密度勾配多層重合（DGMP）：マルチコンパートメントを作成するための新規な技術、組織工学のためのカスタマイズ可能な足場

要約

ここでは、組織工学のための異なった層の間の連続的なインタフェースを備えた生体適合性、階層化行列を作成するための独自の戦略を説明します。このような足場は、様々な生物学的、化学的または機械的な手がかりによって細胞の挙動を調節するのに理想的なカスタマイズ可能な環境を提供することができます

要約

種類と生物学的刺激の濃度（ 例えば 、成長因子、阻害剤、または小分子）やマトリックス構造（ 例えば組成、濃度、またはマトリックスの剛性が）空間にわたって変化、調査の広い範囲を可能にする複雑な組織培養マトリックス、これらの変数は、細胞分化、移動、および他の現象にどのような影響を与えるかについて。階層化行列を作成する上での大きな課題は、各レイヤ¹からの個々の成分の拡散せず、層界面の構造的完全性を維持している。これを達成するための現在の方法は、光パターニング^2-3、リソグラフィ^4、シーケンシャル^{functionalization5、6を}凍結乾燥、マイクロフルイディクス^7、またはそれらの多くは、洗練された計測機器や技術的なスキルを必要とする遠心分離^8が含まれ^ています。その他は⁹層の剥離につながる可能性があります個々の層の連続した添付ファイルに依存している DGMPは密度^10を変化させるレイヤーを作成するなどのような不活性イオジキサノール密度修飾子を使用することで、これらの問題を克服しています。密度修飾子は任意のプレポリマーまたは生物活性分子と混合することができるので、DGMPは各足場層をカスタマイズすることができます。彼らは水のままで単に密度調節剤の濃度を変化させることによって、隣接する層の混合を防ぐ。その後のシングルステップ重合は、各層が異なる化学的および機械的特性を有する構造的に連続多層足場を生じさせる。密度修飾子は、簡単に個々の層またはそのコンポーネントの摂動なしですすぎ十分に除去することができる。この技術は、それゆえ様々なサイズ、形状、材料のハイドロゲルを作成するための適している。

交互の層がRGDS-350を組み込むた2D-ポリエチレングリコール（PEG）でゲルを製造するためのプロトコルは、以下の通りです。我々は、PEG bを使用それは、生体適合性および不活性であるecause。 RGDS、細胞接着ペプチド^11は 、生物学的な手がかりの空間的制約を示すために使用され、フルオロフォア（アレクサフルオル350）の接合は、私たちは視覚的に様々な層を区別することができますされています。この手順は、他の材料に適合させることができる（ 例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸など）と¹⁰いくつかの修正を加えて3Dゲルを作製するために拡張することができます。

プロトコル

1。蛍光標識アクリロイル-PEG-RGDSの合成

1. 室温でアルゴン下、ジメチルスルホキシド（DMSO）のモル比で1.2:1:2とNNジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）アクリロイル-PEGスクシンイミジルカルボキシメチルエステル（3400グラム/モルaPEG-SCMは、PEG MW）とRGDSペプチドを反応一晩。
2. 飛行のマトリックス支援レーザー脱離/イオン化時間（MALDI-TOF）質量分析法によって共役を確認してください。 MALDIターゲットとドライでの試料スポットにaPEG-RGDS反応液の1μlを添加します。ユニバーサルMALDIマトリックスのテトラヒドロフラン（THF）と1分間ボルテックスの飽和溶液を調製します。同じサンプルのスポットにこのソリューションの約1μlを添加する。比較のためにaPEG-SCMの手順を繰り返します。ロードし、分析します。 aPEG-RGDSの分子量はaPEG-SCM（ 図2）より大きくなければなりません。
3. 蛍光色素を結合するために、溶解のAlexa Fluor 350カルボン酸（succinimydylエステル）の等モル量を追加DMSOの最小容量で、1.1からaPEG-RGDS反応溶液に、室温で一晩アルゴン下で反応する。
4. 日当たり少なくとも二回透析液を交換し、1,000:1体積比で48時間、4℃でのDI-H ₂ Oに対して（MW 3500 Da）は透析によってaPEG-RGDS-350を精製する。
5. 精製LabconcoフリーゾーンPlusまたは同等のフリーズドライシステムでaPEG-RGDSを-350、-20℃で保存をフリーズドライ

