における寿命の測定<em&gt;キイロショウジョウバエ</em

Nancy J. Linford; Ceyda Bilgir; Jennifer Ro; Scott D. Pletcher

doi:10.3791/50068

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この記事について

要約
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要約

キイロショウジョウバエは寿命調節の分子基盤を探索するための強力なモデル生物である。このプロトコルは、長寿の再現性は、人口ベースの測定だけでなく、潜在的な落とし穴とその回避方法を生成するために必要な手順を説明します。

要約

高齢化は、それが検討されたほぼすべての生物が順調に生理的な劣化の結果は、減少した身体能力と疾患のリスクの増加につながるという現象である。個々の高齢化は、多くの場合、年齢をマッチさせた個体の大規模コホートで寿命を観察することにより、実験室で測定され、年齢に依存死亡率の増加は、人口レベルでのマニフェストです。単純なモデル生物でどの遺伝や環境操作衝撃寿命の程度を定量化しようとする実験が寿命を延長し、哺乳類では加齢に伴う疾患を予防するための分類群を横切って、感激新しい戦略のために保存されており、高齢化の側面を理解するために著しく成功してきた。

ショウジョウバエ、 キイロショウジョウバエは 、その比較的短い寿命、便利業、そして容易な遺伝に起因する老化のメカニズムを研究するための魅力的なモデル生物である。しかし、年齢別生存率と死亡率を含め、高齢化の人口学的指標は、実験的なデザインと環境のわずかな変化に非常に敏感である、老化実験期間中の厳格な検査室の安全基準の整備が必要となります。これらの考慮事項は、一緒に遺伝的背景を慎重にコントロールを練習する必要性と、堅牢な測定値を生成するために不可欠です。確かに、環境や遺伝的アーティファクト^1-4にトレースされている酵母、ワーム、ハエやマウスの長寿実験から推論を取り巻く多くの著名な論争があります。このプロトコルでは、我々は、実験室のバイアルを使用して、ショウジョウバエの寿命を測定することが長年にわたって最適化されている一連の手順を説明します。私達はまた私達の研究室で開発され、ダウンロード（利用可能ですdLifeたソフトウェアの使用を記述http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab /ソフトウェア）。 dLifeは、スループットを加速し、フライ処理とデータ収集の簡素化、データ解析の標準化、最適な実験デザインを組み込むことにより、優れた実践を推進しています。また、設計、収集、および寿命のデータの解釈には多くの潜在的な落とし穴について説明します、我々はこれらの危険性を回避するための手順を提供します。

プロトコル

我々は、4℃でプロトコルに現れる実験食品、酵母ペースト、ぶどう寒天プレートを格納し、カビや乾燥が幼虫と成虫の両方の標準環境条件をインチに設定していない限り、1〜2ヵ月以内にそれらを使用することをお勧めします12時12時間の明暗サイクルおよび60％の相対湿度で25℃のインキュベーター中でハエのメンテナンスを伴うステージングします。

1。実験食の調製

幼虫の成長のために、我々はCTなどのこのプロトコルの簡略化されて修正されたカリフォルニア工科大学中^5を使用^{しています} 。
我々は（10砂糖（ショ糖）と抗生物質や抗真菌剤を補充煮沸された2％寒天ベース、中の酵母（凍結全体ビール酵母）で構成されています大人のショウジョウバエ （SY）のためのダイエットを推奨し、配布しml当たりバイアル^）6。食品は貯蔵前に12〜24時間のために凝固し、蒸発させなければならない。栄養環境がsubstanできるのでtially調理過程における衝撃長寿、一貫性は、実験内及び実験間の比較のために両方が不可欠である。
薬剤が成人食品に添加される場合には、この薬は、単独で車両を含む層を受け取るコントロールバイアルと食品表面上に食べ物と層状の小ロット（2ミリリットル）中に混在させることができます。

2。ライブ酵母ペーストの調製

アクティブドライイースト3gで水の5-6 mlを組み合わせて、よく混ぜる。酵母ペーストの一貫性は、滑らかなピーナッツバターのようにする必要があります。

3。グレープ寒天プレートの準備

1000mlのフラスコ内の500mlの蒸留水にブドウ寒天プレミックスのパケットを追加し、ブドウ寒天ミックスを溶解するために、パケット上の指示に従ってください。
気泡形成を回避しながら、慎重に100ミリメートルペトリ皿に混合物の厚い層を注ぐ。プレミックスの1パケットは約14 GRAを生成peの寒天プレート。
メディアは15分間で蓋を室温で冷却して凝固させてください。プレートは、4℃でCを保っプラスチックラップに包まれたか、すぐに使用することができます。

