成長中の軸索に沿ってマウスのシュワン細胞の発達を分析する

要約

ここでは、SCが伸びる軸索に沿って開発することができますているシュワン細胞（SC）の遊走アッセイを記述します。

要約

末梢神経の開発は魅力的なプロセスです。ニューロンはヒトで100以上の30cm離れニューロンの細胞体からしばしば具体的な目標を、支配する軸索を送る。開発中の神経細胞の生存は、対象由来成長因子でなく、シュワン細胞（SCS）のサポートに依存します。この目的を達成するために神経細胞体の地域（または中枢から末梢神経系への移行）のSC ensheath軸索シナプスや神経筋接合部へ。シュワン細胞は神経堤の誘導体であり、全体の軸索は、SCSで覆われるまで、新興の軸索に沿って前駆体として移行されます。これは、末梢神経系の開発のためのSCの移行の重要性を示しており、このプロセスを調査する必要性を強調している。 SCの発展を分析するために、設定も移行のためのそれらの生理学的基質、軸索を含むSCの隣に必要とされる。子宮内の開発によるハツカネズミ ）のような胎盤の脊椎動物には不可能である。これを回避するために、我々は上頸神経節（SCG）植技術を適応した。神経成長因子（NGF）を用いた治療に基づいたSCG外植片は神経節から周囲に軸索に沿って移行SCの前駆続いて軸索を伸ばす。このシステムの利点は、SCが内因性SCのプールから、それらが同時に成長している自分自身の生理的な軸索に沿って移行することに由来していることです。軸索に沿ってSCの開発がSCの移行についての洞察を得るために更なる可能性を開いて、タイムラプスイメージングによって解析することができるので、このシステムは、特に興味をそそられる。

プロトコル

1。コラーゲンゲルの調製

1. 455μlの10倍、MEM、112μlの7.5パーセントのNaHCO _3、50μlのグルタミンおよびNaOHを含む、株式媒体を準備します。濃度とNaOHの量は、ラット尾コラーゲン製剤（1.2参照）、1,000μlのある株式媒体の最終容量に依存します。
2. Ebendal（1）に記載のラット尾部コラーゲンを準備します。 4℃のコラーゲン溶液を保存コラーゲン溶液の劣化を観察することができなかった。新しいバッチを調製した後、株式培地（1.1参照）に必要なNaOH濃度を推定する。 NaOHの量と濃度の滴定のための媒体のpHインジケーターを使用しています。 800μlの酸性ラット尾コラーゲンは、株式の培地210μlの混合赤の影を有効にする必要があります。 NaOHの濃度が低すぎるとコラーゲン溶液は、培地のpH指示薬により、黄色に変わります。突くことなく、メディアとのミックスにコラーゲンを追加気泡をucing。氷の上でこれらの手順を実行します。重合は、コラーゲン溶液と株式媒体を混合した後、2時間以内に発生し、新しい溶液を37℃でインキュベートする。実験を開始する前にこれをテストします。 1.3）（1.2参照）在庫培地210μlでコラーゲン溶液800μlを混合します。 8ウェルチャンバースライドのウェル中にこの溶液100μlを置きます。 37でスライドをインキュベート℃、5％CO _2、および細胞培養インキュベーター中で湿気のある条件。細胞培養ベンチ、無菌条件下でコラーゲンゲルを準備します。コラーゲンは、2時間以内にgelatinizes。

2。胚SCGsの解剖

1. 子宮からの時間妊娠中のマウスの収穫胚（E16-18）し、さらに、必要になるまでそれらをPBS中に入れておきましょう。
2. 羊膜から1つの胚を解剖。鎖骨レベルの胚の尾の首を。 "昆虫針"を持つシリコンボトムディッシュ上でヘッドを固定します。頭の腹側はあなたに直面しているあなたは顎下領域を参照してくださいする必要があります。d。固定は簡単に準備できるようになります。
3. 左と右の顎下領域およびそれとの皮下結合組織の皮膚を取り除きます。
4. 舌、infrahyoidal筋肉や胸鎖乳突筋の上にビューをクリアするために、その場所から顎下唾液腺を削除します。
5. 喉頭と気管の上にビューをクリアするために慎重にこれらの筋肉を削除します。気管および喉頭を削除します。頚動脈はその後椎前筋の両側に表示されます。 SCGは、頸動脈の分岐点に位置し、楕円形の形状を有している。慎重に神経を除去し、PBS中に置いてください。彼らはそれらに付着している場合は切開ツールから優しく神経を取り除きます。それは、鉗子と同様SCGを除去するための "昆虫針"が搭載された針ホルダーを使用することは有益である。
6. あなたはenouを解剖するまで一度PBS中、PBS中で室温で神経を保存GH神経節。その後、血管や結合組織から神経をきれいにしてください。層流ベンチ下に置かれた解剖顕微鏡下SCG切開とクリーニングを行ってください。
7. 最後に、扱いやすくするために注射器に搭載された注射針の助けを借りて、ゼラチン化したコラーゲンゲルに外植神経を配置します。
8. 5％CO ₂の湿潤な条件で、37℃で細胞培養インキュベーター中で糊化コラーゲン上SCG外植片をインキュベートする。

