強制振動法を用いたマウスにおける呼吸器系の力学の評価

要約

SCIREQ株式会社、モントリオール、QC、現在のプロトコルでは、呼吸器系の力学の測定と同様に強制振動技術を使用してマウスで吸入メサコリンに対する気道反応性の評価（flexiVentを実行するために必要な手順の詳細なステップバイステップの説明を提供しています、カナダ）。

要約

強制振動法（FOT）は、包括的な、詳細、正確かつ再現性のある方法で、マウスでは肺機能の実験的評価を可能に強力な、統合及び翻訳ツールです。それは、事前定義された、小振幅、通常は、被験者の気道開口部に適用される振動気流波形への反応で得られた圧力と容積信号の解析を通じて呼吸器系の力学の測定値を提供します。現在のプロトコルの詳細を十分にコンピュータ制御ピストンベンチレーター（flexiVent; SCIREQ株式会社、モントリオール、QC、カナダ）を使用して、マウスでは強制振動の測定を実行するために必要な手順。準備工程、機械式換気、肺機能測定、データ分析：記述は、4つの部分に分かれている。また、麻酔したマウスに吸入メサコリンに対する気道反応性を評価する方法の詳細は、このtechniquの一般的なアプリケーションが含まれていますまた、他の成果や各種肺病態にも及ぶ電子。ナイーブマウスで同様に気道損傷の酸化的ストレスドリブンモデルから得られた測定値は、このツールは新しい研究分野のアプリケーションに同様に研究さ生理的変化や疾患モデルのよりよい特性評価および理解にどのように貢献できるかを説明するために提示される。

概要

小動物における肺の機械的性質を十分に特性化は、呼吸器科学にマウスモデルで急成長するので、必要不可欠となっています。強制振動法（FOT）、また、ヒト被験者に使用される技術を使用して実行する場合は、これらの測定は、意味のある生理的な変化を研究するための強力な、統合および並進的なアプローチを提供します。 FOT測定は、典型的には事前に定義され、小振幅、被験者の気道開口部¹で適用気流振動波形（また、摂動又は入力信号と称する）に反応して取得した圧力および容量信号を分析することによって得られる。最も単純な形式では、FOT摂動は、明確に定義された周波数で単一の正弦波形となる。より複雑な摂動は通常広いスペクトルをカバーする特定の（互いに素）周波数の波形の選択の重ね合わせで構成されています。マルチ周波数の分解フーリエ変換を使用して構成要素への入力信号と出力信号は、呼吸器系の入力インピーダンス（ZRS）の計算を可能にする、摂動²に含まれるすべての周波数で、入力信号と出力信号との間の伝達関数、即ち 。したがって、FOTは、単一のマニューバー²の周波数範囲にわたって呼吸力学の同時評価を可能にします。インピーダンスデータへのフィッティング高度な数学モデル（ 例えば一定の位相モデル^3）その後、気道（中枢および末梢）と実質肺組織に依存するパラメータ^1、3への応答のパーティショニングを許可します。生理学的反応（ 例えば、呼吸頻度、一回換気量、肺容量、上気道、自発呼吸努力、測定のタイミング）に影響を及ぼす多くの要因は、測定システムおよび実験手順によって制御され、標準化されているので^、1の技術は、キャップですそれが正しく行われていることを条件に正確で再現性のある測定値を生成することができる。この記事の目的は、マウスにおいてこのような測定を実行するために必要な手順の詳細な時系列な説明を提供することである。準備段階（試薬、機器や科目）、機械換気、肺機能測定、データ解析：プロトコルは4つの部分から構成されています。コンピュータ制御ピストンベンチレーター（flexiVent、SCIREQ株式会社、モントリオール、QC、カナダ）を使用して生成された呼吸器系の力学の代表的な結果の例が提供されています。これらはナイーブマウスから同様に気道炎症、上皮細胞の損傷や吸入エアロゾルメタコリン⁴へ増加気道過敏性によって特徴付けられる気道損傷の酸化ストレスドリブンモデルから得られた。このプロトコルは、多くの場合、吸入メタコリンに対する気道応答性を評価するために使用されているが、それは他の成果とvariouのに延び喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、肺気腫、肺線維症、肺損傷、並びにヒトの疾患に類似病状のトランスジェニックマウスモデルに含め秒病理。このツールを使用して研究成果は、生理学的な変化や疾患モデルのよりよい特性評価および理解するだけでなく、新たな研究分野への展開に貢献することができます。

