プラントの脈管構造の三次元構造と機能を可視化するために、高分解能CTを用いた

要約

高分解能X線CT（HRCT）が3Dで植物の血管系の構造と機能を研究するために使用することができる非破壊画像診断法である。我々は、HRCTは植物組織や種の広い範囲にわたって木部ネットワークの探索を容易にする方法を示しています。

要約

高分解能X線CT（HRCT）が（ 例えば Brodersen ら三次元（3D）で植物の木部ネットワークの構造と機能を評価するために使用されているサブミクロンの分解能を持つ非破壊画像診断法である、2010年、2011年、2012A、B）。 HRCTイメージングは​​医療用CTシステムと同じ原理に基づいていますが、より高い空間分解能で高輝度シンクロトロンX線源の結果と画像取得時間を減少させる。ここでは、Avizoソフトウェアとの組み合わせでHRCT（アドバンスト光源 - LBNLバークレー、カリフォルニア州、米国で実施）（VSG社、バーリントン、マサチューセッツ州、米国）が中の植物の木部を探索するためにどのくらい使われているシンクロトロンベースで詳細に実証切除した組織と生きた植物。この新しいイメージングツールは、ユーザーが従来の静的、2D光または任意の平面で仮想シリアルセクションを使用して電子顕微鏡写真および研究サンプルを越えて移動することができます。任意の方向cのスライスの数が無限同じサンプル、伝統的な顕微鏡法を用いて物理的に不可能である機能で行うこと。

結果はHRCTは草本と木本植物種、植物器官の範囲（ すなわち 、葉、葉柄、茎、幹、根）の両方に適用することができることを実証している。数値は代表プラント血管解剖や海岸レッドウッド（ セコイア ）、くるみ（ クルミ属属）、オーク（ コナラ属のもの）、メープルのためにスキャンを含むHRCTデータセットから抽出された細部の型の範囲の両方を実証する手助けここに提示され（ エイサー属）ヒマワリ（ ヒマワリ ）、ブドウ（ ヴィティス属）、シダ（ ワラビとコモチシダ属fimbriata）への苗木。木本種から摘出し、乾燥させたサンプルは、スキャンして、一般的に最良の画像を得ることが最も簡単である。しかし、最近の改善は（ つまり、より迅速なスキャンとサンプルの安定）それはPOSS作った緑色組織（ 例えば葉柄）にと生きた植物では、この可視化技術を使用してible。機会に水和した緑の植物組織のいくつかの収縮は画像がぼやけてしまいますと、これらの問題を回避するための方法が記載されている。 HRCTでこれらの最近の進歩は、プラント血管機能に有望な新しい洞察を提​​供します。

概要

相互接続された導管は、繊維、生活、代謝活性を有する細胞のネットワーク - 水は植物の根から木部と呼ばれる血管組織内の葉に輸送される。植物の木部の輸​​送機能は、光合成、成長し、最終的には生存のために葉に栄養分と水を供給するために維持されなければならない。木部ネットワークが病原性微生物によって感染されるとき木部導管内の水輸送が停止することがあります。このような感染症の植物への応答であることが多い（; 2010 例えば McElroneら2008）病原体の広がりを単離するための手段として、ゲル剤、ガム、およびチロースを生成します。干ばつストレスも木部の水輸送を制限することができます。植物が長引く​​干ばつ時の水を失うように、緊張が木部樹液で構築されています。緊張下に水が（ すなわち 、特定のしきい値にテンションが木部導管体に含まれる水分の列をキャビテーションのに十分大きくなる）準安定である。キャビテーションが発生した後、気泡（塞栓症）は、condを形成し、埋めることができますUIT、効果的にブロックして水の動き（タイリーとスペリー1989）、深海ダイバーにおける減圧症（ すなわち、 "曲がる"）に類似現象。

