ダイナミックな相互作用の3次元構造解析のための相関顕微鏡

要約

我々は高速3D生細胞の蛍光顕微鏡および高分解能低温電子断層撮影法を組み合わせた相関顕微鏡法を記載している。我々はダイナミックイメージング、宿主HeLa細胞との相互作用小HIV-1粒子による相関法の能力を実証する。

要約

クライオ電子線トモグラフィー（cryoET）が近い対生理状態¹の分子分解能で細胞構造の3次元可視化を可能にします。しかし、cryoETとの宿主細胞環境内の個々のウイルスの複合体の直接可視化は、特にHIV-1の場合には、ウイルスの侵入のまれと動的な性質のために^、2に挑戦^している。タイムラプスライブセルイメージングは、HIV-1 ^3-7のライフサイクルの様々な側面についての多くの情報が得られているが、生きた細胞の顕微鏡検査によって得られる分解能は（〜200 nm）で制限されています。私たちの仕事は、生細胞蛍光顕微鏡、低温蛍光顕微鏡、およびcryoETを組み合わせることにより、HIV-1感染の初期のイベントの直接可視化を可能に相関法を開発することを目的とした。このようにして、生細胞とクライオ蛍光シグナルを正確にcryoETにおけるサンプリングを導くために使用することができる。さらに、構造情報はcryoET缶Bから得られeは、蛍光標識された標的の生細胞イメージングを通じて得ダイナミック機能データで補完。

このビデオの記事では、我々は、HIV-1と3D相関高速ライブセルイメージングと高解像度cryoET構造解析を用いた宿主細胞の相互作用の構造的な調査のための詳細な方法とプロトコルを提供します。 HIV-1粒子に感染したHeLa細胞を、生細胞の共焦点顕微鏡法によって特徴付けられた第一及びそのウイルス粒子を含む領域は、その後、3次元構造の詳細については、低温電子断層撮影法によって分析した。撮像データは、光学撮像と電子撮像、の2つのセットの間の相関が自作低温蛍光顕微鏡ステージを使用して達成された。ここで詳述アプローチは、ウイルス宿主細胞の相互作用の研究のためだけでなく、そのような細胞シグナル伝達、膜受容体の輸送、および他の多くの動的な細胞プロセスのような細胞生物学の広範な用途に限らず、貴重であろう。</ P>

概要

クライオ電子線トモグラフィー（cryoET）は細胞や組織の三次元（3D）の可視化を可能にし、クローズに生理的状態¹の分子分解能でネイティブ小器官と細胞構造の組織に洞察力を提供する強力なイメージング技術である。しかしながら、それらの放射線感受性と組み合わせた染色凍結水和した検体の本質的に低いコントラストは難しい細胞内の関心のある領域を特定し、続いて標的領域に損傷を与えることなく、正常に傾斜シリーズを行うことができる。これらの問題を克服するために、光学および電子顕微鏡法を組み合わせた相関アプローチが必要である。蛍光標識によって強調され、特定の機能を特定し、蛍光顕微鏡で配置した後、それらの座標は、高解像度の3D構造データの取得のための電子顕微鏡に転送されます。この相関方法は、標的を見つけるのに役立ちます対処すべき関心のREAS。電子顕微鏡（<300 nm）を有する試料の厚さに制限があるため、現在のセルの周辺領域のみがCryoETによる3次元構造解析に適している。さらに^8を区画またはクライオ集束イオンビーム（FIB）加工⁹によって相関イメージングの能力を拡大する硝子によって凍結された水和試験片の厚さを減らすことができます。

以前は、相関の方法は、主に大規模な静的構造^10-13用cryoETデータ収集を容易にするために使用された。これらの研究では、クライオステージは電子顕微鏡グリッドを受け入れ、正立顕微鏡や倒立顕微鏡^10,11,14いずれかに適合するように実装されています。グリッドを切り替えると、そのデザインにかなり簡単に見えますが、EMグリッドのために必要な手順を転送するグリッドが、変形破損及び汚染される可能性があるという可能性を高め、追加があります。我々は最近の技術進歩を実証私たちが直接そのようなHIV-1と感染¹⁵の初期段階での宿主細胞の相互作用などの性質によって捕捉することが困難である動的なイベントを、視覚化することができ相関顕微鏡。そこで我々は、相関を容易にする、グリッド取り扱いによる試料の損傷を最小限に抑えるためにカートリッジシステムを適合させるクライオ光学顕微鏡の試料ステージの設計および実装することによって、これを達成した。私たちの設計では、両方のクライオ光と低温電子顕微鏡法は、このようにして相関処理を合理化し、試料移送することなく、同一の試料ホルダ上に、順次、行うことができるように、統合された試料カートリッジホルダを備えている。さらに、我々はまた、基準マーカーとして蛍光ラテックスビーズを用いて正確かつ信頼性の高い相関手順を実施した。

