ピコニュートンとミリ秒の分解能で基板への軸索の接着性を評価するために、レーザー誘起軸索病変の間にテンションリリースの測定

要約

我々は部分的に軸索の膜に付着した光学的に捕捉されたプローブで行わ同時力分光測定によってレーザーディセクタで損傷された軸索の緊張放出を測定した。開発された実験プロトコルは、培養基板に軸索の接着性を評価します。

要約

現像神経回路網内の機能的な結合の形成は、外因性の合図によって影響される。開発ニューロンの神経突起成長は化学的および機械的信号、および機械的な信号に、それは感覚や反応があまり理解されているのメカニズムに従うものとします。細胞成熟の力の役割を解明することは、基板に細胞接着および細胞骨格の結合を促進し、従って損傷後の神経再生するために、異なるタイプの能力を向上させることができる足場の設計を可能にする。

ここでは、レーザ誘起細胞の病変中に同時力分光測定を適用する方法について述べる。私たちは、軸索の膜に付着した光学的に捕捉されたプローブの同時干渉追跡によって部分的に病変軸索に張力放出を測定。我々の実験的なプロトコルは、ピコニュートン感度の張力解放を検出し、テンションリリースの動的にミリ秒の時間分解能。従って、細胞と基質との間の機械的結合が薬物治療及び/又は基板の別個の機械的特性により変調することができる方法を研究するための高解像度の方法を提供する。

概要

光学顕微鏡は、生きた細胞を観察するために使用できる、低侵襲イメージング·システムの一つである。そのような放射圧（光ピンセット¹のように）、または高エネルギー光子束（レーザディセクタ²のように）として作用の利用では、この技術は、ナノ操作まで延長された。光学撮像システムは^、3つのサブ細胞標的を視覚化して操作するための正確な制御を供給する。同時に、送達レーザパワーの正確な較正のおかげで、光ツールは前例のない再現性のいずれかまたはソフト侵襲試料操作を実現する。

いくつかの研究室は、異なるセル^5が互いに融合したり、光学的に貨物^6,7を駆動することにより細胞を刺激し、細胞小器官^4を焼灼するために、同じ実験設定、光ピンセット、レーザディセクタに、統合された。光ピンセットは、光学剛性のキャリブレーションした後、可能にする一方でピコニュートンスケールのセルに印加される力の制御は、レーザ切開システムは、膜の光ポレーションからサブ細胞構造の単一細胞小器官又は解剖の切除の範囲光学的操作を調節することができる。しかし、レーザー解剖校正は、主に試料⁸に生じた形態学的変化を示す画像分析に基づいてサンプルに送達されるエネルギー、光に対する操作のエンティティの定性的評価に依存している。提示手法では、ピコニュートンスケール、サブ細胞区画⁹の細胞骨格構造の変化した平衡によって生成力に、定量化するために、開発ニューロンのレーザー軸索の解剖時に力の分光測定を実行する方法を示します。培養されたニューロンは、基板に付着し、開発中に分極する。偏光位相は、in vitroで最初の5日の間に発生します。偏光の第二段階では、EXTRUDの一つるの突起が長くなり、それが軸索¹⁰になるように分化する。成長円錐での牽引力に応じて、軸索の伸びが以前Dennerlのモデル¹¹でモデル化されています。最近では、このモデルは、細胞外マトリックスの基材への密着性神経突起の役割を含むように^12を拡張されている。実験観察¹³後提案この生物物理学的モデルは、神経突起に沿って伝搬する、成長円錐に力を引っ張ったことを示した、基材への接着斑によって変調される。同様に、軸索の病変は、細胞体に向かって伝播する緊張の局所放出を生成します。従って、我々は病変と細胞相馬間軸索に沿った位置でこのような解放の張力を測定することは影響を受けない接着斑の減衰成果を評価するための可能性を提供することを提案。

私たちは、招いた軸索damagの程度を制御するために必要なエネルギーレーザーディセクタのフォトンフラックスを校正電子、完全離断からの部分的な病変へ。キャリブレーションに続いて、我々はいくつかの差別化ニューロンの軸索への部分的な病変を繰り返すとテンション放出を定量化するためのプロトコルを開発し、これにより基板¹⁴に軸索の密着性を推定するための定量的なパラメータを取得しました。