2。 RGDS-350層を交互に使用した2DのPEGゲルの2Dモールドと製作の準備

1. 疎水性ガラススライドを準備します。真空オーブン内のガラス皿にきれいなガラススライドを配置します。 80熱が°Cで30分間完全に表面を乾燥させる。場所はドラフト内でスライドと皿と優しくコート表面全体に30秒間揺らし、各スライドに250μlのSigmacoteを追加します。徹底的にLEAがでで5分間ずつ2回浸漬し、蒸留水で洗浄した後、100％メタノールでコーティングされたスライドをすすぎトン10ミリリットル。
2. 10ミリメートル生検パンチでシリコーンスペーサー（0.8mm厚）を切り取ります。
3. シリコーンスペーサーとSigmacote処理したスライドガラスをオートクレーブ。
4. 最終濃度（ 例えば 40％、変化得イオジキサノールの異なる量（水中60％原液）と混合PEGアクリレート（PEGDA）前駆体（最終濃度15パーセントw / v）のことで、個々のマイクロチューブ内の各々の層のための解決策を策定する30％、20％と10％）、リン酸塩残量を補うことは傾斜密度の解を得るために、緩衝生理食塩水（PBS）。同様にして、交互層のために、イオジキサノールおよびPBSでミックスaPEG-RGDS-350（終濃度8 mm）が様々な濃度（ 例えば 35％、25％、15％）を得た。
5. 様々な層（各層の溶液1ml当たりの株式溶液10μl）の各溶液に（2 - ヒドロキシ-4'-（2 - ヒドロキシエトキシ）-2 - メチルプロピオフェノン、N-ビニルピロリドンで333mg/ml株）光開始剤を追加します。光開始剤Isは光に敏感であるように、金型内のゲルの階層化する前に重合を防止するために最後に追加された。
6. このプロトコルの後続ステップは、無菌性を確保するためにバイオセーフティキャビネット内で実行されます。
7. 滅菌した1mlシリンジおよび0.2μmフィルターを用いて、各溶液をろ過滅菌を。 2 Sigmacore処理されたガラススライド、 図1に示すように配置するクランプとの安全の間にスペーサーを挟むことにより、金型設定を組み立てます。
8. 密度の低い溶液（35％イオジキサノールと例えば aPEG-RGDS-350）に続く最初の最も密な溶液（40％イオジキサノールと例えば PEGDA）を追加することで、階層化ゲルをキャストします。 図1に示すように、所望の組成と密度のいくつかの層を達成するために代替の階層化を繰り返します。
9. ポータブルUVR-9000ランプを使用して3分間365nmの光でモールドを照射します。重合したゲルは、5分間硬化させることを許可します。クランプを外し、そっと上部のガラスを持ち上げるスライドやカビ、成層DGMPゲルは、スライド上に残ります。無菌のスパチュラを使用して、慎重に滅菌PBSまたは洗浄用培地を含む50 mlチューブにゲルを置きます。
10. 密度調節剤、光開始剤、及び未反応のポリマーを除去するために一日に少なくとも二回バッファを交換し、1,000:1体積比でPBS中の重合ゲルを洗浄します。代わりに、PBSを細胞増殖培地と交換することができる。 PBSまたはステップ3で概説細胞培養実験のための増殖培地中DGMPゲルを保管してください。
11. 交互層を可視化するために、VersaDocゲルドキュメンテーションユニットのサンプルトレイ上の定規に沿ってDGMPゲル（これらのゲルは、細胞培養のため使用できません）を手配。 350 nmのゲルを公開。露光時間は、フルオロフォアの濃度に応じて異なります。 DGMPヒドロゲル中に濃い青とバンドを交互に異なる化学組成（ 図3）の離散的な層の形成を実証している。

3。 DGMPゲル上での2Dセルカルチャー

1. RGDSペプチドを組み込んだゲルは、そのようなC2C12筋芽細胞などの接着依存性細胞を使用しています。
2. ゆっくりバイオセーフティキャビネット内で無菌のセルスクレイパーを用いて48ウェル細胞培養プレートのウェルにDGMPゲル（PBS中に保存）を挿入します。
3. プリ暖かい増殖培地（10％v / vのウシ胎児血清および1％v / vの100xのペニシリン - ストレプトマイシン溶液を補充したダルベッコ改変イーグル培地またはDMEM）およびPBS 37℃に設定した水浴℃で
4. PBSでC2C12細胞3倍の60％コンフルエントのプレート（10 mm）を洗浄します。 0.25％トリプシン-EDTAの1mlを添加し、2分間37℃でインキュベートすることにより、PBSおよび収穫細胞を吸引。増殖培地とカウント細胞で細胞を​​再懸濁する。 C2C12筋芽細胞（20,000細胞/ cm ^2）と同様にゲル含有細胞培養DGMPシード。 5％CO _2/95％相対湿度で37℃で細胞をインキュベートします。再しないように注意してください4時間後にそっと交換媒体、軽く接着した細胞を移動します。
5. 24時間後、DGMPゲルのRGDS含有層上にC2C12筋芽細胞の付着は落射蛍光および位相差顕微鏡（ZEISS AXIOVERT 200）で確認することができる。

結果

MALDI-TOF分析はアクリロイル-PEG（ 図2）にRGDSペプチドの結合を確認します。ゲルイメージングは、光重合開始剤（ 図3A）の後RGDS-350（青）の交互層を明らかにする。 図3Aに示すように、2D DGMPゲルサイズはシリコーン型（左10ミリメートル; 8ミリメートル、右）の直径に基づいて変化させることができ、したがって、複数のアッセイにおける使用のために容易にカスタマイズ可能です-このケースに収まるように48ウェル細胞培養プレート（ 図3B）。 DGMPゲル上で培養したC2C12筋芽細胞の落射蛍光および位相差顕微鏡は、細胞接着ペプチド（RGDS）の区画を示す、RGDS-350-含有するPEG層（ 図4）で選択的結合を示しています。

