RNAを<em&gt;その場</emホールマウント胚および細胞組織学で&gt;ハイブリダイゼーションは、海洋軟骨魚類に適合した

要約

RNAのホールマウントするための方法を組み合わせることにより、その場でハイブリダイゼーションおよび組織学は、遺伝子発現は、発生中の胚での細胞運命決定とリンクすることができます。これらの方法は、軟骨魚類、海洋に適応し、生物医学、毒物学と比較研究のモデル生物として、これらの動物の使用を容易にされてきた。

要約

彼らは適応免疫を持っていると浸透圧調節^1-3ユニークなメカニズムを持っている最も原始的な脊椎動物であるため海洋軟骨魚類は、生物医学やゲノム研究のための動物モデルを高く評価しています。ペアリング付属で最も原始的な有顎脊椎動物 - として、軟骨魚類は特に進化と発展の研究のために、進化的に重要なモデルです。海洋軟骨魚類はまた、気候変動⁴との関係における、水生毒性とストレス生理学を研究するために使用されてきた。このように、方法論の開発と適応は、複数の生物学的分野にこれらの原始脊椎動物の使用を容易にし、拡大するために必要とされる。ここで私は、in situハイブリダイゼーションおよび軟骨魚類における遺伝子発現と細胞組織学を研究する組織学的技術で RNA全体のマウントの良好な適応を示す。

遺伝子発現を監視することは発達BIOLの顕著なツールですogists、広く発達過程^5を調査するために使用されています。 in situハイブリダイゼーション 、RNA全体のマウントは、発生中の胚の組織における特定の遺伝子の転写産物の可視化およびローカライズすることができます。遺伝子のメッセージの発現パターンは、遺伝子が制御してもよいものを発達過程と細胞の運命決定への洞察を提供することができます。異なる発達段階での遺伝子の発現パターンを比較することで、洞察力は開発中の遺伝子の変化をどのように役割に得ることができる。

現場の中で全体のマウントは、組織に遺伝子発現をローカライズするための手段を提供していますが、組織学的技術は、分化した細胞の種類や組織の識別を可能にする。組織学的染色は、様々な機能を持っています。一般的な汚れはそれぞれ、核と細胞質の染色のための一般的な例では、ヘマトキシリン​​とエオシンのために、細胞の形態を強調するために使用されています。その他の汚れは、特定のセルを強調表示することができますタイプ。たとえば、この論文で報告されているアルシアンブルー染色はmucosaccharidesを識別するために広く使われている染色カチオン性である。アルシアンブルーで、消化管の染色はmucosaccharidesを生成杯細胞の分布を識別することができます。短いペプチドでmucosaccharide成分の変動は、消化管⁶内に関数では杯細胞を区別する。 その場 'sと同時に組織化学的方法で RNA全体のマウントを使用することにより、細胞の運命決定は、遺伝子特異的発現にリンクすることができます。

RNAはその場 'sと組織化学で広く研究者によって使用されているが、海洋軟骨魚類での適応と使用が限られており、様々な成功を達成しました。ここで私は軟骨魚類のために開発され、私の研究室で定期的に使用されるプロトコルを提示します。 その場でのハイブリダイゼーション法における RNAのさらなる改変が異なる種に適応するために必要であるかもしれませんが、プロトコルはここでpを説明その科学的な問い合わせに海洋軟骨魚類の使用を適応したい研究者のための強力な出発点をrovide。

