EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

要約

タンパク質複合体は、重要な細胞機能を触媒する。多くの重要な複合体の詳細な機能と構造解析、組換え生産を必要とします。 MultiBacは、特に真核生物タンパク質及びそれらの複合体を発現するために調整バキュロウイルス/昆虫細胞系である。 MultiBacはオープンアクセスプラットフォーム、およびその有用性を最大化するために開発された標準的な操作手順として実装されました。

要約

プロテオミクス研究は、前例のない詳細に真核生物のプロテオームの印象的な複雑さを明らかにした。それは今では、細胞内のタンパク質はほとんど孤立実体としてではなく存在するが、ほとんどすべてではない重要な機能のため、セル内組立ラインを形成し、人間の10以上では、多くの他のタンパク質に関連してその生物学的活性を発揮することが一般的に受け入れられている概念です^{。1 、}これらの多アセンブリの機能とアーキテクチャの²知識は優れた品質と詳細な分析のために十分な量のそれらの提供を必要とします。細胞内の多くのタンパク質複合体の不足は、真核生物において、特に、天然のソースからそれらの抽出を禁止し、組換え生産を必要とする。バキュロウイルス発現ベクター系（BEVS）は真核生物タンパク質を製造するために特に有用であることが証明されて、活性は、多くの場合、翻訳後プロセシングに依存する他の一般的に使用される発現系は、しばしばできることサポートしていない^。3 BEVSは、目的の遺伝子が交互に選択したタンパク質を産生昆虫細胞培養物を感染させるために挿入された組換えバキュロウイルスを使用します。 MultiBacは、多くのサブユニットを含有する真核タンパク質複合体の製造に特に調整されているBEVSある^。4タンパク質およびそれらの複合体を効率よく製造するための極めて重要な前提条件は、理想的として実装することができる発現実験に関与するすべてのステップのための堅牢なプロトコルである標準作業手順書（SOP）と比較的容易に非専門家ユーザーがまた続く。欧州分子生物学研究所（EMBL）におけるMultiBacプラットフォームは、タンパク質の小規模な分析に異種タンパク質の生産特性のために最適化設計されたバキュロウイルスゲノムに遺伝子を挿入することから開始し、多複雑な式実験に関与するすべてのステップのためのSOPを使用しています生産標本^。5-8プラットフォームEMBLグルノーブルでのオープンアクセスモードでインストールされており、タンパク質の複雑な研究​​プロジェクトを加速するために学界と産業界から多くの科学者を支援してきました。

概要

生物学的活性は、タンパク質および細胞機能を触媒するために協調して作用する他の生体分子のアセンブリによって制御される。顕著な例は、メッセンジャーRNAへのDNAに含まれる遺伝情報を転写する機械があります。ヒトでは、100以上のタンパク質であるRNAポリメラーゼIIや、TFIID、TFIIHおよび他のような一般的な転写因子^。9その他の例を含む10以上のサブユニットを持つ大規模な多タンパク質複合体を形成し、遺伝子を転写するために定義され、規制のプロセスで一緒に来るリボソーム、タンパク質合成、または真核生物の核膜を介して生体分子を往復する責任が核膜孔複合体を触媒する多くのタンパク質およびRNA分子からなる。セル内の本質的にすべての多成分のマシンの詳細な建築と生化学解剖はその機能を理解することが不可欠です。原核生物とeukarの構造解明yoticリボソーム、例えば、これらの高分子マシンはセルでの指定機能を実行する方法に前例のない洞察力を得て構成特徴的なイベント^。10,11

リボソームは、最大細胞の質量の30％にすると、リボソームから構成されるという事実のため、培養細胞から内因性の物質を精製することにより詳細な研究のための十分な質および量を得ることができる。 RNAポリメラーゼIIは、桁違いにすでに少ない豊富で、酵母培養の多くは千リットルは、転写の中心、この本質的な複合体の詳細な原子のビューを取得するために処理されなければならなかった。他の本質的な複合体の¹²圧倒的多数でしかし存在している天然の細胞において非常に低い量、従って、天然源材料から十分に浄化できない。このような複合体をレンダリングするために詳細にアクセス可能な構造と機能解析、組換えTEを使用して異種の生産を必要とするchniques。