プロトコル

以下に説明する手順は、アニマルケア（CCAC）カナダ評議会のガイドラインに沿ってマギル大学動物実験委員会によって承認された。

1。準備手順

1. ソリューション：
   1. メサコリン：50 mg / mlので原液を準備し^、5をテストする濃度に基づいて段階希釈（1:1）を行う。溶液は⁵噴霧前に室温に到達させる。
   2. 麻酔薬：さまざまなレジメンはマウスの種々の株（ 表1）の文献に報告されている注 ：レジメン1は、本プロトコルの下で使用されていました。
2. 機器：現在のプロトコルはflexiWare 7ソフトウェアでサポートされている2つflexiVent世代のどちらにも適用されます。 研究の定義＆プランニング 、 実験Sessio：ソフトウェアの機能は、3つのモジュールの下にグループ化されnおよびレビュー＆レポーティング 。
   1. システムの電源をオン（flexiVent FXのみ）および/ ​​またはソフトウェアを起動します。
   2. 最初の実験セッションまたはそれ以前に、いつでも勉強構造を事前に定義するために研究の定義＆プランニングモジュールを開きます。
   3. 新しい研究でボタンを作成して、スタディを作成プロトコルの概要を説明し、検討するための実験グループと対象者を定義するには、ウィザードの指示に従ってクリックしてください。
   4. 実験セッションモジュールを開いて勉強し、テンプレートを選択するための起動シーケンスに従って実験·セッションを開始します。
   5. 測定部位の対象を割り当て、その重量を確認。
   6. オペレーティングソフトウェアに記載されている手順に従うことにより、システムのキャリブレーションを続行します。あなたは、キャリブレーションのためにY-チューブに使用するカニューレ（ステップ1.3.3）を取り付けるために、1つの時点でプロンプトが表示されます。
   7. 重要なステップ。Repea取得した校正値が許容範囲外にある場合tは1.2.6のステップ。 （flexiVent FXや校正値のモジュール固有の許容範囲についてflexiWare 7のユーザマニュアルを参照してください）。
   8. キャンセルは、実験を開始する準備ができていない限り換気およびデータの記録を開始するように要求されます。これらは、後の時点で開始することができる。
3. 被験者：
   1. 麻酔薬の適切な用量（ 表1）を用いて被写体を麻酔。
   2. 被写体が麻酔の手術レベルに達していることを確認します。被験者は、つま先のピンチに全く反応を示すべきではありませんし、その呼吸が規則的こじつけではないでなければなりません。
   3. 気管切開を行い、気管カニューレを挿入。
      1. その背中に動物を配置し、熱の源（ 例えば 、温度制御された加熱毛布やマウスから約45センチ過度の加熱を避けるために、位置60ワット電球とランプ）を提供します。
      2. クリーン番目アルコールを含む電子スロート面積を、皮膚切開を作り、そっと顎下腺、それをカバーする筋層を分離することにより気管を公開します。
      3. 優しくマイクロ鉗子のペアを使用して気管を持ち上げ、その下に縫合糸を渡す。
      4. それを区画することなく、気管に小さな切開をする喉頭最寄りの軟骨の二つのリング間で切断。
      5. 切開に以前に較正されたカニューレを挿入し、気管の内側に軽く約5リングの長さを、それを進める注 ：本実験は、1.2センチメートル長い金属18ゲージカニューレを用いて行った。
      6. 重要なステップは縫合糸を使用して所定の位置にカニューレを固定します。添付ファイルは、カニューレの周りに気密シールを形成すべきである。

