のバレル先端を持つことは約20マイクロメートルでmultibarrel電極先端を越えては大きく、録音でノイズを低減dは、ニューロンの発火³の保持または放出電流から可能交絡電流の影響を排除します。

ピギーバックmultibarrel電極は第^4月6日 30年以上前に記載されており、神経回路^{7から18 19から29を}解剖することは非常に成功裏に使用されていることにより、 それ自体の方法は小説やユニークではありません。しかし、電極の調製および使用の特定の詳細は、長年にわたって変更されており、ここで説明する一連の指示は、特に簡単で成功することが証明されていて、他の場所で文献に詳細に公開されていません。シングルバレルの突出であり、特に、シングルバレル電極先端の曲がりは、ピギーバックの最後のヒントは比較的スリムされる電極（ 図3）、その結果、脳への最小限のダメージとの深い核からの録音を可能にすることができますマルチバレル電極上に電極は、事実上すべてのカレンを削除しばしば技術³の欠点として挙げられトン効果。新しい詳細は、電極チップ接着プロセスの間に上向きとピギーバック電極を製造する際にmultibarrel電極の溝内の単一のバレルは高い成功率を保証します休憩を持つものとしてここに提示した。技術は比較的簡単で、通常は数日以内に初心者でマスターすることができます。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
項目名	メーカー	コメント	猫。 ＃
ブンゼンバーナー		からの利用 ：VWR	17928-027
二成分歯科用セメント： "低温硬化"歯科材料	共同経口-ITE歯科製作所株式会社	からの利用 ：午前システムズ株式会社	525000
二成分歯科用セメント：義歯材料の架橋液状化合物	共同経口-ITE歯科製作所株式会社	からの利用 ：午前システムズ株式会社	525000
液体のり	ヘンケル	スーパー接着剤ロックタイト： から入手可能	01-06849
マイクロイオントフォレーシスアンそれ：Neurophore BH-2	ハーバード装置	ハーバード装置： から利用可能	65から0200＆65から0203
絶縁された銀線	AM-システム	AM-システム： から利用可能	785500
水平プラー	ツァイツDMZ-ユニバーサルプラー	自動化科学： から入手できる	NA
マイクロマニピュレータピース：電極ホルダー	WPI	からの利用 ：WPI	M3301EH
マイクロマニピュレータピース：リニアステージ	ニューポートの423シリーズ	ニューポート： から利用可能	423
マイクロマニピュレータピース：回転ステージ	ニューポートのRSP-2	からの利用 ：ニューポート	RSP-2
マイクロマニピュレータピース：Z変換	ニューポートの433シリーズ	ニューポート： から利用可能	433
マイクロマニピュレータピース：Zとxy軸を組み立てるためのアングルブラケット90°	ニューポート360から90	ニューポート： から利用可能	360から90
マイクロマニピュレータピース：X変換/リニアステージ	ニューポートの423シリーズ	ニューポート： から利用可能	423
マイクロマニピュレータの作品：Y変換/リニアステージ	ニューポート423	シリーズニューポート： から利用可能	423
顕微鏡	ライツLaborlux 11
顕微鏡：対物	10倍ライツウェッツラー、NAは0.25		519760
顕微鏡：eypieces	ライツウェッツラー、Periplan 10x/18		519748
顕微鏡：ステージ	ライツウェッツラー		513544
キャピラリーMultibarrel	N / A	からの利用 ：午前システム株式会社	612000
Sinlgeバレルキャピラリー（GC 150F-10）	ハーバード装置	ハーバード装置： から利用可能	30から0057
垂直プラー	ナリシゲモデルPE-2
		マイクロマニピュレーター（光Bのマークされたカスタムメイドの要素図1のLUE）
鋼板
傾斜基盤
電極ホルダー用アタッチメント
		表2の手順で使用されるすべての機器および消耗品のメーカーと項目番号。