4。シンクロナイズド卵のコレクション

このプロトコルで使用されているすべてのメディア、 すなわち酵母 、ブドウ寒天プレートは、CTと10％SY食品は、室温でなければなりません。

ぶどう寒天プレートに貼り酵母の2-3 cmの直径層を広げ、脇に置きます。
ハエを麻酔するメッシュ側でCO _2のパッドの上に大型採卵ケージを下に置きます。窒素系麻酔は、高品質の結果^7を生成することができますいくつかの研究室で使用されたCO ₂の代わりに、、です。
漏斗を使用して、採卵ケージにハエの150から200のペアを転送します。
ケージの開放端部をカバーし、エンドキャップで保護するためにブドウの寒天プレートを置きます。
ハエが目を覚ますまで、その側にケージを置きます。その後、一晩インキュベーター中で、ケージ、ブドウ寒天プレート側を下にして保管してください。
翌日、新たにyeastedブドウプレートとブドウプレートを交換します。唯一の板の表面に貼り付け、酵母の直径1cm程度置く。 ¹日目のブドウプレートは破棄してください。
胚は16から22時間、ブドウ寒天プレートの表面に収集することができます。一度完了したら、ブドウの寒天プレートを収集し、親のハエを破棄します。
緩衝生理食塩水（PBS）1Xリン酸とブドウ寒天プレートの表面を洗浄します。卵は優しく綿棒でこすることにより動員することができます。傷、損傷しないように注意するか、板の表面から寒天の薄い部分を削り取る。漏斗の助けを借りて、15 mlコニカルチューブに洗浄された卵を注ぐ。
卵管の底に沈殿し、任意の卵を紛失しないように注意しながら、上清を捨てましょう。残りのボリュームは2〜3ミリリットル前後となるはずです。
チューブにPBSの8-10 mlを加え、上記のステップ2-3を繰り返しMOReは倍上澄みが透明になるまで徹底的に卵を洗浄する。残留酵母を退治すると、このステップでの鍵となります。
残存量が2ミリリットルになるまで洗浄した後、すべての上澄みを排出する。ワイドボアピペットチップを用いたCTボトルに小分けした卵の32μlを。ピペットチップの中の卵を吸引しない液体に少しで、コンパクトにすべきです。これは、卵の決済に深くピペットの先端を挿入し、素早く吸引するプランジャーを解放することによって達成することができます。
場所シードCTはフライ開発全体インキュベーターに戻しボトル。

5。年齢をマッチさせた大人のハエのコレクション

大人は通常、9日目以降から孵化するでしょう。インキュベーターで一晩に戻って最初の日と場所のボトルに現れハエを破棄します。この習慣は早いemergentsため不注意選択を回避し、同期されたハエの最大数の収集が可能になります。
16から22時間後、日齢の大人がint飛ぶ転送O 10パーセントSY食品ボトル。必要に応じて、別のバッチは翌日に収集することができる。
リターンがインキュベーターに戻し飛んでハエが2日間性的成熟とチームメイトに到達することを許可。成人期の最初の日として10％SYボトルへの移転の日を記録します。

6。ハエのソートと長寿実験のセットアップ

絵筆を使って2つのグループに分け、次に麻酔パッド上のハエの小グループ、ソート、男性と女性を麻酔。 CO _2を使用している場合は、それが長寿実験の整合性を損なう可能性が考えられる長続き健康上の問題を防止するための曝露を最小限にすることが重要です。
個々のバイアルに同じ性別の30ハエを置きます。人口と健康な子孫にはバランサー染色体はないと仮定すると、各ボトルには、各性別の3-4バイアル周り生成する必要があります。個々のバイアルにハエを小分けして、合計で、ハエが唯一の最大麻酔にさらされている、ように、3〜4分しかかからないはず9月10日分。
8月10日バイアルは各性別と実験的な治療のために複製されますが存在しなくなるまで繰り返し6.1から6.2を繰り返します。