本研究では、詳細にはそのような化学的処理^14、または細胞培養担体異なるタイプのような異なる実験条件では、基板への軸索の密着性を評価し、ピコニュートンの感度と比較する正確な実験手順を表す開発されたプロトコルを記述する。

プロトコル

1。光学装置

光学系全体は、前述¹⁵について説明した。簡単に言えば、光ピンセットシステムは波長1064nm（IPGレーザー社）におけるイッテルビウム連続波（CW）ファイバレーザの動作に基づいている。空間光変調器（SLM）（LCOS-SLM、モデルX10468-07 - 浜松）はコンピュータ生成ホログラムによって培養皿上でトラッピング焦点スポットの位置を制御するために、着信IRレーザービームの位相を変化させる。自由に利用できるブルーピンセットソフト（機器·テーブル上のWebリンク）空間光変調器に投影された生成されたホログラム。フォトダイオード（PD、PDA100A-EC - ソーラボ） - 力分光測定用干渉計は、4象限フォトダイオード（浜松C5460SPL 6041ボードとQPD、S5980）に基づいていた。

355nmの（ - ティームフォトニクスPNV-001525から040、パワーチップのナノパルスUVレーザー）でのYAGレーザー：レーザー解剖ソースはパルスサブナノ秒のUV Ndのだった。音響光学変調器は、（MQ110-A3-UV、355nmの溶融シリカ-AA-光電子）のサンプルに配信UVレーザーのパワーを制御した。

顕微鏡のobjective.The段は3軸リニアDCモータマイクロポジショニングで構成されている浸60X、0.9 NA水装備 - ホログラフィック光ピンセットやレーザーマイクロ切開は修正正立顕微鏡（オリンパスBX51）に統合されましたのサブナノメートルの分解能で試料の粗動を結合する別個の3軸圧電ナノ位置決めステージ（P-733.3DD、物理学機器）を搬送するシステム（M-126.CG1、物理学機器）ピエゾ舞台。顕微鏡ステージ·システムは、2つのコントロールが相乗的に、右側の位置に捕捉焦点スポットを維持するために作用する選択された作業モード（位置またはクランプ力、静的または動的^）16に応じたループを備えていた。具体的には、内部フィードバックループは、選択時にビードを維持するために、圧電ステージに作用するトラップ中心からED距離。他の外部ループは、その利用可能なストローク¹⁷よりも大きな面積にピエゾアクチュエータで張ら地域を悪用する電動ステージの位置を制御する。それが試料に付着した捕捉されたビードを追跡しているので、ピエゾステージが一方向に利用可能なストロークの限界に達したときに、外部ループは反対方向に微小ステージを移動させ、これによりピエゾは、その中心位置に向かって回復する。ピエゾステージはそのコース範囲の中心位置に到達すると、マイクロステージが停止する。 システムのさらなる詳細はGuiggiani ら ^16,17に報告されている。

ペルチェ素子（TC-344BデュアルチャネルヒータコントローラとQE1抵抗加熱 - ワーナーインスツルメンツ）顕微鏡（37°C）の下での細胞培養の温度を制御する。文化では、pHと湿度は、カスタム設計されたポリジメチルシロキサンを通気することにより生理的条件に維持した加湿カーボゲン（95％O _{2、5％CO 2）}とシロキサン（PDMS）スリーブ（顕微鏡対物レンズを統合）。

2。細胞培養の準備

全ての実験プロトコルは、イタリア保健省によって承認された。初代培養物は、胎生18（E18）において、マウスの海馬（C57BL6J、チャールズリバー）から入手した。

1. ニューロンは、ガラス底ペトリ皿（ - MaTek社P35G-0-14-C）上に25,000細胞/ mlの濃度で播種した。培養細胞の低濃度は、in vitroでの最初の数日間に既に密なネットワークの形成を回避するために必要とされる。上述の細胞濃度で、他のセルに接続していない長い突起を有する単離された細胞を発見する可能性がはるかに高い。

3。ビーズコーティング

1. ポリマー微小球は（Ø4ミクロン、COOH終端-前髪研究所、製品コードPC05N/6700）ポリで被覆したpolyLinkタンパク質結合キット（Polysciences社、製品コード19539）に記載の手順に従って-D-リジン。ビーズを培養支持体と好意細胞接着をカバーするために使用される同じ分子で被覆されている。