2。人工呼吸器

1. 人工呼吸器に近い動物を持参してください。
2. 事前定義されたを選択することにより、機械的な換気を開始換気ドッキングウィンドウ内またはカスタマイズされた換気プロファイル。
3. Y-チューブを経由して人工呼吸器に動物を接続します。
4. 重要なステップは人工呼吸器に動物の位置を合わせ、気管カニューレが可能カニューレ閉塞または気管ねじれを避けるために、人工呼吸器と同じレベルであることを確認します。
5. 重要なステップは 、カニューレを挿入し、添付ファイルを確認するために摂動名をダブルクリックすることで、 ディープインフレ摂動を実行します。漏れの不在下では、システムは、過度の体積変位（ 図1）を使用せずに3秒かけて30 CMH ₂ Oの圧力を保持することができるべきである。これらはカニューレ閉塞または紛失している可能性がありますとして記録容積と圧力トレースはまた、オフセットなしの兆候や変形をスムーズにする必要があります。
6. 必要に応じて、心拍数、体温監視用バイタルサイン変換器を接続します。データ記録はeithe開始することができスクリプトを経由して、手動または自動でR。

3。肺機能測定

測定またはコマンド（ 例えばネブライザー活性化、イベントマーカー）高度に制御し、再現実験のプロセス（ 図2）のために事前定義されたか、またはカスタマイズされたスクリプトを使用して自動化することができます。パラメータの数を生じさせる摂動の六ファミリーはベースラインで被検体の呼吸器系の仕組みを説明するために使用され、指定されたチャレンジ（ 表2）に続くことができる。

1. 重要なステップ 。計測を開始する準備ができたら、閉じた肺領域を募集し、肺容量の履歴を標準化するディープインフレを実行します。
2. 重要なステップ 。試験測定（ 例えばのPV-PまたはPVを-V）を実行して、自発吸気努力の不在を確認してください。 選択されたデータセットビュー内の圧力信号トレースを観察します。段階的なPV曲線と、圧力プラトーはよくない下向きのたわみを使用して定義されるべきである。圧力の下向きのスイングは、動物（ 図3）からの吸気努力を示すことになる。
3. そのタイトルをダブルクリックすることで選択したスクリプトを開始します。本研究で使用されるスクリプトは、一般的な測定のために含まれて：
   • 三重のベースライン測定値のシーケンス。
   • 吸入メサコリンに対する気道反応性の評価のための噴霧器の活性化注 ：システムによってメッセージが表示されたら、食塩水またはネブライザーにメサコリンの溶液を約100μlのをロードします。噴霧が開始し、自動的に停止します。
   • ネブライザーの活性化後、約3分の期間に密接に間隔測定（毎10〜15秒）のシーケンス。
   • プロンプトは別の課題を実行し、測定のシーケンスを繰り返す注：Bで綿棒でネブライザーマウント内部乾燥etweenの課題は、吸気ラインの建物アップから水滴や結露を防ぐことができます。
4. 実験の最後に、換気を停止し、件名を切り離す。
5. オペレーティングソフトウェアの次の対象者に切り替え、その重量を確認。
6. 重要なステップは、洗い流して乾燥した噴霧器、アダプタ、Y-チューブ、および被験者間カニューレ。
7. 3.6手順1.2.6を繰り返します。
8. 一日の終わりには、実験的なセッションを閉じます。すすぎ、乾燥噴霧器、アダプタ、Y-チューブ、及びカニューレを、製造業者の指示に従って実験室を離れる前に、システム呼気バルブをきれいにすることを忘れないでください。

4。データ解析

ソフトウェアは自動的に計算し、摂動に関連付けられているパラメータが表示されます。また、データに数学的モデルの適合を反映し決定係数（COD）を提供します。 INSUと各データセットソフトウェアによって除外としてfficient CODはラベルが付いています。実験的なセッションの見直し、データの再解析およびエクスポートのシナリオの作成 ​​は、ソフトウェアのレビュー＆レポーティングモジュールで行われます。

1. レビュー＆レポートのモジュールを開き、輸出シナリオを作成し、唯一の十分なCODを持つデータセットを含むように世話をして。
2. 必要なパラメータ、圧力またはフローボリューム曲線、生のデータセット信号またはスプレッドシート·アプリケーションの対象情報（ 表3参照）としてエクスポートします。
3. 時間の関数としてプロットし、各パラメータの平均ベースライン測定は、すべての測定（ 図4参照）。その後、曲線下面積を計算曲線の一般的なプロファイルを分析したり、統計分析を実行することもできます。
4. 、メサコリン濃度の関数としての気道反応の結果を表現し、各被験者には、パラメータおよび実験条件を決定し、特定するには点（ 例えばピーク時）または各メタコリンチャレンジ後の特定の時間。各実験条件（ 表4、図5）のグループの平均およびレポートやプロットの結果を計算します。
5. 正規化を適用する（ 例：％ベースライン）や統計分析を行う;また指定されたパラメータのベースライン値（ 図5C PC _200）の倍増を生産濃度を算出考えるかもしれません。

