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要約

酵母ミトコンドリア核様体タンパク質、Mgm101は、大きなオリゴマーの環を形成するRAD52型組換えタンパク質である。プロトコルは、陽イオン交換およびサイズ​​排除クロマトグラフィーと連結マルトース結合タンパク質（MBP）タギング方式を使用して可溶性組換えMgm101を調製するために記載されている。

要約

MGM101遺伝子はミトコンドリアDNAの維持におけるその役割のために20年前に同定された。いくつかのグループからの研究がMgm101タンパク質は、ミトコンドリアDNAの組換え修復に関与することが示唆されている。最近の研究は、Mgm101がRAD52型組換えタンパク質ファミリーに関連することが示されている。これらのタンパク質は、大きなオリゴマーの環を形成し、相同な一本鎖DNA分子のアニーリングを促進する。しかし、Mgm101の特徴は、組換えタンパク質を産生することが困難によって妨げられてきた。ここでは、組換えMgm101の調製のための信頼性のある手順を説明する。マルトース結合タンパク質（MBP）タグ付きMgm101は、第大腸菌で発現される。融合タンパク質は、最初アミロースアフ​​ィニティークロマトグラフィーにより精製する。タンパク質分解切断によって放出された後、Mgm101は、陽イオン交換クロマトグラフィーによってMBPから分離される。単分散Mgm101その後、得られたサイズ排除クロマトグラフィーによる。細菌培養のリットルあたりMgm101の〜0.87ミリグラムの収量は日常的に得ることができる。換えMgm101は、DNAの最小の汚染されています。調製したサンプルが正常にMgm101の、生化学的構造及び単粒子像分析のために使用される。このプロトコルは、ミスフォールドおよび細菌細胞に対して毒性することができる他の大きなオリゴマーDNA結合タンパク質の調製のために使用することができる。

概要

相同組換えは、二本鎖切断（DSBの）と鎖間架橋の修復のための、および縮小複製フォーク1からDNA複製の再開始のために重要である。従来の相同組換えでは、中央の反応は、原核生物においてRecAタンパク質、及びRad51の1-3および真核生物におけるDMC1含むATP依存性リコンビナーゼにより触媒される。これらのリコンビナーゼは、二本鎖DNAテンプレート（ 図1、左パネル）4-7内の相同性検索と鎖侵入を開始するために不可欠である一本鎖DNA上で核タンパク質フィラメントを形成。従来方式に加えて、相同組換えはまたRecA/Rad51-independent方法（ 図1、右パネル）で行うことができる。例えば、酵母RAD52とRad59タンパク質は直接二本鎖DNA切断の切除によって公開され、相補鎖DNA鎖のアニーリングを触媒することができます。歌うと呼ばれるこの再結合過程、ル鎖がアニーリング、一般的に相同な二本鎖DNAテンプレートとのペアリングは含まれません。アニール後、異種尾はエキソヌクレアーゼとニックゲノム継続8-10を復元するために連結されることにより除去される。一本鎖アニーリング機構により修復は、しばしば直接繰り返さ地域間のゲノム配列の欠失を伴っている。

RAD52はバクテリオ11の間で普及している組換えタンパク質の多様なグループに属しています。これらのタンパク質はまた、相同な一本鎖DNA分子のアニーリングを促進するそれらの活性に基づいて、一本鎖アニーリングタンパク質（SSAPs）として知られている。最高の特徴バクテリオファージSSAPsはRedβとラクトコッカスファージul36からプロファージRACおよびサックタンパク質からバクテリオファージλとP22、RecTをからErfにある。類似性が事実上undetectですがSSAPsは、構造的、典型的なβ-β-β-α倍によって特徴付けられる彼らの主要なシーケンスでできる。 10彼らは、すべてのフォーム大ホモオリゴマーリング- 体外 12-14 で 14回対称。この特徴的な高次構造、組織の機能的な意味はよく理解されていない。

私たちは、ミトコンドリアゲノムに相同組換えのメカニズムを理解することに興味を持っています。我々は以前に、サッカロミセス·セレビシエ 15内のmtDNAの維持に必須であるMGM101遺伝子を同定した。MGM101は 、その後、ミトコンドリア核様体と関連することが見出され、DNA損傷剤に対するミトコンドリアの許容16に必要とされる。しかし、Mgm101の研究は、組換えMgm101を生産する難しさによって10年で戻って開催されています。我々は最近、E.から大量に可溶Mgm101を生産することに成功しましたMBP融合戦略を使用して大腸菌 。これは、Mgm101株式を発揮することができましたタンパク質17,18のRAD52-家族と生化学的および構造的類似性。本報告では、三段階精製法は均質Mgm101for生化学的および構造解析します（ 図2）を生成し、これに記載されています。