4。隔離されたニューロンを選択してください。培養基質、トラップからビーズをデタッチし、ニューロンの隣にそれを移動します

1. 顕微鏡ステージ上で文化ペトリ皿を置く。ステージ運動により試料上にフォーカスを設定した後、ケーラー照明を設定する照明客観コンデンサーの位置を修正します。 Kolher、照明条件を設定する照明光学系を位置合わせすると、明視野像品質を向上させる必要がある。このような整列条件を用いて、それがQPDとPDによって、その干渉追尾を実行するように、散乱閉じ込められたプローブから、また、IRレーザ集効率（対物レンズを介して凝縮器）を最大化することが必要である。
2. でコーティングされたマイクロスフェア原液を数μlのピペット培養皿へ。ミクロスは、預金と培養基質に付着する。培養皿に注入液の数は、原液のミクロスフェア濃度に依存する。理想的な条件は、1と2のビューの画像につきミクロスフェアフィールド間を持つことです。あまりに多くの微小球培養皿に追加されると、彼らはすでに培養ニューロンにランダムに添付することができます。
3. 長い神経突起（軸索）孤立ニューロンを探し、培養皿の中を移動し、顕微鏡ステージの位置を保存します。
4. 周りに移動し、培養支持体に付着したビーズを検索。
5. IRトラッピングレーザーをオンにします。この段階では、まだホログラムがSLM上に投影されず、IRレーザスポットの位置は、UVレーザスポットの位置と一致する。顕微鏡ステージの運動によって2-3μmの培養支持体表面上のIRスポットの軸方向の位置を設定します。
6. 1未満μW、サンプルに送達UVレーザパワーを設定する。ザUVレーザー解剖器具は、以前^14をキャリブレーションされています：
   5-6μWガラス支持体がアブレーションさ
   4μWニューロンの接続が完全に解剖される
   神経突起の一部が損傷されている2.5μW
   <1μW衝撃波は、培養皿で製造される。光衝撃波は、ガラス支持体からビードを取り外すのに十分な強度である。
7. にIRレーザーを残しながら、UVレーザーをオンにし、顕微鏡ステージの運動によって付着ビーズ上記UVスポットを移動します。ビーズ表面から切り離され、そしてそれがIRレーザーによって捕捉される。その後、UVレーザーをオフにします。
8. ガラス支持体（20〜30ミクロン）上にトラップされたビーズの数μmを移動します。この位置にビーズを持ち上げると、それは以前に選択したニューロンに向かって移動している間、他の細胞に接触するからそれを防ぐことができます。以前に保存したステージ位置にビーズを持参。ドラグ流体力光学トラップを超えないように、低い値（10ミクロン/秒）にステージ速度を設定するpingの力。

5。計算機ホログラムによるレーザーディセクタスポットとアクソン位置に対するトラップの位置を移動し、光ピンセットの剛性を校正

1. 軸索を可視化するためにガラス支持体に向かってビーズを移動します。ビードは、それ（約5μmのガラス支持体上）との接触を避けるために、セルの上方に保持されている。
2. 軸索の幅の中心にUV焦点スポットを移動するために顕微鏡のステージを移動します。現在のステージ位置を保存します。
3. 計算機ホログラムによりIR焦点スポット位置を移動します。このステップでは、ステージが前のステップで選択した位置で停止される。計算機ホログラムがSLM上に投影されるとき、捕捉ビーズは、軸索に対して移動される。我々はあまりにも同じ神経突起を中心としたUVレーザスポットで、追い込まれたビーズは、神経突起の中央に揃えているようにIRレーザスポットを移動します。 IRスポットしたがって、トラップビードが神経突起に沿って配置されている5-10程度離れてUVスポットから。私たちは、神経突起の形状に応じて、UVスポットに対するIRの位置を移動。光ピンセットは、SLMシステムが装備されていない場合には、位置がIR光路上の可傾ミラー、又は音響光学偏向素子によって変化させることができる。 IRレーザスポットは、そのブラウン運動に影響を及ぼす力分光法トレースを変えることができる閉じ込められたプローブを有する切開ビームの光の相互作用を避けるために、UVスポットから離れる5-10ミクロンを配置することができる。
4. UVスポットと軸索の位置に対して新しいIRスポット位置を定義した後、軸索から閉じ込められたビーズを配置し、それとの衝突を避けるために、ステージを移動します。カバーガラス上の2程度にトラップされたビーズの軸方向の位置を移動します。
5. その上に干渉縞がセンターにQPDを合わせ：xとy QPD差動信号はQPDが中央に配置さゼロです。 interferoによってトラップビーズのブラウン運動の5秒を取得メートル、50 kHzのサンプリングレートで。パワースペクトル法¹⁸による光学トラップの剛性（PN / nm）で、感度（V / nm）を取得します。