結果

呼吸器系の力学測定 。 表4は、ベースラインとflexiWare 7ソフトウェアでサポートされる2つのflexiVent世代のどちらかを使用して、次のメサコリン誘発性気管支収縮（12.5 mg / mlの）で得られたナイーブ/ Jマウスからの典型的な結果を示しています。呼吸器系の力学、閉胸条件下ですなわち、（スナップショット150、プライム3クイック、それぞれ）密集した形で発振家族を強制シングルとブロードバンド周波数の摂動を交互にすることにより評価した。換気は、測定中に一時停止しているので、プライム-8と同様の周波数範囲をカバーする、より短い期間（3対8秒）を有するクイックプライム-3、の影響を最小限に抑える、無呼吸の期間を短縮するために、選択された血液ガス上の摂動とレスポンスの良好な分解能を提供します。各摂動に関連付けられたパラメータをAUTOMATICA算出したLLYオペレーティングソフトウェアによって。結果はflexiVentシステムの2つの世代が呼吸力学の同等の測定値を生成していることを示しています。

肺応答のサイト 。肺応答のサイトを区別することは薬理学的介入⁶の潜在的なポイントを識別するために、調査員はさらに同様に影響を受けた地域を特定することができます。測定が行われる、それに対して呼気終末圧力は3〜9 CMH ₂ O（ 図6A、スナップ-150）に増加した場合、例えば、ナイーブ/ Jマウスは、基準抵抗の増加を示す。本実施例では、広帯域FOT測定（クイックプライム-3）の使用は、抵抗値の変化のための基礎を明確にするために詳細を設け：呼気終末圧力の変化と一致して（R _N）気道抵抗における減少をもたらし高肺気量の気管支拡張効果と大きなインフレプレスURE（ 図6D）及び組織減衰（G; 図6E）の増加、密接に組織粘弾性、おそらく小気道⁷の抵抗を反映した組織抵抗に関するパラメータ。後者は増加する肺容量を増加することが知られている。

気道過敏性 。塩素ガス曝露後、吸入メサコリンに対する気道反応、気道損傷^4（ 図2）の結果として、BALB / cマウスにおける大気暴露に比べて増加します。塩素は、特に上皮細胞に、気道における構造的な細胞の破壊につながる、および炎症性細胞の動員を誘導し、酸化ストレスを誘発することが知られている。 図5に示されるように、呼吸器系の仕組みを説明するすべてのパラメータの変化が増大メタコリンの課題に応じて見ることができる。空気にさらされたマウスと比較して、マウスは、塩素系に曝さneのガスは、全てFOTパラメータ（ 図5A、5B、5D〜5F）ならびに抵抗が2倍 ​​を引き起こすのに必要メタコリン濃度の減少によって例示濃度応答曲線の統計的に有意な左方向にシフトで大きな最大の応答を表示とエラスタンス（PC _200、 図5C）。これらの結果は、それぞれ、塩素ガスへの暴露後吸入メサコリンに対する気道過敏性と過敏性を示しています。

他の測定 。 FOTに加えて、flexiVentシステムは、肺機能^8-10又は心血管系¹¹の測定値の他のタイプを収集するために使用することができる。 図7は、ベースライン条件の下でナイーブ/ Jマウスにおける代表段階的に、圧力駆動圧力容積曲線を表示する。曲線のデフレ手足の上部はサラザール·ノウルズ方程式¹²にフィットさ >（商標）とパラメータは、ソフトウェアによって自動的に計算されます。

表1。マウスで使用される麻酔薬レジメンの例としては、。 大きなテーブルを表示するには、ここをクリックしてください 。

表2。マウスでの肺機能測定に使用摂動。システムに必要*延長。主題はまた、測定中に閉じたプレチスモグラフチャンバ内にする必要がある。痩せ細った">大きな表を表示するには、ここをクリックしてください。