プロトコル

海洋軟骨魚類におけるin situハイブリダイゼーション I. RNAのホールマウント

1。胚の固定と準備

1. スケート胚はバラード⁷に従ってステージングできます。遺伝子発現の検出のための最適な段階は、関心のある組織に依存します。スケートの消化管における遺伝子発現を追跡するには、ステージが27から30まで⁷最適です。
2. 卵黄嚢から胚を分離し、PBSに胚を解剖する。
3. 4℃で50 mlコニカルチューブ℃の穏やか揺らしながらで作りたて4％パラホルムアルデヒド（PFA）30mlに修正しました。 24時間を修正しました。
4. 室温で回転し、15分間ずつ2回、PBTで胚を洗浄します。 現場の中の RNA全体のマウント用のすべてのソリューションレシピは（ 表1）が含まれています。
5. 室温でのPBTロッキング：25％、50％および75％メタノールメタノールシリーズで洗浄することにより、胚を脱水する。洗浄の持続時間は、胚の段階に依存します。プリnのeurulationは、胚を上演し、メタノールシリーズの各洗浄の5分で十分です。ステージ30歳以上の胚については、洗浄は30分まで持続できる。胚が十分に浸透し、各洗浄に順応しているかどうかを判断するには、あなたの手で直立管を保持します。胚はチューブの底に沈む場合は、次の洗浄のための準備が整いました。胚は、ソリューションの最上部に浮遊する場合は、ソリューションを変更し、その特定の脱水工程を繰り返します。
6. 優しく揺れて10分間、100％メタノールで2回洗浄する。
7. 100％メタノールに一度脱水し、胚はプロトコルに進む前に、少なくとも24時間、-20℃で保存してください。胚は正常に-20℃で保存し、最長1年間、RNA全体のマウントに使用されている。

2。 RNAプローブの合成

1. 発現検出したい遺伝子の線形フラグメントを生成します。これは、PCR増幅したり、遺伝子とプラスミドを線形化することによって行うことができます興味のある。 PCRにより増幅するために、その結​​合部位は脇腹遺伝子が増幅された領域でRNAポリメラーゼ結合部位を挿入して保持するプライマーを選択します。例えば、PBSまたはたpGEM、M15フォワードおよびリバースプライマーとして一般的に使用されるプラスミドに理想的です。あるいは、遺伝子の5 '末端で切断する酵素でキアゲンミニプレップDNAの15μlを消化することにより、プラスミドを線形化します。ゲル抽出し、適切なをQIAquickキットを使用して精製する。
2. 適切なRNAポリメラーゼ（転写反応については、 表2を参照） を使用して、テンプレートとしてPCR産物の線状プラスミドまたは100 ngの8μlを用いてRNAプローブを逆転写。
3. 37℃で2時間逆転写反応℃でインキュベート
4. 反応を確認するために、1％アガロース/ TAEゲル上の転写反応液1μlを実行します。色素がちょうどゲルに実行されるまで100 mVoltsでゲルを実行します。シングル著名なバンドが見えるはずです。直鎖状DNAテンプレートのフラグメントは、より高いmolecuでかすかに見えるかもしれませんLAR重量。
5. 15分間37℃で転写反応とインキュベートするRNaseフリーDNアーゼIの1μlを添加する。
6. 沈殿物に、少なくとも60分または一晩-20℃で100μlのTE pHを8、10μlの4 M LiClを、300μlの100％EtOHを、インキュベートを追加します。
7. 14,000 rpmで4℃フュージで10分間スピン。
8. 70パーセントEtOHと乾燥した空気でペレットを洗浄します。
9. のdH _{2 O20μl}に再懸濁し、RNAプローブハイブリダイゼーション緩衝液80μlの（ハイブリダイゼーション緩衝液を70℃に予め温めなければならない）を追加します。プローブは-80℃-20℃以上℃で数ヶ月間、80％のハイブリダイゼーションバッファーに格納することができます