プロトコル

1。カーボンコーティングされた上でのHeLa細胞培養、ゴールドEMファインダーグリッド

1. グロー放電25秒25ミリアンペア下200メッシュR2 / 2 Quantifoil金EMファインダーグリッドの炭素側。
2. コー​​トフィブロネクチンとEMグリッドは、カーボン側、それを下に浮かんで、50μgの/ mlのフィブロネクチン溶液を40μlの液滴にし、組織培養フード内で2時間、UV光の下でそれを消毒。
3. プレートのHeLaグラスボトム培養皿で2×10 ⁴細胞/ ml（合計2 mlの培養液）の密度でグリッド上のセルとDMEM中で、5％CO _2、37℃で細胞を成長させるには、4.5で補充約18時間グラム/ L L-グルタミンおよびグルコース、10％熱不活性化ウシ胎児血清、100単位/ mlのペニシリン、および100μg/ml/ mlのストレプトマイシン、。 HeLa細胞は、O / N培養後に感染している。

2。 HIV-1感染症とライブセルイメージング

1. グラスボトム文化に蛍光細胞トラッカー（赤CMTPX、1μlの/ 2 ml）を追加ディッシュ（ステップ1.3から）と蛍光色素のアップテイクできるように、10分間37℃で皿をインキュベート。
2. PBSで細胞を洗浄し、50μlの予め温めておいた新鮮な培地を追加します。
3. 37°C、スウェプトフィールド共焦点スキャナ顕微鏡でライブセルチャンバー上に皿を置きます。低温電子顕微鏡は、比較的薄い領域を必要とするので、彼らはほとんどの、フラットに広げている2つの有糸分裂の相の間の細胞と1-3のセルを含む/平方複数のフィールド（10-15位置）、（ 図2c及び2dを参照） を選択するサンプル。将来のイメージング（ステップ2.5）のためにこれらの位置を保存します。
4. （我々はP24の40 ngの/ mlのを含むサンプル40μlのを使用してください）​​GFP-Vprにを含むVSV-GシュードタイプされたHIV-1粒子を細胞に感染。皿の底にウイルス粒子を追加する場合は、イメージングのための位置がすでに選択して保存されているため、EMグリッドを邪魔しないように注意してください。
5. 直ちにビリオンの添加後、チタニウムを集める20-40分間、前に選択した位置での高速3D共焦点画像を、（ステップ2.3から）私タイムラプス。
6. 共焦点画像は変形者を使用して取得し、Imarisソフトウェア（ 図1を参照）を使用して、単一粒子のダイナミクスのための自動3D粒子追跡によって分析した。我々は、回折限界のHIV-1細胞の超微細構造を有する粒子の動的挙動を相関しているので、時間経過の生細胞イメージングと3Dパーティクルトラッキングは結果に重要です。しかし、大規模な静的構造のために、シンプルな蛍光画像（ライブセルなし）相関分析のための十分であろう。

3。冷凍水和EMサンプル調製

サンプルの最後の共焦点画像とクライオ固定のコレクションの間の時間遅延を最小限に抑えるために、FEI Vitrobot（または他のガラス固化装置）蛍光共焦点ライブセルイメージのコレクションの間に開始され、プランジ凍結のために準備されるべきである。

1. ガラス固化装置の電源をオンにし、22にその気候温度を設定°C、100％に目標湿度、7秒にブロッティング時間、待機して1秒までの時間をドレイン。
2. プランジ​​ャーデュワーのグリッドストレージボックスを置き、冷たい液体エタンを準備します。ガラス化デバイスにデュワーをマウントします。
3. 直ちに共焦点ライブセルイメージング（セクション2）の後、氷冷した銅ブロック上に培養皿を配置し、低温電子顕微鏡の試料準備室に転送します。専門のピンセットにEMグリッドをロードし、迅速グリッド上の任意のメディアを離れてしみ。ブロッティングを0.2μm、蛍光ミクロスは直ちにグリッドに配置され、15 nmの金ビーズ溶液4μlのを混合した後、濾紙で、手作業で行われます。金ビーズは断層データ収集および整列を助けるために基準マーカーとして使用される。蛍光ミクロスフェア（ 図2cは-2fを参照 ）、蛍光灯や電子顕微鏡の画像間の相関を支援するために使用されている。
4. ガラス化デバイスにピンセットをロードし、液体エタン¹⁶に凍結ブロットおよび突入するようにデバイスに指示します。最良の結果を達成するために最適化されたブロッティングパラメータは次のとおりです。ブロット時間、7秒、ブロットオフセット、0;ドレイン時間、1秒、温度22℃、そして湿度100％。
5. 後で使用するために即時cryoETイメージングのための低温電子顕微鏡ホルダー、または液体窒素貯蔵デュワーに冷凍水和グリッドを転送します。