表3。シングルとブロードバンド周波数強制振動摂動家族からエクスポートされたパラメータの例は 大きなテーブルを表示するには、ここをクリックしてください 。

表4。システム比較。肺力学の比較パラメータはflexiWare 7ソフトウェアによって運営flexiVentシステムの2つの世代を使用して収集。結果は、ナイーブ/ Jのマウス（n = 5 /で生成されたベースラインと次のメサコリン誘発性気管支収縮（MCH 12.5 mg / mlの）でのグループ）。 *グループが繰り返し測定し、分散の均一性（;グラフパッドソフトウェア、サンディエゴ、USAグラフパッドプリズム、バージョン5.03）のための個々の応答のログ₁₀のための2つの配置ANOVAを用いて比較した。

図1。深い肺インフレのスクリーンショット。上部パネルは、人工呼吸器のピストン（赤のトレース）と被写体（グレーのトレース）に配信ボリュームによって変位量を示しています。下部パネルは3秒かけて30 CMH ₂ Oの設定圧力まで上昇シリンダ圧を表示し、同じ期間一定に保持した。

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図2。ベースライン時の呼吸器系の力学を評価するために使用される典型的なスクリプトの一例を示す。

図3。段階的に圧力-容積曲線の実行中に自発吸気努力。

図4。経時応答以下は、吸入メサコリンの課題を増やし 、 その結果を 5ナイーブ自発的に過敏/ Jマウスの群の平均（±標準偏差）として表されている。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。

図5。増加メサコリンにおける課題塩素と空気暴露BALB / cマウスに続く呼吸器系の力学の変化。ピーク値は、すべての教科や実験条件の各パラメータに同定された。グループの平均は、次いで（であり、n = 4-6、平均値±標準偏差）を算出した。群間の差は、分散の均一性のための個々の応答のログ_10を用いて分散分析によって評価した。ベースラインの倍増（PC _200）を製造メタコリンの濃度は、個々の用量応答曲線と近似曲線の補間に二次多項式を当てはめることによって得た。データポイントは、塩素に暴露したマウスでD、EとFで欠落している。データへの数学的モデルの貧弱なフィット感を反映して決定不十分高い係数による2最高メサコリン濃度で。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。

図6。気道および肺組織の力学に呼吸応答の分割。実験トレースは、2つの異なる呼気終末圧力で三重の呼吸力学のシングル（2.5 Hz）で、ブロードバンド（1-20.5Hz）周波数強制振動の測定を示すナイーブ/ Jマウスから（3＆9 CMH ₂ O）。 大きい数字を表示するにはここをクリック 。

図7。ベースライン条件の下でナイーブ/ Jマウスにおける圧力-容積曲線。圧力-容積曲線はそれぞれのマウスの肺を独立してその状態を、同一の圧力に膨張されたことを確認するために段階的に圧力駆動摂動（のPV-P）を使用して生成された。個々の圧力 - 容積曲線から抽出されたサラザール-Knowlesの式のパラメータもまた平均化され、テーブル形式で報告された。結果は平均±標準偏差（n = 6）のように表される。

ディスカッション

それは喘息や他の肺疾患に関連する気道機能障害の継続的な研究は、疾患および治療の選択肢の発達の根底にあるメカニズムの理解に優先ままである。モデル気道疾患へのマウスの使用は、これらの病気のメカニズムへの理解を得るに不可欠となっています。マウスのような小さな対象における気道機能障害を評価検討する際に、肺機能を測定するためにそれによって信頼性の高い正確なツールを持つことは重要である。また、気道機能障害又は治療効果の位置に洞察を提供することができるツールを有する非常に貴重である。 FOT技法は、すべてのこれらの属性を組み合わせて、生理的変化を評価するために、強力な統合及び翻訳アプローチを提供します。

