初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降

要約

蛍光標識したオートファジーマーカーのタイムラプス顕微鏡は、高時間分解能とダイナミックオートファジー応答の監視ができます。 3つの異なる色の組み合わせで特定のオートファジーとオルガネラのマーカーを使用して、我々は強固な空間的·時間的文脈におけるオートファゴソーム形成にタンパク質の寄与に従うことができます。

要約

自食作用は、特に栄養素の不足、アミノ酸の欠如によって引き起こされる細胞応答である。自食作用は細胞質、長寿命のタンパク質およびタンパク質凝集体であっても、欠陥のある細胞小器官、およびウイルスまたは細菌を隔離ファゴソームと呼ばれる二重膜構造の形成、によって定義される。オートファゴソームは、最終的に細胞質に戻ってリサイクルされる生産の栄養素と、そのコンテンツのバルク劣化につながるリソソームと融合。そのため、オートファジーは、細胞の恒常性のために重要であり、オートファジーの調節不全は、疾患、特に神経変性、老化やがんにつながることができます。

オートファゴソームの形成は、細胞がコアオートファジー機械と呼ばれる、タンパク質の特定のグループを割り当てているため、非常に手の込んだプロセスです。コアオートファジー機械は機能MEMBRANで例えば 、多様な細胞プロセスに関与する付加的なタンパク質によって補完されミトコンドリアとリソソーム生物学におけるe密売、。オートファゴソームの形成と分解のためのこれらのタンパク質の調整はオートファジーの非常にダイナミックで洗練された応答を構成している。ライブセルイメージングは​​1つが、単一のオートファゴソーム形成のイベントのレベルまで各オートファジー関連タンパク質の分子の寄与を下に従うことができ、リアルタイムで、そのためこの手法は、高い時間·空間分解能を提供しています。

ここでは、我々の分析のための空間的および時間的なコンテキストを確立するために、安定的にGFP-DFCP1を発現する細胞ラインを使用。オートファゴソームの形成につながる前駆構造ですDFCP1マークomegasomes、。目的のタンパク質（POI）は、赤やシアン蛍光タグのいずれかをマークすることができます。ミトコンドリアとリソソームERのような別の細胞小器官は、、、すべてのオートファゴソーム形成の異なるステップに関与しており、特定のトラッカーの染料を使用してマークすることができます。 AUTOPのタイムラプス顕微鏡この実験的なセットでhagyアップ、情報が四次元、 すなわち時間について抽出することができます。したがって、我々は時間と空間にオートファジーにPOIの寄与に従うことができます。

概要

自食作用は^1-3オートファゴ形成の最終的な結果のために多数のタンパク質の調整を必要とする非常に動的なプロセスである。顕微鏡は、おそらく最も一般的にオートファジー^4を研究するための適用手法です。最もファジータンパク質の局在化は、広く両方の内因性タンパク質を免疫染色することによって及び蛍光標識外因性タンパク質の発現により、固定細胞において研究されている。また、電子顕微鏡（EM）、単独および免疫金標識との組み合わせでは、これらの構造^5,6の細部を説明した。時間-これらの技術は空間の3次元のオートファゴソーム形成の我々の理解を確立しているという事実にもかかわらず、彼らは4 ^番目の次元の情報の十分な量を提供するために失敗している。それはpossiとして近くにオートファゴソームの形成に続くことができるようにライブセルイメージングは​​この障壁を克服リアルタイム^7〜BLE。この技術は、第吉森ら⁸によってファジーを研究するために用いられ、今後ますます使用されている。