このトピックに関する歴史と現代文学（タイリー·ツィンマーマン、2002;ホルブルックら 、2005）の広大なボディにより実証されるように最適な植物関数の木部水輸送の重要性にもかかわらず、とらえどころのないまま木部ネットワークの局面がまだあります。いくつかの研究グループは、最近、細かい木材解剖学の詳細や血管組織（ 例えばメイヨーらを評価するために高分解能X線CTマイクロトモグラフィー（HRCT）を利用し始めて、2010年、2008;マネスら2010;。Brodersenら2010。 、2011、2012A、B;前田、三宅、2009;草原ら、2004）。 HRCTはソリッドオブジェクトの内部の特徴を可視化し、その3次元構造特性に関するデジタル情報を取得するために使用される非破壊法である。 HRCTでも高密度オブジェクトに対して、サイ​​ズがミクロンのような小さな細部を解決する能力に従来の医療のCATスキャンとは異なります。シンクロトロンHRCT技術における最近の進歩は、充分に植物の血管網とintervessel接続が可視化できること対雑音比が改善された画像の解像度と信号があり、割り当てられた3次元座標、油圧モデルシミュレーションのためにエクスポート。 Brodersen ら （2011）は最近、自動的に従来の解剖学的方法（シリアルすなわちミクロトームで切片とこれまで可能であったよりもはるかに高い解像度で木部ネットワークからデータを抽出し、FortranのモデルとシンクロHRCTによって生成された3D再構成を組み合わせることで、このテクニックを進め光学顕微鏡で、画像キャプチャ、 例えばツィンマーマン1971）。この作品はまた、いくつかのVeの木部システムの油圧モデルと輸送の特定された固有の特性（ すなわち、逆の流れを最適化するために使用されているピーク蒸散の期間中ssels）（Lee ら 、レビューで）。

シンクロトロンHRCTは現在木部機能、キャビテーションに対する感受性、および塞栓導管を修復する植物の能力を視覚化するために使用することができます。塞栓導管内の再確立の流れに障害が発生すると、油圧能力、限界の光合成、極端な場合には植物の死の結果（マクダウェルら 2008）が軽減されます。植物は、隣接する機能導管を介して接続するピットの閉塞の周りの水を流用して、失われた油圧能力に代わる新しい木部を成長させることにより塞栓に対処することができます。いくつかの植物は水の列の切れ目を修復する能力を持っているが、緊張下の木部のこのプロセスの詳細は、何十年も不明であった。 Brodersen ら （2010）は最近、可視化とHRCTを使用してライブブドウの補充プロセスを定量化した。詰め替え成功した容器は、キシルを取り巻く生細胞からの水の流入に依存していたemの個々の水滴が時間の経過とともに拡大導管、いっぱい血管、閉じ込められた気体の溶解を余儀なくされた。さまざまな植物の能力が損なわ木部血管を修復すると、これらの修理を制御するメカニズムは、現在検討されている。

ALSのビームライン8.3.2施設の説明

これまでの我々の仕事は、ローレンス·バークレー国立研究所（バークレー米国カリフォルニア州）での高度な光源で硬X線マイクロトモグラフィービームライン8.3.2で行われている。植物試料は11.5 keVの重要なエネルギーで高度な光源電子蓄積リングの運転中に双極子6テスラ超電導曲げ磁石によって生成され、X線源から20メートルの場所に位置し、鉛ライニングハッチ内に配置されます。エンドステーションの概略を図1に示します。 X線は40倍のビームサイズ〜4.6ミリメートルとハッチを入力し、電動回転ステージ上に載置された試料を通過します。ザ透過したX線画像収集用のCCDにレンズを介して中継される可視光にX線を変換結晶シンチレータ（一般的に使用される2つの材料がLuAGまたはCdWO _4アール ）に衝突。カメラ、シンチレータと光学系は、サンプル·ツー·シンチレータ距離が位相コントラストイメージングのために最適化することができますレールの上で光タイトボックスに含まれています。

