膵臓癌の進行の生物発光同所性モデル

要約

膵臓癌生物学の理解の向上は非常に重要膵臓癌を治療するための良好な治療選択肢の開発を可能にするために必要とされる。このニーズに対応するために、我々は使用して癌の進行の非侵襲的なモニタリングを可能に膵臓癌の同所性モデルを示す生物発光イメージング。

要約

概要

膵臓癌は4〜6％の5年生存率は、癌関連死因の第4位である。患者の^1,2だけが15％、手術の対象になる病気の早い段階で十分に診断され、腫瘍が再発している>でこれらの患者の80％は^3,4ゲムシタビンは、膵臓腺癌の治療に使用されているが、化学療法耐性が一般的であり、多くの場合、薬物は、全体的な生存率にほとんど影響を与えない。膵臓癌を治療するために⁵新しい薬理学的戦略が決定的に必要とされる。その開発は、治療的介入に敏感かもしれない病気の進行の重要なステップの大幅に改善理解に依存します。

膵臓癌の同所性モデルは、膵臓癌の生物学を研究するための理想的なツールがそれらを作り、ヒトの疾患の重要な側面をエミュレートする。膵臓癌細胞の挙動のin vitroでの細胞ベースのアッセイとは対照的に^6-9dは皮下膵臓癌のin vivoモデルにおいて 、同所性モデルは、膵臓腫瘍細胞微小環境との相互作用の調査を可能にする。病気の進行の速度論は同所性モデルで再現性の高いであり、それらはよく小説治療薬の前臨床試験に適しています短い時間枠（週）にわたって生じる。これにより、疾患発症が長く、より可変時間枠（ヶ月〜1年間）にわたって生じるトランスジェニックモデルとは対照的である^。10は、より積極的な細胞株と一緒に使用すると、膵臓癌の同所性モデルは、に見られるものと同様の自然転移のパターンを有する患者はこのようなホタルルシフェラーゼが治療に転移性播種、再発および応答、腫瘍増殖の縦監視を容易にします^。6,11のように生物発光レポーター遺伝子の発現は⁸

ここでは、MATRを利用膵臓癌の同所性モデルを記述腫瘍進行の非侵襲的なモニタリングのためのローカライズされた細胞送達およびin vivoの生物発光イメージングのためのIGEL。膵臓癌の同所このモデルは、疾患の進行および同系移植片または異種移植片モデルにおける治療的介入に対する応答の非侵襲的な分析を可能にする。

プロトコル

実証されているプロトコルは、著者の機関の動物のケアと使用委員会の指導と承認の下で行われる。すべての実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制機関に準拠して実行されます。

1。膵臓癌細胞株を形質導入

1. ^12,13 PANC-1。前述したように、ルシフェラーゼ発現させる膵臓癌細胞を形質導入し、ホタルルシフェラーゼを形質導入CAPAN-1膵臓癌細胞株は、ここで使用される。

注：ウミシイタケルシフェラーゼ又は細菌ルシフェラーゼを用いてもよい。

2。膵臓癌細胞の調製

1. 培養は、70％コンフルエントになるまで膵臓癌細胞を形質。
2. 膵臓細胞を持ち上げて、生存能力が90％以上であることを確認してください。
3. チルドマトリゲルの午前3時02混合物中の2×10 ⁷細胞/ mlで再懸濁し：リンSALは、バッファINE（PBS）。
4. 事前の膵臓への注入に、氷上でマトリゲル細胞懸濁物を保管してください。

注：マトリゲルの急冷凝固を確保するために、細胞ペレットの量を考慮して、PBS量を減らす。注入前に凝固を防ぐために、すべての回で氷冷楽器や注射器を使用したマトリゲルを扱う。提案された細胞数がガイドされ、各細胞株に対して経験的に決定されるべきである。

3。マウス準備

1. 2〜3％イソフルラン吸入使用して、マウスを麻酔。穏やかなつま先のピンチにペダル反射の欠如によって麻酔の深さを決定します。
2. 乾燥を防ぐために、目には潤滑剤を適用します。
3. 37°Cの加熱パッドでその背中の上にマウスを置き、そっと腹部の左側を上げるには、マウスの電源を入れます。
4. 10％ポビドンヨード液で腹部を準備します。