タイムラプス顕微鏡は、生きた細胞内で、一定期間にわたってPOIの局在をキャプチャします。よく特徴付け自食作用および/または細胞小器官マーカーでこの情報を比較することにより、生細胞画像解析は、オートファゴ形成の大きな空間的および時間的文脈でPOIを置くことができる。固定された細胞のイメージングは​​、単一のキャプチャに基づいていながら、ライブセルイメージング解析は、オートファゴソーム形成のすべてのステップに沿ってPOI定位の繰り返し取り込みに基づいています。固定した細胞のイメージングが同時にlifecyの様々な段階で撮影多くのオートファゴソームにその平均ローカライズに基づいて、POIの役割のみを引き受けることができつつ、ライブセルイメージングは​​、オートファゴソーム形成の具体的なステップでPOIの貢献を証明することができますCLE。

ライブセルイメージングは​​、高パワーの分析方法であるが、考慮しなければならないいくつかの固有の限界を有している。まず、生細胞のイメージングは​​、1つ以上の外因性の蛍光標識タンパク質の発現を必要とする。蛍光タグのサイズは大きくなる傾向があり、彼らは、時には立体的理由のためにタンパク質の挙動を変更することができます。それらは膜の2次元の限られた空間で機能する必要があるとして、この状況は、膜タンパク質に対して強調されている。注目すべきは、オートファゴは膜構造であり、従ってそれらの形成は、膜結合タンパク質を大量に必要とする。

問題の別のセットは、POIの発現レベルに接続されている。原理的には、外因性タンパク質は、内因性タンパク質に匹敵するレベルで発現されるべきである。これは、そのサブ細胞内局在の重要な調節因子が飽和されないことを保証し、目電子分析は生物学的に関連するようになります。それらは、内因性レベル以上表される場合、それらはファジー応答^9を阻害する傾向があるので、さらに、ファジータンパク質の過剰発現は、避けるべきである。 POIの発現レベルは、光退色なしに時間の良い期間の後に、そのローカライゼーションを可能にするのに十分高くなければならないので、逆に、妥協点に到達しなければならない。哺乳動物細胞における外因性タンパク質の最適な発現レベルを達成するには、微調整の多くを必要とするが、それは安定してPOIのさまざまなレベルを発現する細胞株を確立し、スクリーニングすることによって実現可能である。

標準的な蛍光顕微鏡を用いて達成することができる空間分解能は別の制限要因である。解像度はいくつかの理由のために制限することができるが、最高の状態で、横方向の分解能は250nmで前後になる。これは、これより小さい距離で区切られているオブジェクトが接続されている（または単一として表示されることを意味します250 nmのは、彼らが実際にあるより大きな画像で表現されますよりも小さな物体）とオブジェクト。したがって、画像は常に念頭に置いてこれを解釈されるべきで、そのようなEMなどの補完的な技術は細かい超構造の細部を解決する必要があります。

最後に、生細胞画像化は、本質的に長期間にわたって潜在的に、光に露出させるセルを必要とする。これは、セル、光毒性として知られる現象の生理学的応答を変化させることができる。

我々は正常にオートファゴソームがERストランド^10,11と密接に関連しているPI3P豊富なリング状の構造と呼ばomegasomes、由来することを初めて記述するPI3P結合タンパク質DFCP1のライブセルイメージングを使用している。我々は明らかにLC3陽性構造はomegasomesと密接に関連して形成し始めることが示されている。ここ細胞株を用いた生細胞に対して安定GFP-DFCP1を発現することを示唆している目的のタンパク質のイメージングは​​、オートファゴソーム形成におけるその役割の特性評価のための堅牢な空間および時間枠を確立します。

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プロトコル

1。細胞調製

1. （2の後の80％の密集度を目指す30〜40％のコンフルエントになるまで、ダルベッコ改変イーグルの培地（DMEM）中で一晩培養細胞、HEK-293T細胞の種低継数が安定的に22ミリメートルの円形のカバースリップ上GFP-DFCP1を表現日 - ライブセルイメージングの日）。