4。クライオ蛍光顕微鏡

自作、クライオ蛍光試料室とステージシステム（ 図3）は、ステップ4.1から4.10を遂行するために必要とされる。詳細な仕様、ステージの説明6月らで見つけられるかもしれません^。15。

1. 少なくとも2時間低温蛍光顕微鏡（ 図3aを参照）を開始する前に液体窒素で自己加圧された液体窒素デュワーを埋める。
2. 手製のクライオ-FをマウントこのようなオリンパスIX 71として倒立蛍光顕微鏡へluorescence試料ステージ^15（ 図3）。
3. 自己加圧デュワーに低温試料ステージの液体窒素の注入口を接続し、適当な容器に液体窒素オーバーフロー保護のコンセントを配置。霜のレンズは暖かく、自由を維持するために対物レンズの上に置かスリーブに乾燥窒素ガスラインを接続します。
4. 凍結した水和サンプルグリッドをロードするためのクライオ段室に銅ブロックのプラットフォーム（図3bに黒い矢印）を配置します。クールダウンし、自己加圧充填デュワーから入口ラインを通して液体窒素で凍結ステージの銅室を埋める。
5. 低温ステージは、液体窒素温度（約4-6分）に達すると、低温ステージにグリッドストレージボックス（ステップ3.5から）転送する。
6. 銅ブロック上にEM試料カートリッジに凍結した水和サンプルグリッドを配置し、GをクリップC-リング（Polara顕微鏡カートリッジを使用している場合）を使用して、所定の位置に取り除く、または場所でも後のグリッドを簡単に取得するためにグリッドを維持するために、（ 図3dの黒い矢印）上に予め冷却した銅リングを配置低温蛍光イメージング（非Polara低温電子顕微鏡のための場合）。
7. クライオステージ（図3bで白矢印）の内側のチャンバーにカートリッジを（ステップ4.6から）に置きます。
8. ライブセルイメージングデータから同じウイルス粒子を検索し、見つける。 EMグリッドがインデックスを持っているので、生細胞画像やクライオ蛍光画像の両方のグリッドで同じ粒子をローカライズするために簡単です。
9. 長い作業（2.7〜4ミリメートル）の対物レンズの光顕微鏡を用いて低温条件下で識別位置にクライオDICとGFPの画像を取得する。低温蛍光イメージングの間、定期的に、クライオステージと補充、それを中の液体窒素レベルを確認し、必要に応じて、-170を下回る試料ステージを維持する℃の
10. クライオ蛍光イメージングが完了した後、注意深く銅ブロックプラットフォームに試料カートリッジを返し、Polaraシステムとの将来cryoET分析のために液体窒素デュワーにカートリッジを格納する。非Polara低温電子顕微鏡を使用している場合は、銅リングを取り外し、サンプルグリッドを取得し、グリッドストレージボックスに入れて、試料がcryoETによって検査されるまで、液体窒素デュワーに標本を保管する。
11. データ解析のために、取得されたクライオDICとGFPの画像をオーバーラップする（ステップ4.9から、 図4bを参照）、生細胞イメージング系列的に得られたものと極低温におけるGFP蛍光画像信号の位置を相関させる。

