RNA-seqのトロンビン処理におけるトランスクリプトームの解析と制御ヒト肺微小血管内皮細胞

Dilyara Cheranova; Margaret Gibson; Suman Chaudhary; Li Qin Zhang; Daniel P. Heruth; Dmitry N. Grigoryev; Shui Qing Ye

doi:10.3791/4393

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Method Article

RNA-seqのトロンビン処理におけるトランスクリプトームの解析と制御ヒト肺微小血管内皮細胞

DOI:

10.3791/4393

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February 13th, 2013

Dilyara Cheranova¹, Margaret Gibson¹, Suman Chaudhary¹, Li Qin Zhang¹, Daniel P. Heruth¹, Dmitry N. Grigoryev¹, Shui Qing Ye¹

¹Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

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要約

このプロトコルは、トロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞にトランスクリプトームのプロファイルへのRNA-seqの、強力な次世代DNAシーケンシング技術を適用するための完全かつ詳細な手順を示します。このプロトコルは、異なる試薬又は病気の状態によって影響を受ける様々な細胞や組織に一般化できる。

要約

mRNAレベルの測定を介して細胞内での遺伝子発現の特性は、細胞の転写機構を外部信号（ 例えば、薬物治療）、またはどのように細胞が健康な状態と病気の状態の間で異なることによりどのような影響を受けるかを決定するのに有用なツールです。次世代DNAシーケンシング技術の出現と連続洗練された、RNAシーケンシング（RNA-seq）は、転写物の全ての種をカタログ化するすべての発現している遺伝子の転写構造を決定するために、定量化するトランスクリプトーム解析のますます普及している方法となっている与えられた細胞、組織または生物^1,2における転写産物の全体集合の変化の発現レベル。 RNA-seqは徐々にそれが完全なトランスクリプトームのプロファイリングの利点を持っているので、トランスクリプトーム解析のための好ましい方法として、DNAマイクロアレイを交換するデジタルdatum型（任意の転写物のコピー数）を提供すると、任意の既知のゲノムシーケンシャルに頼っていませんCE ^3。

ここでは、トロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞のトランスクリプトームのプロファイルへのRNA-seqを適用するための完全かつ詳細なプロトコルを提示。このプロトコルは、と題する我々の最近発表された研究に基づいている我々は正常ヒト肺微小血管内皮細胞の最初の完全なトランスクリプトーム解析を行っている⁴ "RNA-seqはトロンビンで処理したヒト肺微小血管内皮細胞における遺伝子およびそのアイソフォームの新規トランスクリプトームを明らかにする" RNA-seqを使用してトロンビンで処理した。これは、炎症状態、癌、糖尿病、冠状動脈性心臓病の病因におけるトロンビン媒介内皮機能不全の分子機構についての洞察を得るためにさらなる実験のための前例のない資源をもたらし、これらの疾患に対する治療ターゲットの潜在的な新規のリードを提供しています。

このプロトコルの記述テキスト4つの部分に分かれています。最初の部分は、トロンビンおよびRNAの単離、品質分析と定量化したヒト肺微小血管内皮細胞の治療について説明しています。第二部では、ライブラリーの構築およびシーケンシングを説明しています。第三部は、データ分析を説明しています。 4番目の部分は、RT-PCR検証アッセイを記載する。いくつかの重要な手順の代表的な結果が表示されます。重要なステップでの成功を後押しするための有用なヒントや注意事項は、ディスカッション·セクションで提供されています。このプロトコルはトロンビンで処理したヒト肺微小血管内皮細胞を使用していますが、それは哺乳類と非哺乳類細胞の両方で、さまざまな刺激または阻害剤で処理した組織内のプロファイル·トランスクリプトームに一般化することができる、または健康状態の間の細胞または組織にトランスクリプトームを比較する疾病状態。

プロトコル

このプロトコルを概説するフローチャートを図1に表示されます。

1。トロンビン、RNA単離、RNAの品質評価と定量で細胞を処理する

5％のFBS、成長因子および抗生物質によるEGM-2培地で6ウェルプレートで90〜100％コンフルエントまで培養ヒト肺微小血管内皮細胞（HMVEC-LBL）（Lonza社、カタログ番号CC-3202）。
飢餓·メディア（0％FBS）を30分トロンビンによる治療に先立って、メディアを変更してください。
0.05 U / mlのトロンビンを用いて細胞を治療したり、℃、5％CO _2、37℃で6時間のコントロールとして未処理のままにしておきます。
メーカーの指示に従ってアンビオンミールヴァナキットを使用して処理した細胞および対照細胞から全RNAを単離する。
Experionの自動電気泳動Station上の標準プロトコルに従ってExperionのStdSense真核生物RNAチップを搭載したRNAの品質を評価する（= "_blank"> www.bio-rad.com）。
標準分光光度法を用いてRNAを定量化する。