注：Injectabル麻酔は吸入麻酔の代わりに使用することができる。術前の絶食は必要ありません。

4。開腹

1. 無菌の手術器具を使用すると、約1cmが正中線からの横方向のままに皮膚は1.5センチ切開を行います。
2. 基礎腹筋1.5センチ切開を行います。
3. ピンセットを用いて脾臓を見つけて、優しく腹腔から脾臓を除去します。基礎膵臓を公開するために滅菌綿棒に沿って脾臓を固定します。
4. 脾臓に隣接した膵尾部の位置を確認します。
5. 29 G 0.3ミリリットルのインスリン注射器を用いて、膵臓にマトリゲル細胞懸濁液20μLを注入します。
6. マトリゲルが固化するまで注入後、30〜60秒のために膵臓でシリンジを保持します。これは重要なステップは、セルの漏れを最小限に抑えます。
7. 漏れが発生していないことを確認するために注射部位を検査します。
8. 腹腔に脾臓と膵臓を返します。

注意：薄いかもしれない膵臓の背側を穿刺しないように注意してください。

5。腹壁閉鎖

1. 連続的なステッチを使用してラウンド針で吸収性編組4-0縫合糸でマウスの腹部の筋肉を閉じます。
2. 連続的なステッチを使用してカッティング針で非吸収性モノフィラメント6-0縫合糸で皮膚外用を閉じます。
3. 吸入麻酔薬と皮下注射0.05 mg / kgでブプレノルフィンからマウスを外します。
4. マウスは、食品や水への無料アクセスを37℃の加温パッド上に置かれ、そのケージに回復することができます。マウスは、このようなハンチングまたは身体障害などの疼痛の兆候を示す場合は、ブプレノルフィンを、36時間かけて12時間毎に与えられてもよい。
5. 創傷治癒（7-10日）の後、マウスを麻酔し、外部の縫合糸を除去する。

6。膵臓CANCの生物発光トラッキングえー進行

1. イソフルラン吸入使用して、マウスを麻酔。
2. 尾静脈を経由して150 mg / kgをD-ルシフェリンを注入。
3. 生物発光イメージングシステムでマウスを置き、前述のように白色光と生物発光の画像をキャプチャします^。14,15は
4. 吸入麻酔からマウスを削除し、それがそのホームケージで回復することができます。

注：生物発光撮像では非侵襲的であり、腫瘍増殖動態を調査するために定期的に実施することができる。膵尾部の画像腫瘍に、その左側にマウスを置くことが重要である、カメラに向かって腫瘍ポイントそう。周波数が前FOV 12.5ビニング4とリビングイメージング4.3.1ソフトウェアを実行ルミナIIイメージングシステム（パーキンエルマー、以前はキャリパーライフサイエンス）を用いた実験のエンドポイントに週3回まで増加したと我々は、週一回撮像するF-ストップ1、露出1から60秒（最高EXPによって決定ピクセル飽和なしosure）。

結果

この方法は、麻酔導入、開腹、マトリゲル、腹部閉止（ 図1A）中の癌細胞の注射を含む外科的処置を用いて膵臓癌の同所性モデルについて説明する。注入された細胞は、膵臓の表面の気泡（ 図1B）を形成する。膵臓癌の進行を非侵襲的に癌細胞の増殖と普及し（ 図2）を追跡するためにインビボ生物発光撮像で使用して監視することができ?...

ディスカッション

ここでは、膵臓腫瘍発生および進行の長手方向の評価のための同所性モデルを記述。原発腫瘍増殖動態は、再現性がある（ 図3）と非侵襲的に新規抗膵臓癌治療に対する腫瘍の応答の分析のために、例えば 、ルシフェラーゼタグ付き細胞の生物発光撮像を用いてモニターすることができる。ヒトの疾患と一致して、モデルは、膵臓微小環境と腫瘍細胞との相互作用の調査?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clean Bench coat
Heating pad			Set to 37 °C
Ivis Lumina ll Bioluminescent imager	Caliper		Alternative bioluminescent imaging systems include In vivo F PRO (Carestream) and Photon Imager (Biospace Lab)
Dissecting scissors
Iris forceps (serrated)
Needle holder
27 G 0.3 ml insulin syringe	Terumo	T35525M2913