すべてのサンプルは、順番に、試料の位置決めのための水平方向および垂直方向の変換ステージに搭載されている直径10cm回転ステージ上に搭載されている。カスタム構築された植物のポットホルダー、アクリル管に含まれる葉に搭載された根系を持つ生きた植物試料は、 図2で見ることができます。典型的な露光時間は、秒10から18 keVの使って0.1から1の範囲で指定でき、スキャンの持続時間は、特定のサンプルのために最適化した設定に応じて5から40分の範囲であろう。背の高いサンプル（植物の木部·ネットワークの典型的な例）、データスキャンができるため〜10cmの最大試料高さに沿ってシームレスな連続切片を可能にする、自動制御され、異なる高さでのサンプルで測定を繰り返すことで、タイル張り。 4.5μmの分解能でイメージングは​​、縦向きでほぼ完璧なサンプルについて〜1cmで最大サンプル幅。データの生成と処理は、以下に記載されているプロトコルを使用して完了します。なぜなら空気と水の間のX線減衰の違いのため、優れた画像コントラストは医療用CTシステムの典型的なコントラストのソリューションを使用せずに植物を得ることができる。空気で満たされた血管内腔は、水和した植物の周囲の水で満たされた組織から容易に区別される。

プロトコル

以下に記述されているプロトコルの詳細は高度な光源8.3.2ビームラインでの仕事のために特別に書かれたものです。適応は、他の放射光施設での仕事のために必要となる場合があります。適切な安全性と放射線のトレーニングは、これらの施設を使用するために必要です。

1。生きている植物のためのサンプル調製

1. 〜直径10cmの鉢に植物を育てると、主茎（またはスキャンされる植物の部分）のように縦にポットの可能性と志向で中央に配置されていることを確認します。高度な光源の限界でHRCT楽器ハッチの物理的な寸法は、高さ約1mに植物を生きています。結果として、生きている植物のイメージングが最高の小さなポットで栽培苗/苗木上で実行されます。実験に応じて、さまざまな土壌タイプ（干ばつ実験などで）土壌水分量を制御するために使用することができ、柔軟なシュートを持ついくつかの植物（ 例えばブドウ）のために長いシュートは慎重tuのことができます後述のアクリルチューブにcked（ 図1および図2を参照）。
2. カスタムメイドの剛性アルミポットホルダーでライブ鉢植えをマウントします。天板高さは鉢の高さの範囲に対応するように調整することができます。プレートの上部は、土壌表面の上部に合わせ、2つの部分の板の中心からの植物が突出するように設計されている。ポットホルダーの目的は、植物の茎、振動やサンプルモーションを最小限にするために所定の位置にしっかりと保持されていることを確認することです。スキャン中にサンプルモーションを最小にすることが不可欠です。
3. いったんホルダーに取り付けられた、事前スキャンに対する植物の生理状態を決定するために、それぞれScholanderスタイル圧力室またはクリップオンリーフポロメーターを用いて幹の水ポテンシャルや葉の蒸散を測定します。
4. 植物の上やアルミニウム工場ホルダーの上に薄い壁のアクリルシリンダーを置き、安定させるために粘土パテで固定しサンプル（ 図2）。上部の葉のいずれかの振動や動きは幹を下に伝達され、スキャンされたエリア内の植物組織は、最終​​的に画像の歪みにつながる、移動させることになります。シリンダーは、植物の葉が含まれていると、スキャン時の振動をもたらすハッチ内の他の機器擦れ植物の葉を防ぐために使用されます。追加のプラスチックラップ、ペーパータオル、テープがさらに植物の部分（ 図4のサンプルの動きに関連する問題を参照してください）の振動や動きを最小限にするために使用されるべきである。その機能を実行するために十分な剛性を維持しつつ、そのX線吸収を（与えられた露光時の画質を低下させることができる）を減少させるために、含まれているシリンダーは、できるだけ薄い壁を有している必要があります。
5. エアベアリングステージにカスタムポットホルダーを取り付け、X線源とイメージングセンサとカメラ機器との間で所定の位置に（ネジ）をロックします。 Positiサンプルを確保するために、磁気チャックベースで可能と中心として垂直などの幹に回転する間に視野内に留まります。