3。胚前処理およびハイブリダイゼーション

1. -20℃から100％メタノールに格納されている胚を取り除く若い胚の段階（3.2）に進みます。後で胚（ステージ30分の29 <）を上演するためには、胚の体から '持ち上げ'した表皮層が表示される場合があります。顕微鏡下で、慎重にディスプローブの浸透を最大にするために表皮層をオフにECT。
2. きれいなガラスシンチレーションバイアル中に胚を置きます。上記の記述逆メタノールシリーズの胚を再水和：（75％、50％、25％メタノール：PBT）を室温で5〜30分ごとに穏やかに、各溶液を揺動することによって。 10分ごとに、PBTの2回の洗浄、優しく揺れとの完全な水分補給。
3. ロッキング、室温で1時間、PBTで6％の過酸化水素と任意の顔料、漂白剤の胚を削除します。
4. PBT樹脂、（室温で揺らし、10分ずつ）で3回洗浄することにより、過酸化水素を除去。
5. ハイブリダイゼーション中のプローブの浸透を可能にするためにプロテイナーゼKで胚を扱う。プロテイナーゼKの量と治療期間は、調べたい組織および胚の年齢により異なります。深部組織と年上の胚は、より高濃度と長期の治療を必要としながらティムより表面組織と若い胚は、短く、少なくプロテイナーゼKを必要とする完全にプローブハイブリダイゼーションのために胚を透過する電子。例えば、ステージ29のスケート胚の腸内胚葉にShhのを検出するために、プロテイナーゼK / PBTの30μg/ mlのを室温で20分間インキュベートする。
6. 迅速プロテイナーゼKを洗い流すPBTで胚をすすぐ
7. 優しく揺らし、20分間PBTで4％PFA、0.2％グルタルアルデヒドでプロテイナーゼK、postfixの胚を失活させた。
8. PBTで10分間2回洗浄する。
9. 1. プレハイブリダイゼーションのために、それらをカバーするだけの十分な胚に予熱したハイブリダイゼーション溶液を2-3 mlを加える。 1時間70℃で加熱した水浴中で穏やかに揺らし。
   2. ℃で10分間、氷上でクール用の70にハイブリダイゼーション溶液、予熱RNAプローブを調製した。 0.5から1.0μg/ mlの最終濃度を得るために、新鮮な予熱したハイブリダイゼーション溶液2mlにRNAプローブの15〜20μlを希釈します。プリhybe取り外し、胚に希釈したRNAプローブを追加します。胚はちょうどソリューションによってカバーされるべきであり、DDよりハイブリダイゼーション溶液、必要に応じて。シンチレーションバイアルの蓋をしっかりと安全。 70℃で一晩加熱水浴中で優しく揺れによってハイブリダイズする。

4。ハイブリダイゼーション洗浄および抗体ハイブリダイゼーションを投稿

1. 新鮮なシンチレーションバイアルまたはエッペンドルフチュー​​ブ内胚および場所からのプローブとのハイブリダイゼーション溶液を除去します。プローブは-20℃で保存し、将来的に再利用することができます。ハイブリダイゼーション後の洗浄については、Netwe​​llで開催胚は6ウェル組織培養プレートに固定してください。
2. 70℃ロッキングあらかじめ温めておいた解決策＃1、℃で30分間ずつ3回洗浄する
3. 70℃ロッキングあらかじめ温めておいたソリューション＃2、℃で30分間ずつ3回洗浄する
4. 室温でロッキングTBSTで5分間それぞれに対して、3回洗浄する。
5. 室温でロッキング1時間TBSTで10％の熱不活性化ヒツジ血清との事前ブロック。
6. Netwe​​llから新鮮なガラスシンチレーションバイアルに胚を移します。抗DIG追加胚から1％熱不活性化ヒツジ血清/ TBST中のFab断片（1:5,000）。 4℃で一晩揺する

5。ポスト抗体のハイブリダイゼーションの洗浄

1. 抗体を取り外して廃棄します。洗浄のために戻ってNetwe​​llに胚を置きます。
2. 室温で揺らし、TBSTで5分間ずつ3回洗浄する
3. 室温で揺れ、1時間ごとに少なくとも6回洗浄する。
4. 4℃で揺らし、TBSTで一晩洗うポスト抗体の洗浄は、バックグラウンド染色を削減する手助けとして、洗浄の回数と期間を最大にすることが望ましい。胚は、日常的に、週末に、4℃TBSTで洗浄する。

6。プローブの検出

1. 新鮮NTMTソリューションを構成すると殺菌フィルタ。
2. きれいなガラスシンチレーションバイアル中TBSTで洗浄溶液と場所の胚を破棄します。室温、ロッキングで10分間ずつ新鮮NTMTで胚を3回洗浄します。
3. NTMTが反応混合物を洗い、追加、削除の1つのx NTMTでNBT / BCIP×1。これらの反応は、光に敏感であるため、室温で箔と岩のシンチレーションバイアルをカバーしています。
4. 所望の遺伝子発現がはっきりと見えるようになるまで色反応を15分ごとに監視します。強力なプローブが開発し、わずか10分かかる場合があります。弱いプローブは、1〜2時間かかる場合があります。 （全胚が鈍い紫や茶色の色を回すために開始されます）表示され始めます反応が長すぎるか、またはバックグラウンド染色のために行かせていない。
5. 室温、ロッキングでPBTで10分間ずつ2回洗浄する。
6. 4％パラホルムアルデヒドでPostfixの胚を、室温で1時間0.1％グルタルアルデヒド。胚は4℃で固定で無期限店することができます
7. 解剖顕微鏡で胚を視覚化します。プリハードン1％アガロース/ PBSでシャーレ内の写真、場所胚の水色の背景を生成します。