6。アクソンにビーズを取り付けます。軸索切断と同時力測定を実行

1. カバーガラス上が4μm程度トラップビーズの位置を上げ、以前に保存したステージ位置（ステップ3.2を参照）に移動します。
2. 軸索に向かって閉じ込められたビーズダウンを移動し、それが接触する神経突起をするまで。捕捉されたビードと軸索との間の衝突を軸方向に捕捉されたビードの変位を検出zのQPD信号により監視される。
3. トラップされたビーズと10秒待つと、神経突起の膜への密着性を支持する軸索に押し付け。
4. 軸索から閉じ込められたビーズを変位させるマイクロステージを移動し、これにより細胞膜への付着を確認します。ビーズが付着した場合、それは光学トラップから逃げる。
5. 付着したビーズ上のレーザートラップを戻すとゼロに等しい力条件を持つ力クランプ·ループをオンにします。光学トラップ中心のセルに添付されたように、ピエゾステージ再配置ビーズ、、で。システムは、フィードバックループ制御を持たない場合、レーザトラップ位置を中心it onに付着したプローブ顕微鏡ステージによって移動させることができる。 QPD信号が捕捉ビーズおよび細胞（xおよびy QPD信号がゼロに等しく、およびz QPD信号は、4つの象限の同じ電圧の和を与えるに接着されていない場合と同じである場合、トラップの中心に到達する）ビーズは、任意の表面から遠くにトラップされたときなど。
6. 付着閉じ込めプローブ上のプリテンションを生成するために、ビーズ（約100nm）の中央やや上のトラップレーザーを配置、z軸上の力クランプ条件を設定します。システムは力クランプ制御が装備されていない場合には、光学トラップ位置を顕微鏡ステージによって25nmのステップで最大上昇させることができる。 Z QPD信号が監視できます。したがって、THIを使用sが付着したプローブに対するレーザトラップの位置を設定するシグナル。このようなプリテンションは、軸索病変後の膜の緊張、および付着したプローブのブラウン運動の結果として生じる減少を感知するために必要とされる。同様のアプローチは、ビデオ撮像¹⁹による膜テザーに張力の放出を測定することが提案されている。
7. スイッチオフ位置クランプ条件（ピエゾステージがブロックされている）に付着したプローブ上の力を測定するための力クランプフィードバック。
8. レーザー軸索切断タイムラプス明視野イメージング（20 Hzのフレームレート）の間の干渉計（20 kHzのサンプリング周波数）と、セルを閉じ込めプローブ位置の同時録画を開始します。
9. 病変は軸索の画像上に見えるようになるまでのレーザパルスを提供するためにUVレーザーをオンにします（通常は200-400光パルスが必要とされるパルスあたりのエネルギー：25 NJ）、その後、UVレーザーをオフにします。
10. 約3マイルのために干渉計によって記録を継続にn、x、y及びz QPDトレースがプラトーに達するまで。