組換えタンパク質の生産は、生命科学研究に大きな影響を与えた。多くのタンパク質は、組換え生産され、それらの構造および機能は、高解像度で解剖した。構造的ゲノミクスプログラムは、ハイスループット（HT）モードで全体の生物の遺伝子産物のレパートリーに対処するための多くの生物のゲノムの解明を利用している。タンパク質構造の数千人は、このように決定されている。現在までに、組換えタンパク質の生産に最も豊富に使用されるシステムは、E.されている大腸菌 、多くの発現系は、このホストにおける異種生産のために長年にわたって開発され洗練されてきた。 E.のタンパク質産生を可能にするために官能基の過多を保持するプラスミド大腸菌は、商用プロバイダの全体のカタログを埋める。

しかし、E.大腸菌は、多くの真核生物タンパク質を産生することが適さない特定の制限があり、およびpで多くのサブユニットを有する関節タンパク質複合体。したがって、真核生物宿主におけるタンパク質生産はますます近年の選択の方法となっています。真核生物タンパク質を生成するために特によく適したシステムは、研究室で栽培昆虫細胞培養物を感染させるために異種遺伝子を担持する組換えバキュロウイルスに依存するバキュロウイルス発現ベクター系（BEVS）である。 MultiBacシステムは、特に、多くのサブユニット（ 図1）真核生物タンパク質複合体の製造に合わせて調整され、より最近開発BEVSある。 MultiBacが最初に2004年に導入された図^13は 、その導入以来、MultiBacを連続洗練されており、処理を簡略化する標的タンパク質の品質を向上させ、一般的に効率的な標準業務手順書（SOP）を設計することにより、非専門家のユーザーにシステムがアクセスできるようにするためにストリーム並ぶ。 ⁴ MultiBacは、ACで、世界中の多くの研究室で実施されているademiaや業界。グルノーブルEMBLで、国境を越えたアクセスプログラムは、自分の研究を進めるために、この生産システムを利用することを望んだ科学者のためMultiBacプラットフォームで専門的なトレーニングを提供するために、欧州委員会によって所定の位置に置かれた。これまでアクセスできていなかった多くのタンパク質複合体の構造および機能はMultiBacで生成試料を用いて明らかにした。以下^、4彼らはEMBLグルノーブルでMultiBac施設で稼動しているように、MultiBac生産の本質的なステップは、プロトコルにまとめる。

プロトコル

1。多重遺伝子発現構築物を作成するためのタンデムコンビニアリング（TR）

1. 共発現戦略を計画 。供与体および受容体に興味のあるあなたの遺伝子を挿入するための設計手法。あなたの体の潜在的な生理的なサブモジュールは、特定のアクセプタとドナーで一緒にグループ化する必要があります。個々のドナーとアクセプターのプラスミドに発現カセットを組み合わせることのBstXIペア^7,8は、in silicoで 、関連するすべての構成要素を作成し、実験的な作業に進む前に、徹底的に戦略を検証-ホーミングエンドヌクレアーゼ（HE）で構成される乗算モジュールを使用します。例えば、目的の遺伝子は、HEまたは他の制限部位と正しいオープンリーディングフレーム（ORF）の存在が検証する必要があるが含まれていないか確認してください。タンパク質産生量ならびに任意のEXIの除去を改善するために昆虫細胞のコドン使用頻度およびmRNAの二次構造のために最適化合成遺伝子の順序を考慮HE目的の遺伝子からサイトを刺す。柔軟性のある、または露出したn-または選択のあなたの蛋白質のC末端に関する文献からのデータに基づいて、精製タグを配置することを検討。個々のタンパク質の相対量は、複雑で化学量論の問題のために制御する必要がある場合は複雑で、いくつかのタンパク質サブユニットの生産を目指すポリ戦略を適用することを検討^。4詳述"ハウツー"文書（電子ラボ帳が推奨されます）を含むを準備すべての完全な多重遺伝子構築物（複数可）に至るまで、プロジェクトの実験手順を投影。バーガーグループのホームページ（からダウンロードできCRE-ACEMBLERソフトウェアを使用して、例えばCRE-のLoxP融合プラスミドの電子ファイルを作成www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / CRE-acembler ）。
2. 選択したドナーに興味のあるあなたの遺伝子を挿入し、制限酵素とリガーゼを用いることにより、又は、代替的に、公開プロトコルに従ってライゲーションの独立した方法を用いて、アクセプタ^。5,6,14は、液体ハンドリングワークステーションへのアクセス権を持っている場合は、生成される構築物の多数（予定がある場合コンビナトリアルアプローチのためなど）リキッドハンドリングワークステーションが使用できない場合はバーガーグループ（ 図^2）。14,15によって開発され、実装されロボットスクリプトの使用を検討し、マイクロタイタープレートを使用して手動操作は、ファッションのようにHTにおいて遺伝子の挿入を可能にします。
3. 表現のサブユニットの化学量論を制御する必要性によって課される制約が顕在化することができる。タンパク質複合体の個々のサブユニットの化学量論的に不均衡な発現レベルの場合には、sであけ単一の大規模のORFであなたの体のいくつかのサブユニットと特異的プロテアーゼ（例えばタバコエッチウイルスNIAプロテアーゼ）を結合させるためにポリ戦略を適用することを検討pecificタンパク質分解のサイトは、多くのサブユニットと非常に大規模な複合体を持っていると広く、個々のサブユニットの分子量の範囲の場合^。4,8つを共発現または単一の発現カセットを持ついくつかのポリタンパク質を検討します。そのタンパク質が低い歩留まりによって特徴づけされている場合はポリで、またはいくつかの同一の発現カセットと同じタンパク質をコードするいくつかの遺伝子を共発現することを検討してください^。4,13は
4. 制限マッピング（オプションで高スループット）とシーケンシングによりクローニングすべてのドナーとアクセプター構造を検証します。選択肢の多重遺伝子発現コンストラクトを生成するCRE-のLoxP組換えによってドナー - アクセプターの組み合わせを融合に進みます。制限マッピングによりアクセプタドナー融合プラスミドを精製した検証、CRE-ACEMBLERまたは基準と同様のプログラムで作成された電子のシーケンスを使用しています。
5. -20℃で精製し、検証ドナー、アクセプタとドナー·アクセプター融合を保存したり、80℃アーカイブPLasmids、後で使用するために慎重にそれらの配列（Microsoft Excelのは、FileMaker、他）。