5。クライオ電子線トモグラフィー

1. このようなPolara G2顕微鏡として電界放出銃、装備電子顕微鏡の低温乗換駅に試料カートリッジをロードします。
2. 140X、IDEの倍率で低線量検索モード下ntifyとステージファイルに関連付けられたグリッドの正方形を（ステップ4.11から）保存します。
3. 3,500 Xの倍率で低線量の検索モードで、100μmの対物絞りを挿入し、検索及び第2段ファイルにGFP信号と相関すべての位置を保存します。
4. 重要炭素領域で氷を離れて燃焼させることにより、ステージyの関数を使用して^、/Å2と傾斜軸を改良^-低線量被ばくのモードでは、1または2の電子の用量にビーム強度を調整するために空白の領域を見つけるいくつかの金のビーズで。
5. 低線量フォーカスモードの下で、2〜3μmの焦点距離を調整し、チルト軸に対して平行になるようにフォーカスの方向を揃える角度を調整。
6. 低線量の検索モードでは、（ステップ5.3から）保存された位置を思い出し、試料ユーセントリックの高さを調整し、関心のある領域のための傾きの範囲を確認してください。博覧会で、8〜10μmのデフォーカスで^-非常に低電子線量^（/Å2〜1のe）と投影画像を取得低温電子断層撮影のための相関ウイルス粒子を確認するUREモード。
7. 低線量フォーカスモードに切り替えます。 TEMオート機能メニューで、フォーカスエリアに自動ユーセントリックの高さとフォーカス機能を先行。
8. チルトシリーズを取得するためのパラメータを設定します。 ^/Å2総線量^-本論文では、±70°、下45度、上記の範囲の傾斜角度、3°、2℃でチルト刻み、それぞれ、 図4の場合は6μmではフォーカスと約70 eで、使用された。
9. 保存されているすべてのポジションについて、手順5.7と5.8を繰り返します。バッチトモグラフィーソフトウェアは、スループットを増加させるために複数の位置で自動化されたデータ収集に使用することができる。

6。 IMOD ^17を用いて三次元再構成

1. 最小値と最大密度の値を調整し、大きなイメージシフトによる除外する任意のビューが存在するかどうかを判断するために生のチルトシリーズを点検。
2. eTomoと軸タイプ、ピクセルサイズ、基準直径などを使用してセットアップ断層パネルを起動します。その後comのスクリプトを作成します。
3. 断層計算のいくつかの段階が調整/同時に追跡することができるように、メインウィンドウを設定します。必要なパラメータを変更し、各処理工程（eTomoチュートリアルを参照してください、で必要とされる特定のプログラムを実行http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html ）。
4. 最終段階で、完全整列スタック（0.6未満の平均残存エラーで）を作成し、IMODで加重逆投影アルゴリズムを使用して断層像を再構築する。
5. コントラストと明瞭度を向上させるために適切なパラメータをIMODで実装3D非線形異方性拡散エッジ強調プログラムを使用して興味のある潜在的な領域をノイズ除去。

結果

ウイルス粒子の動的挙動を特徴づけるために、HIV-1に感染したHeLa細胞を、高速共焦点生細胞顕微鏡によって撮像され、粒子の動きは、自動化された3次元粒子追跡（ 図1）によって分析した。最後の共焦点ライブセルイメージとプランジ凍結（相関HIV-1粒子を失うことに十分な長さであるかもしれない）、クライオ蛍光顕微鏡ステージ（ 図3のコレクションの間に発生?...

ディスカッション

我々はcryoET続いタイムラプス共焦点、生細胞蛍光イメージングを用いた動的な細胞事象を分析するための高度な相関的アプローチを提供するために、プロトコルの簡単なセットを提示している。高解像度のcryoETで3D生細胞イメージングを相関する我々の方法論の開発は多くの困難な生物学などの（非静的、以前に報告されているように）、稀な動的可視などの問題、および回折限界ウイルス?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
DMEM 4.5 g/L Glucose w/ L-Glutamine	Atlanta Biologicals, Inc. Lawrenceville, GA	12-604F
Fibronectin	Sigma, St. Louis, MO	F1141-1MG	HeLa cell culture on EM grids
Cell tracker	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	C34552	Red CMTPX
Protein A gold conjugates	Ted Pella, Inc., Redding, CA	15822-1	15 nm diameter
0.2 μm fluorescent microspheres	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	F8811	Yellow-green fluorescent
Heat-inactivated fetal calf bovine serum	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	10082-139
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	15140-122
Glass-bottom culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Gold quantifoil finder EM grids	Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany	R2/2 Au NH2 200 mesh
PBS	Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA	70011-044
Equipment
Glow-discharge device 100X	EMS, Hatfield, PA
Tecnai Polara G2 electron microscope with a Field Emission Gun	FEI, Hillsboro, OR		300 keV
Vitrobot Mark III	FEI, Hillsboro, OR
Olympus IX 71 microscope	Olympus America Inc., Center Valley, PA		LUCPlanFLN 40X/0.6 NA (2.7-4 mm working distance) objective lens
Nikon TiE microscope	Nikon Instruments, Melville, NY		using a 60X/1.35 NA oil immersion objective lens
Sweptfield confocal microscope	Prairie Technologies, Middleton, WI
Tokai Hit live cell chamber	Tokyo, Japan
Cryo-fluorescence sample stage	Home-made		Homebuilt by machine shop, see reference 15 for the design.