2。フレッシュ切り出し、植物組織のためのサンプル調製

1. 新鮮な植物材料、一般的に茎や葉柄、生植物から即時に除去した後にスキャンすることができます。実験の目的は、木部ネットワーク全体を可視化することである場合には、血管内の水が空気と排気し、交換する必要があります。これを行うには、Scholanderスタイル圧力室に試料をマウントして、約5分間、低圧（<0.05メガパスカル）で試料を通る圧縮空気または窒素を押してください。種は、血管網を避難させるために必要な時間が異なります。意図は、新鮮な植物組織における塞栓形成の程度を評価し、新鮮なカミソリの刃を用いて植物から次に消費税サンプルと水中で切り傷を作ることである場合。
2. PRにパラフィルムの層でサンプルを包むスキャン中にイベントの乾燥。
3. エアベアリングステージにねじ込まれている金属板に固定し、ドリルチャックに試料をマウントします。中央と東洋は、垂直などのサンプルを確保するために、上記のサンプルでは、​​視野の中に残っています。

3。干し木質組織のためのサンプル調製

1. 最適な組織試料の可視化と画像コントラストのために、それは徐々に全体の木質組織試料を脱水する必要がある。長さは約6cmにサンプルをカットします。ターゲットとスキャン領域で可能な限りまっすぐにされているサンプルを選択し、≤1cmの直径を有する。
2. 徐々に組織の任意の亀裂や分裂を引き起こすことなく、サンプルを乾燥させるために低温で乾燥オーブンに木質組織サンプルを入れます。このプロセスは、種や組織間で異なる可能性があります。木質茎については、40℃のオーブン中で12時間は、通常、かなりの茶を発生させることなく、優れたコントラストを提供するのに十分であるステムの物理的な構造でNGES（ 図3で示した急速乾燥の問題を参照してください）。
3. いくつかの状況では、走査型電子顕微鏡を使って後続の解剖と視覚化はHRCT画像内の特定のポイントに配向させることができるようなサンプル内の受託者マーカーを有することが望ましい。これを行うには、接辞金属やガラスビーズまたはパラフィルムを用いて幹の外側にワイヤー。もう一つの方法は、（Brodersen ら 2010年の例を参照）は、単一の木部導管に注入することができるシリコーン樹脂（ 例えば 、RTV-141、ブルースターシリコーン、イーストブランズウィック、ニュージャージー州）を使用することです。一度硬化し、シリコーン樹脂は、試料中にはっきりと見えて簡単に他の空気で満たされた容器とは区別される。正確にサンプルの特定の領域を見つけるには、このマーカーを使用します。
4. 上記のようにドリルチャックとセンター内のサンプルをマウントします。

4。リーフTissuのためのサンプル調製2次元（2D）X線写真のためのe

1. ほぼリアルタイムで葉における容器の内容を可視化するために、葉は歯科用X線に似た2D X線像を生成するためにスキャンすることができます。薄いアクリルプラスチックの2枚の間に葉をマウントして、クリップで端を固定します。その後、光学ブレッドボードは、イメージングシステムとX線源の隣にポストホルダシステムと位置に取り付けられたサンプルを添付。

5。 8.3.2ハッチで試料を走査

1. あなたのアプリケーションのために最善に動作する倍率を決定します。 ALSのビームライン8.3.2 2倍、5倍、10倍との倍率のレンズを使用してスキャンする機能があります。それぞれ画像の画素の大きさ4.5、2.25、0.9μmの中でこれらの結果。視野が増加倍率で減少すると倍率に応じて、サンプルは、適切なサイズでなければなりません。カメラとレンズの選択の詳細は、 表1に得られた画像パラメータを参照してください。