3。 SCG外植片の治療

1. 1〜2時間のインキュベーション後、B27サプリメント、グルタミンおよび抗生物質を含む100μlNeurobasal細胞培養培地とSCG植含むコラーゲンをカバーしています。今チャンバースライドのウェルは200μl（100μlのゲルと100μlの培地）のボリュームが含まれています。しかし今では軸索の成長を促進するために、NGF（60 ng / mlで）を含む、媒体の別の200μlを添加する。従って最終NGF濃度は30 ng / mlである。
2. 1. SCの移行の発症を調査するために、in vitroで 0（DIV0） で一日に直接追加の要因を追加します。 （2）必要に応じて二重濃度のNGF含有する培地中での要因を溶かす。
   2. すでに軸索に沿って移行開始のSCへの影響を分析するために、DIV4（実験の潜在的な停止）までDIV3で付加的な要因を追加します。この目的を達成するために、慎重にDIV3では、溶液の180μlを削除し、NGFとダブル濃度（2）で興味のある付加的な要因を含む200μlの新しいメディアを追加します。

4。タイムラプスイメージング

分析用倒立顕微鏡を使用しています。種々の目的は、ビューと倍率のフィールドを定義し、使用することができます。 SCG植片のイメージングは​​スライドガラスとコラーゲンを介して行われるように1つの重要な側面は、しかし、使用目的の作動距離であるゲル。 1/10-30分の録画フレームレートは良好な結果（2）を示した。しかし、この側面は、科学的な疑問に調整する必要があります。通常のCCDカメラは、画像取得のために使用することができます。タイムラプスイメージングのための細胞培養インキュベーションチャンバーは、顕微鏡のステージに取り付けなければならない。 5％CO ₂の湿潤な条件で、37℃で撮像中に組織をインキュベートする。撮影開始前培養システム一時間を開始します。これはチャンバースライドを含む顕微鏡部品（ 例えば、対物）の温度に調整することができ、温度ドリフト誘発を防ぐことができます。顕微鏡ソフトのヘルプやSCG外植片に異なる印加条件の同時分析のためのソフトウェア制御の電動ステージ（マルチポジションの設定）に分析の特定の領域を（外植片に内および異なる外植片の間）を定義します。使用することができるタイムラプスイメージング野生型組織だけでなく、トランスジェニック動物からの組織のために（3）：SCS（GFP S100B）をマーキング。イメージング蛍光団のための蛍光光源はmicropscopeセットアップで実装する必要があります。標準のフィルタを使用します。

5。 SCの移動距離の定量化

1. エンドポイント（例えばDIV4）で、3〜4時間のためのチャンバースライドに4％PFAでコラーゲンゲルを固定します。連続してPBSで10分間コラーゲンゲルを5回洗浄する。免疫細胞化学（2）のための標準的なプロトコルを適用します。あなたはSCGsの準備を初めて使用する場合は、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）カテコールアミン細胞に共通のマーカーに対する免疫組織化学による交感神経節と節の身元を確認します。免疫組織化学（一次抗体後）の間に、ゲルを洗浄するために有益であるより大きな体積を有する24ウェルプレートにコラーゲンゲルを含む植を転送します。
2. 免疫組織化学の後、スライドガラス上にコラーゲンゲルを慎重に置きます。慎重に残りの溶液を除去し、コラーゲンが乾燥/二次元に縮小することができます。これは、距離（2）の容易な測定を可能にする。この後、サンプルをマウントします。
3. 最後に、フィジー（NIH）のソフトウェアの助けを借りて移動距離を測定します。は、特別なプラグインはこの目的を達成するために必要ではありません。 μm単位の正確な測定を可能にするには、正しい画像のメタデータとフィジーの下の設定、画像やスケールを確認してください。細胞の定量化のためにもフィジーを使用しています。

結果

軸索の成長は、NGF（4）（映画スキームS1は図1方式）を用いた治療により植片をSCGから促進される。このプロセスは、倒立顕微鏡で簡単に表示され、タイムラプスイメージング（ムービーS2）を続けることができます。科学者がマウス胚からSCGを解剖で新たに追加された場合、我々は強くシンプルな抗チロシンヒドロキシラーゼ（TH）免疫組織化学によって手法の妥当?...

ディスカッション

末梢神経系の発達は、エキサイティングなプロセスです。開発が完了すると、軸索は、ヒトでは、多くの場合100 cm以上であることができます全体の長さに沿って、SCSによってensheathedされています。この目的を達成するために必要なSCの正しい数はまた、完全な軸索のカバレッジを確保するため、周囲に伸びる軸索に沿って移動しなければならない開発およびSCの間に確立されてきました。こ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/材料の名称	会社	カタログ番号	注釈
10xのMEM	ギブコ	21430
炭酸水素ナトリウム（7.5％）	ギブコ	25080
グルタミン	ギブコ	25030
NaOHを	メルク	109137
NGF	ロッシュ	1058231	R＆Dの＃556-NG-100
Neurobasal培地	ギブコ	21103
B27サプリメント	ギブコ	17504
抗生物質	ギブコ	15640
D-PBS	ギブコ	14040
昆虫針	FST	26002から20
注射針	ブラウン		BD＃300013
8穴のチャンバースライド	ラボTEK	177402