7。合計テンションリリースを定量

1. ナノメートルのそれぞれのトレースを取得するために、光学トラップの校正された感度で録音しQPDトレース（ボルト）に変換します。
2. 10Hzでカットオフを有するハイパスフィルタによってx、y、およびz変位トレースをフィルタリングする。
3. トラップされたビーズのブラウン運動を表すフィルタトレースの全​​分散を計算します。 500ミリ秒（10,000データポイント^）20の時間ウィンドウの重複は25ミリ秒ステップで分散を計算します。トレースのフィルタリングハイパス、膜変動または皮質アクチン運動によるブラウン運動の変化を除外します。ビードのブラウン運動は、細胞膜上の光学力及び密着力によって低減される。膜は、その粘度が増加する張力の解放ので、ビードのブラウン運動の緊張したとき、直ちに、検出されたately軸索切断後、減少し始める。
4. UVレーザーエネルギーの送達後に、ブラウン運動の分散の減少の始まり：T0を定義します。時刻t0においては、膜の株の始まりを示す。
5. ブラウン運動の差異（それはプラトーに達したとき）の減少の終了：T1を定義します。時刻t1は、膜株の終了を示す。
6. 力測定時の試料のいずれかのドリフトを測定するために、カバーガラス支持体上に破片や傷のビデオトラッキングを行う。ガラス支持体上に粒子を追跡するには、まず、黒の背景に白の粒子とバイナリイメージのスタックを取得するために、明視野画像にしきい値を適用する。そこで、サブピクセル精度（フリーのImageJソフトウェアを使用して）質量の粒子の中心を追跡する。
7. 変位QPDトレースから測定されたドリフトを減算。それぞれの校正された光学剛性（K _X、kでドリフト補正QPD痕跡を掛ける _{Y、K z）はピコニュートンのFX、FY、Fzはトレースを取得します。}
8. F _TOT =√（Fxの² + Fyを² + Fzの^2）と全体の力トレースを計算します。
9. F _TOT（T0） - F _解放 = F _TOT（T1）としてt0とt1の間の力の合計のリリースを計算します。それはトラップの中心からのプローブの変位によるものですので、t0で測定された力は、減算されなければならないときに神経突起にビーズ付着。
10. 捕捉されたビーズとUVレーザスポット位置との間の神経突起の接触面積を計算する：明視野像に捕捉されたビーズとUVレーザスポット位置との間の神経突起（L）の長短（D）の軸を測定する。軸索の接触面積が_軸索である=長さ×D.
11. によって_放出合計解放力Fを正規 軸索接触面積_軸索 。

結果

セルは、その焦点癒着により基板上に牽引力を発生。細胞骨格要素によって生成された力は、培養基質の反作用力と平衡状態にある。神経突起のレーザ誘起病変した後、細胞骨格緊張ケーブルの一部が破壊され、基板密着性の対向する力が除去されているので、それらの平衡化張力が解除される。解放張力は、部分的に影響を受けない接着斑に分布し、細胞膜に付着ビード、光学トラップに?...

ディスカッション

我々は、この研究でレーザー誘起細胞の病変中に同時力分光測定を行うことにより、培養基板への密着性神経突起を比較する定量的な方法を報告する。緊張の測定されたリリースは、基板への細胞の付着の度合いに関係している：接着斑数の多い細胞が少なく緊張を解放する必要があります。ピコニュートンの面で緊張の放出を測定することは、異なる実験条件¹⁴で培養支持体に軸索...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Polymer microspheres, 4 μm, COOH coated	Bangs laboratories	PC05N/6700
PolyLink Protein Coupling Kit	Polyscience	19539
EQUIPMENT
IR laser	IPG Laser GmbH	YLM-5-SC-LP	ytterbium continuous wave (CW) fiber laser operating at 1064 nm, with linear polarization
Spatial light modulator	Hamamatsu	LCOS-SLM 10468-07
Blue-tweezers software	Optics group, University of Glasgow	Free downloadable software	http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/
ImageJ	Hamamatsu	Free downloadable software	http://rsbweb.nih.gov/ij/
QPD	Thorlabs	S5980 with C5460SPL 6041 board	Four quadrant photo-diode to measure x, y trapped probe displacement
PD	Teem Photonics	PDA100A-EC	Photodiode to measure z trapped probe displacement
nano-Pulse UV laser	AA-optoelctronics	PNV-001525-040	Pulsed UVA laser, pulse length 400 ps
Acoustic Optic Modulator	Olympus	MQ110-A3-UV, 355nm fused silica
Upright microscope	Andor	BX51	Equipped with a 60, 0.9 NA, water dipping objective
CCD	Warner Instruments	V887ECSUVB EMCCD
Peltier device	Physic Instruments	QE1 resistive heating with TC-344B dual channel heater controller
Microscope stage: micro+piezo stage	National Instruments	Three linear stages M-126.CG1 carrying a separate 3-axis piezoelectric nano-positioning stage P-733.3DD
Daq		NI PCI-6229	Acquiring the x, y, z position of the trapped probe, and sending feedback loop signals to microscope stage
Linux Real Time Application Interface (RTAI) machine			Real time feedback loop system, to control stage position, developed on a dedicated PC desktop