	PCO.4000（4008x2672）		PCO.Edge（2560x2160）（OPTIQUEピーター）
レンズ	ピクセル（μm）と	視野（mm）の	ピクセル（μm）と	視野（mm）の
10倍	0.9	3.6	0.65（0.69）	1.7（1.7）
（4x）の5倍	1.8	7.2	1.3（1.72）	3.3（4.4）
2倍	4.5	18	3.25（3.44）	8.3（8.8）
1X	9	36	6.5（ - ）	16.6（ - ）

表1。4964908詳細ALSは8.3.2でカメラやレンズ。

2. X線エネルギーは15 keVで設定します。これは、（Brodersen ら 2010、2011、2012A、B参照）、ほとんどの植物のアプリケーションのための優れた画像のコントラストを提供することが示されている。露光時間は、一般的に100〜1,000ミリ秒の間の範囲の試料の厚さと密度（したがって倍率が使用される）に依存しています。長い露出時間（限り、検出器の画素が飽和していないとして）は、一般的に対ノイズ比が高い信号につながるが、増加したスキャン時間を犠牲にします。
3. アプリケーションに適した角度の増分を選択してください。サンプルは、スキャン中に180°回転し、回転中に撮影した画像の数は、データセットのサイズ、スキャン間隔の長さと、最終的な画質に大きく影響することがありますが、一般的に品質の戻りが減少している。典型的なスキャンはスキャンごとに721の画像が得られ、0.25°単位で行われます。 incremenを下げる細かい詳細を可視化するためのより良いイメージで0.125°結果にトンが、こうして収穫1440の画像、より大きなデータセット（関心のある一般的な地域のために、この手段〜データの10〜30ギガバイト対5ギガバイト）。しかし、信号対雑音比は、しばしば改善され、増加したスキャン時間とデータサイズの両方の価値がある。スキャン中に変形/縮小しにくいドライ茎を損なうことなく、より長い間隔（小さい角度インクリメント）に供することができる。生物学的プロセス（ 例えば、塞栓修理）短いスキャン間隔を選ぶ、短い時間スケールで起こる画像の生きている植物は、この上のX線放射の潜在的な有害な影響を制限する方が好ましい場合、組織が ​​、これは潜在的な損失に来る画質。短いスキャン間隔は、画像がキャプチャされながら、試料を連続的に回転している間、連続断層撮影の設定を使用して達成することができる。
4. スキャンごとに、 "明視野"と "ダークフィールド"の画像はcorrecteでなければなりませんD。明視野画像は、ビーム内のサンプルの無いイメージです。これらは多くの場合、水平方向のサンプルを変換することにより、サンプルのスキャンの前と後に収集されます。ダークフィールドが、これはシャッターカメラがないX線を示している信号の量を測定したX線閉鎖によって収集されます。

6。データ処理

1. 収集コンピュータからファイルサーバーに、データ処理用コンピュータに輸出された "生"の2D。TIF画像を転送。コンピュータに十分なRAMがある場合、データは、いわゆる "RAMドライブ"（RAMの一部は、コンピュータ上のハードドライブとして表示されます）にコピーすることができます。このようにソフトウェアは、ソリッド·ステート·ドライブまたはフラッシュメモリに比べて比較的遅い回転のハードディスクドライブにアクセスする必要はありません。このステップでは、大幅にデータセットを処理するのに必要な時間の量を減らします。
2. 画像は、透過率のスケールに変換する必要があります。ビームライン8.3.2カスタムBAを持っているckground正規化プラグインは自由に利用可能なソフトウェアパッケージはImageJまたはフィジー（でダウンロードして使用することができhttp://fiji.sc/ ）。これは、画像からダークカウントを減算し、透過率を示す画像を生成するために明るいフィールドで、サンプル画像を正規化します。タコのソフトウェアパッケージ（に正規化されたイメージをロードhttp://www.inct.be/en/software/octopus ）と指定された処理の手順を実行します（画像を正規化、リングの取り外し使用して、2D生。TIFファイルから3Dデータセットを"再構築" 、サイノグラムの作成、パラレルビーム再構成）。このプロセスは、その後。TIFを横（断面） "ボクセル"（体積画素要素）、X線線吸収係数を表すx、y、z座標と強度値を使用して各成る一連の画像が得られます。