2。複合多重遺伝子バキュロウイルスの生成、増幅およびストレージ

1. DH10ウイルスゲノムを保有する細胞やトランスポゾンTn7転位のために必要な機能に変換することによって、多重遺伝子導入ベクターMultiBacバキュロウイルスゲノムを統合します。 MultibacバキュロウイルスゲノムがトランスポゾンTn7統合を先行する生体内のCre 反応して、独自のloxP部位への関心の特定の遺伝子（YFPマーカー、シャペロンなど）（トランスポゾンTn7結合部位より遠位ゲノムに設計）でプリロードできることに注意してください。 ¹³トランスポゾンTn7移調した後、目的の遺伝子を含む複合バキュロウイルスと細胞は青/白スクリーニング（β-ガラクトシダーゼのα-相補性の喪失に成功トランスポゾンTn7移調結果によって選択されるため、正しいトランスポゾンTn7移調とコロニーが選択的に白のままガーX-galを含むプレート）及びゲノムはアルカリ溶解し、エタノール/イソプロパノール沈殿によって調製される^。5,6
2. トランスフェクションおよび初期ウイルス産生 。滅菌フードに代えて6ウェル組織培養プレート。対数期たSf21昆虫細胞培養物から、説明したように培養培地中で混合精製バキュロウイルスゲノムおよびトランスフェクション試薬を添加することによりウェルとトランスフェクトの細胞のアリコートのうちシード。媒体を除去することにより、48〜60時間後に収穫⁶の初期ウイルス（高品質、低力価ウイルスV _0、ウェルあたり通常3ミリリットル）。新鮮なメディアを補完し、さらに2〜3日後のタンパク質生産（と、YFPマーカーが蛍光について、存在する場合）のためのテスト^。6,7
3. ウイルスの増幅、低MOI養生法 。小（100〜250ミリリットル）三角シェーカーフラスコ撹拌で対数増殖期にある細胞25〜50ミリリットル（1mlあたりの細胞密度は<1×10 ^6個の細胞）を感染させるために、V ₀ウイルスを使用軌道プラットフォームシェーカー上で（ 図3）。細胞をカウントし、細胞が倍加（増殖停止を）停止するまで24時間毎に分割。 （セルあたりのウイルス粒子の感染すなわち番号の多重度）MOI低いレジメン従い細胞を倍増する必要があります（少なくとも）一回（MOI <1）を、そうでなければ、V ₀より小さい音量で実験を繰り返した。通常は、V ₀ 3mlを0.5×10 ⁶細胞/ mlの密度でたSf21昆虫細胞を25mlを感染するために使用される。これは有害な防ぐために必要不可欠である目的の異種遺伝子の損失につながることができるウイルスの過剰増幅と自動削除。細胞をペレット化し、ウイルスを含む培地を除去することにより48-60時間後に収穫V ₁ウイルス（25〜50ミリリットル）。 ^{6、1×10 6個の}細胞ごとに12または24時間を削除しペレット化し、タンパク質の生産とマーカータンパク質（YFP）信号を検証すること。によってYFPとタンパク質生産のための新鮮な培地とテストと補足、（へウイルスを増幅V _2）は、さらに大きいの発現量は、上記の低MOIレジメン（細胞がV ₁と感染後に少なくとも一度は倍増しなければならない）尊重V ₁ウイルスに2 Lシェーカーフラスコで400ミリリットルの細胞にまで感染させることにより目的としている場合。厳密に興味のある遺伝子を含む、もはや欠陥ウイルスの蓄積を避けるためないように増幅中タンパク質の生産とマーカータンパク質シグナルをテストします。各増幅で蓄積^5-7使用細胞ペレットは、関心の発現タンパク質複合体の精製プロトコールを確立するために、既に手順。
4. 生産ウイルスのBIICストレージ 。我々は強く、組換えウイルスの修飾（ 例えば 、目的の遺伝子の損失）を防止し、高発現を維持するために、BIIC（B aculovirus- 私はCエルボをnsect nfected）メソッドを使用して生産ウイルスとしてV ₂ウイルスを保管することをお勧めレベル。増殖停止後の¹⁶ペレット感染細胞を24時間が観察さ-彼らがメディアに（出芽によって）解放される直前に、この段階で細胞が完全なウイルス粒子を含んでいます。液体窒素でメディアや細胞ペレットの凍結アリコートを取り出し、無期限に保管してください^。7,16は