7。海洋軟骨魚類におけるin situハイブリダイゼーション I. RNAのホールマウントするための代表的な結果

スケート胚におけるソニックヘッジホッグ（Shh）とHoxa13の in situの描いた表現における RNA全体のマウントは、 図1に示されている。高等脊椎動物におけるShhの発現は脊索と腸内胚葉で発見されており、この発現パターンは、スケート（ 図^1a）8,9に保存されている。海洋軟骨魚類は塩を分泌するように直腸腺を使用浸透圧調節のユニークな方法を持っています。Hoxa13式が開発直腸腺（ 図^1b）10で高い。パターニングにおけるHoxa13遺伝子産物の役割直腸腺は不明のままです。

Ⅱ。軟骨魚類の組織を埋め込むとパラフィン切片

1。ティッシュの収穫と準備

1. 所望の組織を解剖し、室温で揺らし、24から48時間、10％ホルマリンで固定してください。 4％パラホルムアルデヒド（PFA）も固定剤として使用することができます（説明を参照）。
2. 30分ごとに、PBSで3回洗浄することにより、固定液を洗い流す。組織の規模に応じて、洗浄時間は10分に減少させることができるか、または1時間に増加した。
3. 室温でPBSロッキング：25％、50％および75％エタノールのエタノールシリーズで洗浄することにより、胚を脱水する。繰り返しになりますが、各洗浄のための時間は、組織の大きさに依存します。 0.5センチメートル³組織については、15分間各洗浄インキュベートする。大きな部分の時間を増やす。組織の長期保存が必要な場合は、最長1年までは、-20°Cで75％エタノールとストアに追加の2回洗浄する。そうでなければ次のステップに進みます。
4. さらに揺らし、15分ごとに100％エタノールで3回洗浄することにより脱水する。

2。埋め込みとパラフィン切片

1. スクリューキャップの蓋付きガラスシンチレーションバイアルに5分間ずつキシレンで2回洗浄することによって組織を明確にする。キシレンは、組織がもろくレンダリングされ、そのようになったため、10分の合計を超えていないHESの。あなたが光にそれを保持するときに組織が半透明になっているはずです。組織が2回洗浄した後も非常に不透明である場合、プロトコルに進み、5分間キシレンに追加の洗浄を行うと。手袋をヒュームフード内キシレンのみを扱う。
2. キシレンを除去し、溶融パラフィンで2月3日フルシンチレーションバイアルを埋める。 30分間、60℃のオーブン中でインキュベートする。バイアルにパラフィンを入れたら、パラフィン、バイアルの側面に沿って固めることがわかります。オーブン内にバイアルを置き、パラフィンが数分間再溶解することができます。オーブンからバイアルを取り出し、その溶液をインキュベーションの残りのためのオーブンで混ぜると交換するクイック渦を与える。
3. パラフィンのインキュベーションを30分間2回繰り返します。
4. 時間ごとに倍パラフィンでインキュベートする。パラフィンの最終時間を変更して、60℃のオーブンで一晩インキュベートする。
5. 次の日、2〜3時間真空下で加熱されたパラフィン浴室及び場所に組織を置く。これは、組織の中にパラフィンの浸透を容易にし、気泡を除去します。薄い組織のタイプによっては、真空工程が必要とされないかもしれないが、それは全体の胚または消化管および管腔の区画を持つ他の臓器のために必要である。
6. 後、氷板の上に溶けたパラフィンで金型の組織、場所の組織の浸潤、およびクール真空促進。金型から組織を除去しようとする前に氷上または4℃で一晩にしておきます。組織のパラフィンブロックは、4℃で無期限に保存することができます
7. 場所はパラフィンミクロトーム上にブロックと8μmの切片を切った。セクションは、48℃に加熱した水浴に浮かべ、ガラスSuperfrost * Plusのスライドにマウントする必要があります。
8. 37℃のオーブンで一晩乾燥したスライド。
9. 必要に応じ°Cまで4で保存セクション。