2。ライブラリーの構築とシーケン

出発原料として、サンプルあたり高品質のtotal RNA 1μgを使用します。
ライブラリーを構築するために、イルミナ（プロトコル＃15008136 Rev. A翻訳版）からの標準的な手順に従ってください。このプロトコルでは、ポリ2ラウンドの（）を含むmRNAの選択は、rRNAの塩基配列決定を最小限に抑えるためにrRNAを除去するために行われている。
Experionの自動電気泳動駅（上の標準プロトコルに従ってExperionのDNAを1Kチップを使用してライブラリの品質評価www.bio-rad.comを）。
定量PCRを使用してライブラリを定量化：以前に標準曲線とライゲーションアダプターに特異的なプライマーとして、配列決定されたライブラリを使用してください。未知のライブラリ（ すなわち 1:100、1:500および1:1000）の希釈液の範囲を使用します。 qPCRにアコを実行SyberGreen MMプロトコルにrding、各ライブラリの元の原液濃度を計算します。
クラスタフローセルへの準備が整うまで、-20℃で10 nMおよびストアにライブラリの株式を希釈します。
ときに、クラスタフローセルをする準備ができて、水浴中CBOT試薬プレートを解凍します。 CBOTは、クラスタの生成プロセスを合理化するために使用されるイルミナ楽器です。
CBOT楽器を洗う。
ライブラリを変性：13μlの1×TEと6μlの10μMのライブラリを組み合わせると、チューブの側面に、1μlの1NのNaOHを（イルミナ社によって提供される）を追加します。渦は、スピンダウンし、室温で5分間インキュベートし、氷上で変性したライブラリを配置。
ライブラリを希釈：12 PMの最終濃度996μlのHT1と4μlの変性ライブラリを組み合わせることにより予冷ハイブリダイゼーション緩衝液（HT1、イルミナによって提供される）で変性したライブラリを希釈します。氷上の変性および希薄化ライブラリを配置します。
、CBOTプレートの管のそれぞれの行を反転すべての試薬は融解していることを保証します。プレートをスピンダウンし、/パンク箔シールを取り外して、CBOTにロード。
ストリップチューブに希釈し、変性したライブラリのアリコートを120μlは、1から8までのラベルが付いた。制御スパイクのように各試験管に1.2μlの希釈、変性PHIX制御ライブラリ（イルミナ）を追加します。ボルテックスし、チューブをスピンダウンして、正しい向きでCBOT（右にチューブ＃1）上にロードします。
CBOTにフローセルとマニホールドをロードします。
フローチェックを完了し、クラスタリングの実行を開始します。
実行が完了したら、すべてのレーンを横切っ試薬送達を確認してください。異常をメモしておきます。どちら4℃で直ちにシーケン実行を開始またはチューブ中でフローセルを保存
シーケンシング合成による（SBS、イルミナ）の試薬を解凍します。
切断ミックスに触れた後、他の試薬に触れないように確認しながら、試薬トレイ上の適切な箇所に試薬をロードします。
NOを使用N-シークエンスフローセル（ つまり以前に配列決定した1）、プライム試薬ラインを2回押します。
70％エタノールとレンズペーパーに続いて70％エタノールとキムワイプとシーケンスフローセルを、徹底的に清掃してください。どんなスジ用フローセルを点検してください。必要に応じて再清掃してください。
シーケンサーにフローセルをロードして、マニホールドとフローセルの間のシールがタイトであることを保証するためにチェックフローを実行します。
シーケンスの実行を開始します。
彼らは実行時に利用可能になると品質メトリクス（クラスタの密度を例えば 、フィルタを通過するクラスタ、Q30、強度）を評価する。
ラン全体で強度を監視します。
101サイクルが完了すると、2番目の読み出し完了するターンアラウンド化学を実行します。ペアリングエンド試薬及び第2のリード定款バッファ（ICBは、SBSの試薬の成分、イルミナ）を解凍し、試薬をロードします。
第2 ^回は、強度、Q30読ん評価、シーケン実行を継続ランの進行状況としてND他の品質メトリクス。