3。タンパク質の生産と下流の処理

1. 大（r）は文化や監視YFPに感染 。生産ラン（通常2 Lフラスコ中の400ミリリットル）のため大きな細胞培養に感染するV _{1、V 2}または冷凍BIICアリコートを使用してください。低MOI養生法（感染した文化が少なくとも一度は倍増するような感染症に使用されたウイルスの音量を調節する）に準拠しています。フラスコの数を乗じて、必要に応じて感染文化ボリュームを拡大します。 YFPマーカータンパク質が存在する場合は、定義された間隔で1×10 ⁶細胞、ペレットを回収し、プラトーインドールを達するまで細胞を溶解し、YFP信号の変化を監視する最大の組換えタンパク質産生をicating。 YFPレベルは、蛍光信号（ 例えばテカンSPECTRAFluor）を記録することのできる標準的な96ウェルプレートリーダーで測定することができる。この段階で細胞を回収。 -20°C（短期）または-80°C（長期）で保存細胞ペレット。
2. 細胞溶解と分別 。あなたの蛋白質の要件（凍結融解、超音波処理、フレンチプレス、他）に合わせて、選択したお好みの方法で細胞を溶解。興味のあるタンパク質の存在のための^5-7分画細胞質と核とテスト。タンパク質精製を簡略化するためにその結果に基づいて精製プロトコールを開発する。あなたのタンパク質が核内に存在する場合、高KClの条件の下で核画分からタンパク質を抽出するために浸漬手続きを適用することを考えてみましょう^。7,18
3. タンパク質精製（マイクロスケール、大規模）。細胞培養のしばしば小さなボリュームが（10または25 ml）のSUであることに注意してくださいバキュロウイルス/昆虫細胞系（L培養物より当たりのタンパク質しばしば10〜100 mg）の中で異種タンパク質の典型高い又は非常に高い生産レベルに起因する関心のあるタンパク質の実質的な量の精製細胞ペレットを得るためのfficient。マイクロ精製（マルチウェルプレート、マイクロチップ法、GEヘルスケアÄKTAmicro系、その他）と一緒に、それはまた、多くの場合、ナノリットル規模ハイスループット結晶化（HTXは、目的のタンパク質との複合体の十分な量の生化学的および活動データを得ることができると）。小さなにおけるイオン交換およびサイズ​​排除クロマトグラフィーと組み合わせて、精製を容易にするために複雑なあなたの蛋白質の露出したサブユニットの金属アフィニティー精製（クロンテックタカラTALON、キアゲンNiNTA金属キレート樹脂）とオリゴヒスチジン（6-10残基）タグを使用することを検討して例えばÄKTAmicroまたは類似少量浄化機（ 図4を使用してボリューム）。オリゴヒスチジンタグや他のタグ（GST、MBP、CBP、他人から選択）との親和性精製に加えて、他のアフィニティ精製工程、イオン交換（IEX）ステップ缶やタンパク質の生化学的特性に応じて、考慮すべきである関心や個々の好みの。浄化効率を高めるために親和性タグで1サブユニットよりタギング以上を考えてみましょう。あなたの精製されたタンパク質複合体を集中し、グリセリンの有無にかかわらず凍結などのストレージ·プロトコルを確立します。今精製タンパク質のバッチ間変動を評価するために（活性アッセイ、生化学的および生物物理学的試験）標準的に適用することができる品質管理基準を開発する。