Ⅲ。アルシアンブルー/核ファーストレッドは軟骨魚類の組織の染色

1。アルシアンブルーは、ムチンのために染色

1. 場所は暖かいスライド上に上向きにセクションと摺動する。 45分間溶融。
2. スライドホルダーにス​​ライドを配置します。すべての後件ソリューションはヒュームフード内桶に含まれています。スライドは別の解決策と1浴槽からそれらを転送することにより洗浄する。浴槽内の溶液濃度はスライドをカバーしていることを確認し、スライド上の組織が完全に水没しています。 5分ごとにキシレン中でスライドを2回洗浄することによりパラフィンを溶かす。
3. 1分ごとに100％エタノールでスライドを2回洗浄します。
4. 1分間、各溶液中で洗浄エタノール系列（75％、50％、25％エタノール）でスライドを再水和する。 1分間のdH ₂ Oで洗浄します。
5. 15分間シアンブルー溶液、pH 2.5で染色。
6. 3分間流水で洗浄することにより染色を開発する。のdH _{2 O}に一度浸し
7. 10分間核ファーストレッド対比染色液に対比。
8. dH ₂ Oで1時間に3分間浸漬し、水道水の流水で洗ってください。
9. Dehy20ディップそれぞれ、または1分ごとにエタノール系列（25％、50％、75％、100％、100％）でdrate。 5分間ずつキシレンで2回洗浄する。 DPX封入剤とカバーグラスでマウントします。スライドを操作する前に、ドラフト内で48時間乾燥して硬化するためにメディアをマウントすることができます。

結果

L.のさまざまな地域でのアルシアンブルー染色の例erinaceaの消化管を図2に示します。 globlet細胞を含有する酸性ムチンは消化管全体に染色アルシアンブルーではっきりと見える。酸性ムチンの分布は、このように機能の違いを反映して、消化管の異なる領域で異なる。酸性ムチンの高濃度は、遠位腸（2bと図2aおよび 2c を比較）?...

ディスカッション

提示されたプロトコルは、遺伝子発現をモニターし、分化した細胞型を同定するための古典的な方法である、海洋軟骨魚類での使用に適合されています。これらのプロトコルのさらなる修正が異なる軟骨魚類の種に適応するために必要であるかもしれません。

現場の中の RNA全体のマウントに関する最も一般的な懸念は、RNaseのコンタミネーションのリスク?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 x transcription buffer	Roche	11-465-384-001
DIG-RNA labeling mix	Roche	11-277-073-910
RNAse inhibitor	Roche	03-335-399-001
RNA polymerase - SP6	Roche	10-810-274-001
DNAseI, RNAse-free	Roche	10-776-785-001
Yeast RNA	Invitrogen	15401-029
CHAPS	EMD-Millipore	220201
heparin	Sigma-Aldrich	H4784
DEPC (diethyl pyrocarbonate)	Research Organics	2106D
Moria Perforated Spoon	Fine Science Tools	10370-17
Netwell inserts	Electron Microscopy Sciences	64713-00	Netwells for use in 6-well tissue culture dishes
6-well tissue culture plate	Corning	3516
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
formamide	Fisher	BP227500
Proteinase K	Invitrogen	59895 (AM2542)
NBT		11585029001
BCIP	Roche	11585002001
Hydrogen peroxide, 30%	EMD	HX0635-1
Sheep serum	VWR	101301-478
glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
tRNA	Roche	10-109-541-001
Anti-DIG Fab Fragments	Roche	1137-6623
Table 3. Reagents and equipment for RNA whole mount in situ's.
1% Alcian Blue 8GS, pH 2.5	Electron Microscopy Sciences	26323-01
Nuclear Fast Red	Electron Microscopy Sciences	26078-05
DPX Mountant	Electron Microscopy Sciences	13510
Paraffin (Paraplast X-tra)	McCormick Scientific	39503002
10% Formalin, NBF	VWR	95042-908
Glass scintillation vials with screw-cap lids	Weaton Science Products	986540
Stainless steal base molds	Tissue-Tek	4161-4165	Multiple sizes available.
Cassettes	Tissue-Tek	4170
Slide warmer	Fisher-Scientific	12-594Q
Tissue Embedder	Leica Microsystems	EG1160
Microtome, rotary	Leica Microsystems	RM2235
Tissue-Tek Slide Staining Set	Electron Microscopy Sciences	62540-01
Tissue-Tek 24-Slide Holder	Electron Microscopy Sciences	62543-06
Superfrost*Plus slides	Fisherbrand	12-550-17
Table 4. Reagents and equipment for Alcian Blue stain.