プロトコル

これまでの研究では、Mgm101の最初のアミノ末端22残基がミトコンドリア19へのインポート後に切断されることが示されている。 大腸菌における発現のために、最初の22コドンを欠くMGM101オープンリーディングフレームをPCRで増幅された発現ベクター物pMAL-C2Eの修正版でマルトース結合タンパク質（MBP）をコードする雄配列の下流に配置された。これは、プレシジョンプロテアーゼ（ 図3）のための切断部位を含むリンカーとMBP-Mgm101融合を生成します。プラスミドは、第E.を選択することにより構成されているIPTGおよびXgal白/青選択せずに形質転換体。得られたプラスミド物pMAL-C2E-MGM101その後、E.に導入され、アンピシリンとクロラムフェニコール耐性コロニーを選択することにより、 大腸菌株BL21-CodonPlus（DE3）-RIL。

1。表現、誘導、細胞溶解とのDNase I処理

  1. INOCグルコース（0.2％）、アンピシリン（100μg/mlの/ ml）およびクロラムフェニコール（50μgの/ ml）を添加したLB培地10ml（1％バクトトリプトン、0.5％酵母エキス、1％NaCl）中に新鮮な形質転換体をulate。 200 rpmで振とうしながら37℃CO / Nでインキュベートする。
  2. 上記のように添加したLB培地を2リットルに10ミリリットルの前培養に接種。 OD 600が 0.5に達するまで振とうしながら37℃で細胞を成長させる。
  3. 0.3mMの最終濃度イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加することによりMBP-Mgm101融合タンパク質の発現を誘導する。 5時間30℃で振とうしながら細胞を育てる。
  4. ベックマンJA-10ローター（5,500×gで、4℃、10分）を使用して、遠心分離により細胞を回収。上清を廃棄した後に、プロテアーゼ阻害剤を含む溶解緩衝液（20mMのトリス-HCl、pHが7.4および1mM EDTA、pH7.4）中（25μMロイペプチン、1μMのペプスタチン及び1mM PMSF）30ml中に細胞ペレットを再懸濁。
  5. 20氷上で細胞懸濁液を超音波処理秒超音波プロセッサ（熱機関;モデルW-385）を用いて50％のデューティサイクルで、30秒間、氷上で冷却し、そして2×繰り返すことができる。
  6. 2 mg / mlのDNアーゼで1株を1 mlを加える。 2時間4℃で細胞溶解物を揺する。
  7. 500mMの最終濃度のNaClを調整します。
  8. 30分間、4℃で10,000×gで遠心分離することにより細胞の破片を取り除きます。

2。アミロースアフ​​ィニティークロマトグラフィーによる精製

  1. 溶解緩衝液中のアミロース樹​​脂を1.5ml（50％スラリー）を平衡化する。細胞ライセートに平衡化アミロース樹​​脂を追加します。 4℃のCO / Nで優しく揺らし
  2. 寒い部屋に設置エコノカラムクロマトグラフィーカラムにライセート樹脂ミックスをロードします。非結合タンパク質は重力によって列を渡すことができます。
  3. 洗浄バッファーI（; 400のNaCl、1mMのEDTA、pHが7.4、および0.2 mMのPMSF、20mMのトリス-HCl、pH7.4）で300mlでアミロース樹​​脂を洗ってください。
  4. 洗浄バッファーII（20mMのT 150mlで洗浄を繰り返し立上り - 塩酸、pHが7.4、NaClが200 mM、1 mMのEDTA、pHは7.4であり、0.2 mMのPMSF）。
  5. カラムに、4℃で10分間インキュベートする、収集溶出緩衝液5mlの（; 200mMのNaClを、図1 mMのEDTA、pHが7.4および0.2 mMのPMSF、10mMのマルトース20mMのトリス-HCl、pHが7.4）を追加もっと回溶出を繰り返し。
  6. 溶出液を組み合わせ、クマシー染色（ 図4）に続いて、SDS-PAGEゲル上で溶出液のアリコートをロードすることにより、MBP-Mgm101の収率および純度を決定します。