結果

MultiBacシステムによって達成異種タンパク質の強力な同時発現は、 図1d（懸濁細胞培養物を感染後48時間を取ったプローブ）に示されている。過剰発現したタンパク質のバンドは、全細胞抽出物（SNP）と清澄化ライセート（SN）で明確に識別されています。産生されたタンパク質材料の質と量は、多くの場合、 図1eに示されるように、有糸分裂チェックポイント複合MC...

ディスカッション

図2と図3のビデオスナップショットは多重遺伝子発現のcDNAからロボット支援世代から全体のプロセスを説明すると、タンパク質生産のための昆虫細胞培養の感染にすべての方法を構築します。新しい試薬（プラスミドおよびウイルス）と堅牢なプロトコルは、SOPのに頼ってパイプラインを有効にするために開発されてきた。パイプライン全体は、グルノーブルのEMBL?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bluo-Gal	Invitrogen	15519-028 (1 g)
Tetracycline	Euromedex	UT2965-B (25 g)	1,000X at 10 mg/ml
Kanamycine	Euromedex	EU0420 (25 g)	1,000X at 50 mg/ml
Gentamycine	SIGMA	G3632 (5 g)	1,000X at 10 mg/ml
IPTG	Euromedex	EU0008-B (5 g)	1,000X at 1M
Cre-recombinase	New England BioLabs	M0298
X-Treme GENE HP transfection reagent	Roche	06 366 236 001
Hyclone SFM4 Insect	Thermo Scientific	SH 30913.02
6-well plate Falcon	Dominique Dutscher	353046
2 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357507
5 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357543
10 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357551
25 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357535
50 ml pipette Falcon	Dominique Dutscher	357550
50 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352070
15 ml tube Falcon	Dominique Dutscher	352096
1.8 ml cryotube Nunc	Dominique Dutscher	55005
100 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211917
250 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211918
500 ml shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211919
2 L shaker flasks Pyrex	Dominique Dutscher	211921
Certomat Orbital Shaker + plateau	Sartorius	4445110, 4445233
Liquid nitrogen tank dewar 35 L	Fisher Scientific	M76801
Biological Safety Cabinet Faster	Sodipro	FASV20000606
Optical Microscope	Zeiss	451207
Sf21 Insect cells
Hi5 Insect cells	Invitrogen	B855-02
Tecan freedom EVO running Evoware plus	TECAN
10 μl conductive tips (black),	TECAN	10 612 516
200 μl conductive tips (black)	TECAN	10 612 510
disposable trough for reagents, 100 ml	TECAN	10 613 049
twin.tec PCR plate 96, skirted	Eppendorf	0030 128.648
96 well V bottom, non sterile	BD falcon	353263
96 deepwell plate color natural, PP)	Fisher	M3752M
PS microplate, 96 well flat bottom	Greiner	655101
96 deepwell plate	Thermo scientific	AB-0932
24 well blocks RB	Qiagen	19583
DpnI restriction enzyme	NEB	R0176L	20 U/uL
NEBuffer 4 10X	NEB	B7004S
2X phusion mastermix HF	Finnzyme	ref F-531L
2X phusion mastermix GC	Finnzyme	ref F-532L
DGLB 1.5X	homemade		7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF
High DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10496-016
Low DNA Mass Ladder for e-gel	Life Technologies	10068-013
E-gel 48 1% agarose GP	Life Technologies	G8008-01
Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit	Macherey Nagel	740 708.24
PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract	Macherey Nagel	740 707.2
Gotaq green master mix	Promega	M7113
T4 DNA polymerase, LIC-qualified	Novagen	70099-3
DTT 100 mM	homemade
Urea 2 M	homemade
EDTA 500 mM pH 8.0	Homemade
LB broth (Miller) 500 g	Athena ES	103