図1。分子weigMALDI-TOFはRGDSペプチドの結合の後に得られたaPEG-RGDSにaPEG-SCMを比較することにより、HT分析。

図2。 DGMPゲル作製の模式図。勾配が積層された後、彼らは光重合続いメスインターフェイスを作成するために時間の期間_（T S） _を変化させるために解決させることができる。成層DGMPゲルは簡単にさらに使用するために金型から取り出すことができます。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図3光重合後に得られた）2次元多層ゲルは350nmとVersaの白色光チャネルを使用して画像化ドクゲルドキュメンテーションユニット。画像が白でRGDSを含む交互層を明らかにする。B）は DGMPゲルの挿入を48ウェル細胞培養皿にグレースケール。

図4 DGMPゲル（スケールバーは50μm）上に成長させたC2C12筋芽細胞の位相コントラストと落射蛍光画像を合併。

図5。ゲル表面の弾力性に関するイオジキサノールの効果。2 nNの力トリガ¹²を使用して、以前に確立された方法を用いて架橋したPEG基板の静的サンプルの原子間力顕微鏡の測定は。 * P <0.05、** P <0.01。

ディスカッション

DGMPは高価な機器に依存しない多層ゲルを調製するためのシンプルな戦略です。このプロトコルは、コラーゲンやヒアルロン酸などの他の生体適合性材料を使用して、足場を作成するために適応させることができます。生理活性小分子は、例えば細胞接着促進RGDSペプチドのため、層の間の合図の混入を防ぐために、ポリマーマトリックスに係留することができます。マトリックスメッシュのサイズに応じて、彼らは、ハイドロゲル¹⁰を通って拡散しにくいようなタンパク質は、化学的結合を必要とせずに異なる層にカプセル化することができます。ここでは、イオジキサノール（Nycoprep）は、以前の生細胞アプリケーション用に使用されている不活性密度修飾子を使用していました。例えば、ショ糖、ブドウ糖などの他の密度調節剤を使用することもできます。セトリング時間（t _s）を変化させることによって、人は、必要に応じて二つの層の間のインタフェースが（長いセトリング時間はスムーズな遷移を与える）またはスムーズな遷移を生成するために微調整することができます<> 10（商標）。たとえば、DGMPゲル層の間のスムーズな遷移が走化性などの細胞プロセスを研究する生物学的な手がかりの連続勾配を生成するために使用することができる。

ゲル剛性に密度調整剤の効果を15％aPEGdaゲルのため、図5に示されている。PEGDAとイオジキサノール濃度の関数としての剛性と気孔率のより完全な特性評価現在評価されている。この例ではPEGDA濃度が比較的高いですが、我々は、することなくゲルに比べて30％のイオジキサノールを含むゲルは60％以上の弾性率を観察した。ゲル剛性の変化を変調マクロマー濃度や架橋密度を調整することができる。

我々はまた、ポリアクリルアミドおよびPEG前駆体^10を使用^して 3D多層ゲルを作成するDGMP手法を適用している。濃度又はプレポリマーの架橋度を変化させることができにおける構造変化3Dで偏成長および移行などの細胞の挙動を調査するために使用することができる足場、。

要約すると、DGMPは、生物医学と基礎研究を幅広いアプリケーション向けに生体適合性材料の様々な2Dおよび3Dの足場を製造するために適用することができる、柔軟なテクニックです。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬またはインストゥルメント	会社	カタログ番号
ポリエチレングリコールsuccinimydylカルボキシメチル（α-PEG-SCM）	Laysan	120から64
Polyethelyeneグリコールジアクリレート（PEGDA）	Dajacラボ	9359
アルギニン - グリシン - アスパラギン酸 - セリン（RGDS）	アメリカンペプチド	49-01-4
N、N -ジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）	シグマ	D125806
ジメチルスルホキシド（DMSO）	シグマ	D2438
N、N-ジメチルホルムアミド（DMF）	フィッシャー	D119-4
テトラヒドロフラン（THF）	フィッシャー	T397
透析カセット（3500ダ）	サーモサイエンティフィック	66330
のAlexa Fluor 350カルボン酸エステルsuccinimydyl	ライフテクノロジーズ	- 10168
Sigmacote	シグマ	SL2
シリコーンスペーサー	グレンジャー	1MWA4
生検パンチ	Acuderm	P1025（10ミリメートル） P850（8 mm）の
Dulbeccoリン酸（DPBS）緩衝生理食塩水	Hyclone社	SH30028
イオジキサノール（NycoPrep）	フィッシャー	NC9388846
2 - ヒドロキシ-4'-（2 - ヒドロキシエトキシ）-2 - メチル	シグマ	410896
ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）	ライフテクノロジーズ	11054
ウシ胎仔血清	ライフテクノロジーズ	10082
ペニシリン - ストレプトマイシン	ライフテクノロジーズ	15140
C2C12筋芽細胞	ATCC	CRL-1772
MALDI	ブルカー	N / A
UVR-9000	Bayco	UVR-9000
VersaDoc	バイオ·ラッド	N / A