3。プレシジョンプロテアーゼ切断及び陽イオン交換クロマトグラフィー

  1. MBP-Mgm101溶出液にプレシジョンプロテアーゼの50単位を追加します。 4℃での切断を行うCO / Nし、透析緩衝液に対して透析中継続することができ（20mMのトリス-HCl、pH7.4の、100mMのNaCl、2mMのDTT、1mMのEDTA、pHは7.4であり、0.2 mMのPMSF）
  2. SDS-PAGEゲル（ 図5A）の切断の効率を確認してください。
  3. 複数の注入によって切断MBP-Mgm101を読み込むバイオスケールミニマクロプレップハイSカートリッジのイオンは、Bio-Rad社の生物学的DuoFlow FPLCシステムに接続。
  4. 300mMの、5mMの工程の塩勾配を適用することによって、陽イオン交換クロマトグラフィーを開始し、500mMの、混合液（5 mMの塩化ナトリウムによって作成され750mMのNaClを、1,000 mMの、10mMのリン酸ナトリウム、pH7.2の図1 mMのPMSF）とバッファーB（1MのNaCl、10mMのリン酸ナトリウム、pHは7.2、1mMのPMSF）。 0.5ml /分で、流量を設定してください。 Mgm101画分を回収し、SDS-PAGEゲル（ 図5B）上のタンパク質の純度を確認してください。

4。サイズ排除クロマトグラフィー

  1. 陽イオン交換クロマトグラフィーからのタンパク質画分を兼ね備えています。 GF平衡緩衝液（; 150mMのNaCl、1mMのEDTA、pH7.4の、5mM 2 - メルカプトエタノール、0.2mMのPMSFを20mM MOPS、pH7.0）中でのタンパク質の透析。
  2. 4℃で3,000 xgで回転させて〜1ミリリットルの容積を減らすためにビバスピン15Rの限外ろ過スピンカラムにタンパク質を集中
  3. Mgm101 OのロードNAはクロマトグラフィバッファー（; 150mMのNaCl、5mMのβ-メルカプトエタノール、1mMのEDTA、pH7.4の、0.2 mMのPMSFを20mM MOPS、pH7.0）で平衡化したスーパーロース6プレップグレードカラムをキャリブレーション。
  4. 0.5ml /分の流速でクロマトグラフィーを実行する緩衝液を用いてサイズ排除を開始する。
  5. 精製Mgm101ピークの画分を集め。タンパク質の最終品質をチェックするための12％SDS-PAGE上の画分のアリコートをロードします。
  6. ビバスピン6タンパク質を集中し、その後速やかに-80℃で液体窒素とストアでサンプルを凍結℃に
  7. 一本鎖DNA結合アッセイ（ 図8）および透過型電子顕微鏡（ 図9）による構造可視化のための6-12カ月以内にMgm101サンプルを使用。

結果

Mgm101はミトコンドリアにおけるRAD52関連の組換えタンパク質である。 RAD52が広くミトコンドリアDNA組換え（ 図1）におけるその役割のために研究されてきた。組換えMgm101は、3段階の手順（ 図2）により調製することができる。これは、Mgm101が可溶型で発現することができ、その後、タンパク質分解的切断（ 図3）により、タグから放出MBP-タグ付け戦略の?...

ディスカッション

これは、Eから安定した、ネイティブ換えMgm101タンパク質を産生するために課題となっている細菌細胞におけるその不溶性が原因の可能性大腸菌 。本稿では、MBP融合戦略はタンパク質が適度に高いレベルで発現されることができることを示している。ネガティブ染色透過型電子顕微鏡およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、我々は以前にMBP-融合タンパク質は、インビ...

開示事項

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

私たちは、透過型電子顕微鏡で助けステファンウィルキンスに感謝。この作品は、健康グラントR01AG023731の国立研究所によってサポートされていました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Expression vector pMAL-c2ENew England Biolabs#N8066S
PreScission ProteaseGE Healthcare Life Sciences#27-0843-01
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL cellsStrategene#230245
LeupeptinRoche Applied Science#11034626001
PepstatinRoche Applied Science#11359053001
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Roche Applied Science#10837091001
DNAse ISigma#DN25-1G
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Roche Applied Science#11411446001
Amylose resinNew England Biolabs#E8021L
Econo-Column chromatography columnBIO-RAD#7372512
Bio-Scale Mini Macro-Prep High S cartridge (1 ml)BIO-RAD#732-4130
VIVASPIN 15R Ultrafiltration spin column (10,000 MWCO)Sartorius Stedium#VS15RH02
Superose 6 prep grade columnAmersham Bioscirnces#17-0489-01
VIVASPIN 6 Ultrafiltration spin column (5,000 MWCO)Sartorius Stedium#VS0611