7。長寿実験を追跡するためのExcelスプレッドシートの設定

我々は、インキュベーター内でバイアルの場所に関連付けられているバイアスを避けるため、実験者にバイアルアイデンティティをあいまいにするために、実験条件によってバイアルの位置ではなく、グルーピングバイアルをランダム化することをお勧めします。これを行うには、最初のID番号によってトレイのバイアルを手配した後、スプレッドシートプログラムで各バイアルに無作為化された数値IDを割り当てます。あなたはdLife実験管理ソフトウェアを使用している場合は、各バイアルのID番号を生成するために実験のセットアップについてのチュートリアルに従ってください。
あなたはdLifeと関連してRFIDリーダ、バーコードリーダーを使用している場合（オプション）各バイアルにRFIDやバーコードタグを添付し、dLifeでバイアルの数値IDでタグを関連付ける。リーダーでスキャンすると、プログラムが各バイアルを認識しますと、スプレッドシート内の正しい場所にデータを記録するために1つを導く。 dLifeと連動タグリーダの使用が大幅にデータ収集時間は、記録エラーを低減します。

8。長寿実験を維持

生鮮食品を含むバイアルは、各転送室温でなければなりません。

実験期間中は、転送は、生鮮食品を含む新しいバイアルに2日ごとに（若い女性）、または週3回（> 3週齢の男性または女性）を飛ぶ。このステップでは、若い女性のための摂食環境が幼虫の存在によって破壊されないことが保証されます。この転送は、特に古いハエ（Pletcher、個人的な観察）で、急性死亡を誘発する可能性が麻酔なしで完了する必要があります。
各バイアル転送時に、年齢を録音古いバイアル中で死んだハエを数えて、新しいバイアルに運ばれ、死んだハエ。で別々に、この情報を記録スプレッドシート内の2つの列（dLifeまたは独自のスプレッドシートのいずれか）。これが運ばハエがダブルカウントされないことが保証されます。死亡者数（死者+運ばれます）は、前の転送から運ばハエの少なくとも同数べき。新たな死亡者数を決定するために、死亡者の総数から、以前に行ったハエの数を引きます。
それが流出し、又は不慮の死を通して、自然死に先立って実験を放置しておくとハエが右側打ち切りとみなされます。このような方法で実験を終了する動物は、フライは、実験を終了した日に別の列に入力してください。検閲ハエ（下記参照）が死んだとして記録されません。
最後の生存者が死んでまで、手順8.1から8.2を繰り返し続けています。ハエの年齢として、いくつかのハエが自分の背中の上に横にと彼らの非活性のために死んだように見える場合があるので注意してください。よって運ば（デッド）ハエをカウントするとき、足の動きがあるかどうかを判断するためにバイアルの側面にタップします。もしそうなら、テサロニケeのハエはまだ生きている。ハエが古いバイアルが、生きている中で、食品に付着したままである場合、それらは死者としてカウントされるべきではなく、さらにフライを取り除くために、バイアルの盗聴によって救出されるべきである。それは実験的なバイアスの原因になることがあり打ち切りなどハエは慎重に使用する必要があります。

9。データ解析

生存曲線は、個人が与えられた時代に生き残る確率が表示され、通常はKaplan-Meier法によるアプローチ（ 図^1）8 ^を使用^して計算されます。右打ち切りデータが存在しない場合には、式が年齢 x（S _x）の時など、その時代特有の生存率は、年齢_×（N xの）で、国勢調査時の開始時に生きている個体数を割ることによって決定されます簡単にすることができる実験でハエの総数（N _0）で、S _X = N _X / N _0。 9.2）の生存曲線は、データのプレゼンテーションの中で最も一般的な形式であり、それらlog-rank検定を用いて群間の等価性をテストすることができます。合理的な推論はコホートで50から100人ほど少ないから引き出すことができる。生存しかし、累積尺度であり、したがって、そのような生活の中でそれらは早くも老化に関連しない死亡は、老化に特有の影響を把握することが困難と寿命全体生存率が下がる。
第二のデータ可視化手法では、各年齢区間で死亡のリスクが表示され、生存データ^9,10のより微妙な記述を提示年齢別死亡率の関数である。死亡対策は1歳から別の独立しており、治療が成人期の間に調整されている場合は特に死亡率曲線の形状は、高齢化のダイナミクスについて推論するのに便利です。年齢別死亡率の推定値は、しかし、小さなサンプルサイズで精度と正確さの両方を欠いている、としばしば信頼esに関するコホートごとの個人のいくつかの一対多数百人を必要とするtimate ^11。
長寿の差を推定するための他の方法はパラメトリック（ 例えばゴンペルツ）とセミパラメトリック（ 例えば Cox回帰）モデルを含む。これらのモデルは、強力なことができますが、なぜなら死亡率曲線の形状と誤った推論^11,12につながる可能性があり、治療効果の性質についての仮定から、慎重に適用すべきである。