7。可視化

1. Visualiソフトウェア·パッケージの様々な1の画像のスタックをzeを。フリーウェア（ 例えば Drishti、 http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtmlは ）ボリュームまたは個々の、または画像のスタック（ 例えば ImageJのか、フィジー）を可視化するために使用することができます。他のソフトウェアパッケージは、3Dビジュアライゼーションに使用することができます。我々の研究グループでは、Avizoソフトウェアパッケージ（使用http://www.vsg3d.com/avizo/overviewを ）が、そのようなアミラ（などの他http://www.amira.com/ ）とVGStudioMax（ のhttp://www。 volumegraphics.com /が ）も一般的に使用されます。
2. システムメモリにデータセットをロードし、仮想縦横、またはラジアルスライスの向きでサンプルを表示します。なぜなら、データセットの3D属性、samplを通じて仮想スライスeは、関心領域、従来のシリアル光顕微鏡（詳細な例については、1から3作品を参照）を超える大幅な改善と整合する任意の平面で回転させることができます。
3. 3Dで必要に応じてサンプルを視覚化するために、 "セグメント"周囲の組織から血管内腔または他の構造を分離するためにAvizoで半自動とマニュアルした様々なルーチンを使用したサンプル。セグメンテーションは、このように別々の領域にそれらを分離またはセグメント化、興味のあるオブジェクト間の境界を定義することを指します。 3Dのレンダリングのボリュームが可視化ソフトウェアによって実行されます。排出量と吸収量と色は "カラーマップ"を使用して定義することができ、与えられた方向における投影結果であり、これを行う一つの方法は、ボリューム内の各ポイントが発すると光吸収するものと想定されている直接ボリュームレンダリングであり、画面に表示される。あるいは、セグメント化された境界を表すワイヤーフレームまたは3Dメッシュ面はトンの3Dモデルを表示するように構成されている興味のある彼は、構造。 3Dメッシュ、ポリゴンの要素で構成され、要素の総数は、構造再現の忠実度と関連するデータ·ファイルのサイズ（複数の要素、 すなわち 、より高い忠実度が、より大きなファイルサイズにつながる）の両方に影響を与えます。画像処理モジュールは、さまざまな可視化ボリュームレンダリング出力を制御するためのソフトウェアと同様に、画像の明るさ、コントラスト、透明度、ノイズリダクションなどのコントロールで使用可能である、

8。定量化

1. セグメンテーションが達成されたら、それは例えば、水、空気などのボリューム、長さ、幅、存在下または非存在下で標的植物構造や機能的変化を定量化することが可能である、Brodersen ら （2010）は、定量化するAvizoソフトウェアを使用人づて詰め替え容器内の水滴の体積変化。植物はラ時間を作る四から八時間を超える30分ごとにスキャンされた詰め替え容器のPSEのシーケンス。各スキャンはそのボリュームが増加するにつれて、個々の液滴を経時的に測定したAvizoへと再構築され、ロードされました。

結果

Synchotron HRCTスキャンが正常にビームライン8.3.2（ 図5）を用いて植物組織や種の多種多様な上に実装されており、3Dで前例のない解像度で植物の木部の構造と機能に新たな洞察を提供してきました。 3D再構成（、 図6-8に示す、そして作品1-3）が提供する可視化と探査能力は両方摘出試料上と生きた植物における木部ネットワークとの構造の位置と方向の?...

ディスカッション

Synchotron HRCTは信じられないほど詳細に植物脈管構造の内部の仕組みを探求するための強力な、非破壊ツールで植物学者が用意されています。この接続性が大幅に広がる血管の病原体や塞栓の能力を変えることができる-この技術は差動で、様々なブドウの種（。マスコミでBrodersen ら 2012b）に木部のネットワーク接続を変更するブドウの木部に以前に記述されていない解剖学的構?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2