参考文献

  1. San Filippo, J., Sung, P., Klein, H. Mechanism of eukaryotic homologous recombination. Annu. Rev. Biochem. 77, 229-257 (2008).
  2. Bishop, D. K., Park, D., Xu, L., Kleckner, N. DMC1: a meiosis-specific yeast homolog of E. coli recA required for recombination, synaptonemal complex formation, and cell cycle progression. Cell. 69, 439-456 (1992).
  3. Shinohara, A., Ogawa, H., Ogawa, T. Rad51 protein involved in repair and recombination in S. cerevisiae is a RecA-like protein. Cell. 69, 457-470 (1992).
  4. Passy, S. I., et al. Human Dmc1 protein binds DNA as an octameric ring. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 10684-10688 (1999).
  5. Story, R. M., Weber, I. T., Steitz, T. A. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer. Nature. 355, 318-325 (1992).
  6. Yu, X., Jacobs, S. A., West, S. C., Ogawa, T., Egelman, E. H. Domain structure and dynamics in the helical filaments formed by RecA and Rad51 on DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 8419-8424 (2001).
  7. Conway, A. B., et al. Crystal structure of a Rad51 filament. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 791-796 (2004).
  8. Bai, Y., Davis, A. P., Symington, L. S. A novel allele of RAD52 that causes severe DNA repair and recombination deficiencies only in the absence of RAD51 or RAD59. Genetics. 153, 1117-1130 (1999).
  9. Bai, Y., Symington, L. S. A Rad52 homolog is required for RAD51-independent mitotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 10, 2025-2037 (1996).
  10. Paques, F., Haber, J. E. Multiple pathways of recombination induced by double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 349-404 (1999).
  11. Lopes, A., Amarir-Bouhram, J., Faure, G., Petit, M. A., Guerois, R. Detection of novel recombinases in bacteriophage genomes unveils Rad52, Rad51 and Gp2.5 remote homologs. Nucleic Acids Res. 38, 3952-3962 (2010).
  12. Poteete, A. R., Sauer, R. T., Hendrix, R. W. Domain structure and quaternary organization of the bacteriophage P22 Erf protein. J. Mol. Biol. 171, 401-418 (1983).
  13. Passy, S. I., Yu, X., Li, Z., Radding, C. M., Egelman, E. H. Rings and filaments of beta protein from bacteriophage lambda suggest a superfamily of recombination proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 4279-4284 (1999).
  14. Ploquin, M., et al. Functional and structural basis for a bacteriophage homolog of human RAD52. Curr. Biol. 18, 1142-1146 (2008).
  15. Chen, X. J., Guan, M. X., Clark-Walker, G. D. MGM101, a nuclear gene involved in maintenance of the mitochondrial genome in Saccharomyces cerevisiae. Nucl. Acids Res. 21, 3473-3477 (1993).
  16. Meeusen, S., et al. Mgm101p is a novel component of the mitochondrial nucleoid that binds DNA and is required for the repair of oxidatively damaged mitochondrial DNA. J. Cell Biol. 145, 291-304 (1999).
  17. Mbantenkhu, M., et al. Mgm101 is a Rad52-related protein required for mitochondrial DNA recombination. J. Biol. Chem. 286, 42360-42370 (2011).
  18. Nardozzi, J. D., Wang, X., Mbantenkhu, M., Wilkens, S., Chen, X. J. A properly configured ring structure is critical for the function of the mitochondrial DNA recombination protein. Mgm101. J. Biol. Chem. 287, 37259-37268 (2012).
  19. Zuo, X., Xue, D., Li, N., Clark-Walker, G. D. A functional core of the mitochondrial genome maintenance protein Mgm101p in Saccharomyces cerevisiae determined with a temperature-conditional allele. FEMS Yeast Res. 7, 131-140 (2007).
  20. Itoh, K., et al. DNA packaging proteins Glom and Glom2 coordinately organize the mitochondrial nucleoid of Physarum polycephalum. Mitochondrion. 11, 575-586 (2011).
  21. Janicka, S., et al. A RAD52-like single-stranded DNA binding protein affects mitochondrial DNA repair by recombination. Plant J. 72, 423-435 (2012).

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