3。データ解析

ベースコール·ファイル（。BCL）ファイルに変換するCASAVAの最新バージョン（イルミナ、現在は1.8.2）を使用します。fastqファイルは、各サンプルのシングルfastqファイルの作成を確実にするために0にfastq-クラスタカウントを設定する。下流解析用fastqファイルを解凍します。
超高スループット短い読み取りのアライナ（ボウタイ^{、0.12.7）6}およびSAMtools（0.1を用いて哺乳動物サイズのゲノムを読み取ったRNA-seqを揃えトップハットの最新バージョン^{（1.4.1）5を}使用^してペアリング終了アライメントを実行します。 ^17）7。 SAMtoolsは、SAM形式で後処理アライメントを行なうための各種ユーティリティが実装されています。参照ヒトトランスクリプトームはiGenomes（からダウンロードすることができますwww.illumina.com ）。トップハットを実行している、我々はFR-unstranded（デフォルト）などのライブラリ·タイプ·オプションを含む、すべてのデフォルトのパラメータ設定を使用していました。
私達⁸ソフトウェアパッケージプログラムCuffDiff、カフスの部分（1.3.0）ING、人間の基準に基づいて、トランスクリプトーム、前者で差次的に発現する遺伝子の転写産物を選別するためのコントロール細胞にトロンビン処理した細胞を比較します。この比較は、既知の転写産物の発現差を検出します。表形式で結果を可視化するには、Microsoft Excelを使用します。カフス·プログラムを実行して、我々は、すべてのデフォルトパラメータの設定を使用しました。 FPKMとのそれらの遺伝子転写産物は<0.05、P> 0.05は除外されます。
小説アイソフォームを検出するために、基準のトランスクリプトームなしでカフスを実行します。 Cuffcompareを使用して、リファレンスゲノムにサンプルトランスクリプト·ファイルを比較し、1分析用リファレンスゲノムと第二の分析のための基準ゲノムとして合成制御トランスクリプトファイルとして結合されたトロンビントランスクリプト·ファイルを使用してCuffdiffを備えた差動式をテストします。表形式で結果を可視化するには、Microsoft Excelを使用します。再び、thosの電子遺伝子転写FPKMと<0.05およびp> 0.05は除外されます。このステップの後、捜査官は、UCSCゲノムブラウザのホームページ（に新たに報告された成績証明書のリストをアップロードすることを選ぶことができhttp://genome.ucsc.edu/手動検査によりその妥当性を確認するため）。
工夫パスウェイ解析（IPAに発現差のある遺伝子のリストを提出www.ingenuity.comトロンビン処理によって影響を受ける遺伝子および経路の特徴づけのために）。このステップでは、捜査官は、カマーバンド（使用することを選ぶかもしれhttp://compbio.mit.edu/cummeRbund/視覚化、管理を支援するために）、カフス、RNA-seqの出力を分析する作業を支援し、簡素化するように設計されているRパッケージを、とCuffdiff分析によって生成されたデータのすべてを統合します。

4。定量的リアルタイムリポによるRNA-seqの結果の検証lymerase連鎖反応（QRT-PCR）

制御およびトロンビン処理HMVEC-LBLセル、ステップ1.6から1.4に記載されたRNAの品質評価およびRNA定量からのtotal RNA抽出を行います。
メーカーの指示（インビトロジェン社、18080から051）に続いてのSuperScript IIIファーストストランド合成システムRTのキットと、各サンプル1μgの全RNAから相補的DNAを生成します。
CUGBP、Elav-likefamilymember1（CELF1、Hs00198069_m1）、Fanconianemia、complementationgroupD2（FANDCD2、Hs00276992_m1）、TNFreceptorの検出のためのTaqmanアッセイオンデマンドに設計されたオリゴヌクレオチドを用いて、Applied Biosystemsの第VIIa 7リアルタイムPCRシステムで定量RT-PCR解析を実行関連因子1（TRAF1、Hs01090170_m1）、およびβ-アクチン（ACTB、Hs99999903_m1）。各サンプルは、トータルRNAの5 ngに相当するテンプレートを持っていた。 DDCt法を用いて定量を測定し、β-アクチンに正規化する。各アッセイは複製され、少なくとも3生物を越えて行った。