マウスにおけるこのタイプの測定を成功させるために、特別な注意が気管内でCAの抵抗、システムの較正、すなわち、いくつかの手順に与えられるべきであるnnula、ネブライザーの種類（だけでなく、その動作設定）動物の位置と肺ボリューム·ヒストリーの標準化。また、被験者の呼吸器系は、測定中の受動有効なままであるデータセットを得るために不可欠である。これは、無呼吸（ 表1参照） を誘導するために被験体の深い麻酔平面で、または過呼吸による仕事、筋麻痺剤の投与によって達成することができる。必要に応じて、マウスでの測定のために必要なスキルを取得しながら、研究者は、テスト負荷で、マスタリングシステムとそのオペレーティングソフトウェアによって起動することができます。その後、疾患モデルや処置マウスに移動する前に、ナイーブ動物での再現性のある結果を生成するために論理的であろう。呼吸研究における疾患モデルの重要な割合は、そのようなアレルゲン、毒素、汚染物質、タバコの煙やガス、measuremenで得られた結果の変動としてエージェントに動物をさらす伴うのでこの資料に記載されているT技術が故に使用される露光手順によって影響を受けることができた。キー実験プロセスの標準化（ 例えば、コンピュータ制御露光及び測定システム^6,13を用いて^、14）は 、潜在的にばらつきを減らすのに重要な影響を及ぼす可能性がある。

強みと同様の手法の限界を強調しながら、この記事で紹介した例には、ナイーブと塩素曝露したマウスの実験からの典型的な結果の選択を表す。 図6の例から分かるように、この技術は、再現性の肺機能測定値を生成することができる。同様の基準抵抗値はマウス系統との間に報告されたが、エラスタンスの違いは、しかし^、15を観察した。実質的な変化は、乳児および成体マウス¹⁶との間予想されることもある。このような目のような生体内の生理学的評価、高精度の結果、 内の他の場合とFOTによって生成された大証は、被験者の自然な状態へと譲歩が付属しています。表現型の不確定性原理¹と呼ばれているこの原則は、測定値は、麻酔で行われた（または経口挿管）tracheotomisedと機械的に科目を換気する必要があるという意味で、現在のプロトコルに適用されます。技術のもう一つの制限は、データに一定の位相モデルのフィット気管支収縮の程度のレベルの上に貧弱であるため、データは塩素曝露群の最高濃度では使用できません図5D-5Fで観察されています。しかしながら、深刻なbronchoconstricted動物を直接ZRS ¹⁵を分析することによって、または例えば基準に機械的機能¹⁷の不均一性を取って、より複雑な数学的モデルに適合するように、サードパーティのポスト解析ソフトウェアを用いて評価することができる。動物の気道が十分に電話でない場合は除外されたデータセットも観察することができますassiveまたはカニューレの抵抗値が高すぎる場合。経験則として、カニューレの抵抗はベースライン時に動物の抵抗を超えてはならない。大きな内径および/またはより短い長さのカニューレの操作カニューレ抵抗を減らすのに役立ちます。最後に、マウスにおけるFOT測定の本デモンストレーションは時間がかかり、したがって、あまり効率的手法として知覚され得るか、または低侵襲性の技術と比較して長期的な研究にはあまり適用可能である。しかし後者は、その成果の基礎に関して不確実性が多大に関連付けられており^、1欠陥があるとして多くの人に見られる。繰り返し侵襲的測定は技術的に難しく¹⁷が、経口挿管動物で可能です。

提供された例から、結果は呼吸力学の測定値を生産でflexiVentシステムの2つの世代の同等性を実証し、同様に気道hyperreacマウスで塩素暴露後吸入メタコリンへtivityと過敏。生理学的変化又は疾患モデルを特徴付けるまたは理解するために使用される場合、技法に関連した詳細な測定の態様は、現在の知見を拡張するために寄与することができる。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Acetyl-β-methylcholine chloride	Sigma-Aldrich	A-2251	Methacholine
Micro-Adson forceps, serrated 12 cm	Fine Science Tools	11018-12
Moria MC31 forceps, serrated-curved	Fine Science Tools	11370-31
Iris scissors-tough cut, straight 11.5 cm	Fine Science Tools	14058-11
Spring scissors-2.5 mm blades, straight	Fine Science Tools	15000-08
Non-sterile blunt needle (18g x ½")	Brico Medical Supplies Inc.	BN1805	Endotracheal cannula
Non-sterile 5-0 silk suture	Seraflex	IDI58000
Phosphate buffered solution	Gibco	14190-144
15 ml conical tubes	Starstedt	SS-4001
1 ml TB syringes	Becton Dickinson	309626
200 μl filter tips	Biosphere	70.760.211
EQUIPMENT
flexiVent FX	SCIREQ Inc.	sales@scireq.com	www.scireq.com
Aerogen Aeroneb nebulizer	SCIREQ Inc.	sales@scireq.com	www.scireq.com