2。細胞トランスフェクション

1. 私は血清培地、3μl​​のX-tremeGENE 9 DNAトランスフェクション試薬、及びpECFP-LC3プラスミドDNA0.5μgのを減少させ、100μlのOptiMEM中を含む、各プレートのためにトランスフェクション複雑なミックスを調製する。とを上下にピペッティングにより穏やかに混合し、室温で15分間インキュベートする。 [注：我々は何度もそのようなリポフェクトアミン2000などの他のトランスフェクション試薬は、毒性の多くを持っていることを発見した、そして、それに加えて、彼らは多くの顕微鏡技術と干渉し、自分の上に蛍光粒子を生成します。]
2. プレートから培地を吸引し、新鮮なDMEM予め温め37℃を追加
3. TRANを追加ピペッティングにより細胞への複雑なsfection、24時間インキュベートした細胞。

3。オルガネラマーカー（オプション）を持つセル·インキュベーション

1. 75 nMの最終濃度DMEMにmitotracker / lysotrackerを追加し、露光、繰り返し凍結融解サイクルを避けるために、全体の実験日に沿って、アルミホイルで覆いファルコンチューブに、氷上で保持する。
2. mitotracker / lysotracker含有培地2mlのアリコートを取り出し、37℃で温める。トランスフェクトした細胞から吸引培地とmitotracker / 30用培地とインキュベート細胞含有lysotrackerと交換 - 60分。

4。生細胞イメージングのためのインキュベーションチャンバー（図1）の調製

1. きれいな金属、75％エタノールでOリングプラスチックと金属Oリングのリム上にシリコングリースを塗布してください。
2. 、プレートからカバーガラスを除去し、カバースリップの下側から媒体の過剰の乾燥鉗子を使用してこれは漏れの可能性を増加させるように、グリースが多すぎる培地を混合しないようにします。
3. 密閉チャンバーを作成するために、プラスチック製のOリングの棚の上に休ませ、その間に挟まれたカバースリップで、プラスチック製のOリングの上に金属製のOリングに合うようにカバースリップのままにしておきます。
4. プレートから媒体とチャンバアップトップ、この点から上に、DMEMの重炭酸塩緩衝系は人工的なCO ₂濃度を必要とするように、発生するpHの変化を防ぐために、緩衝剤を含まないDMEM培地での細胞の長期のインキュベーションを避ける5〜10％の、周囲の空気のCO ₂濃度が非常に低い。

5。細胞の飢餓

1. 顕微鏡ステージ上でインキュベーションチャンバーを置く。
2. 完全培地を吸引しないアミノ酸が、最終的にオートファジー応答を阻害するDMEMから、残っていないことを確実にするために、飢餓培地2mlで3回洗浄する。設定ONタイマー。

6。顕微鏡検査

1. 生細胞広視野落射用に構成されている適切なイメージング·システムが必要となる。これは、典型的には研究用倒立顕微鏡フレーム、蛍光タンパク質（単数または複数）/その他の染料（単数または複数）、高品質の対物レンズ、敏感なCCD / sCMOSに特異強烈な広域スペクトル光源、ミラーおよびフィルタを含む。カメラとインキュベーションチャンバー。 （すべての主要顕微鏡メーカーはライブセルイメージングに適した完全な広視野システムを提供していますが、それはメーカーの様々なコンポーネントを使用してシステムを家庭構築もすることが可能であり、そのようなマイクロマネージャーなどのオープンソースソフトウェアを使用してそれを制御します。http / / valelab.ucsf.edu /〜MM / MMwiki / ）。我々の意見で最も重要な側面は、蛍光レポーターの発現レベルを最小限に抑えることができるように高感度のシステムを使用することである。
2. SEL画像に適切なセルをecting。
   1. もっとオートファゴソーム形成のイベントをキャプチャできるようになります大規模でフラットなセルを選択します。また、すでにomegasomesより多くの生産を開始した細胞を選ぶ。
   2. ビデオあたりオートファゴ形成事象のより大きな割合を捕捉するためには、30分後またはウェルファジー応答にビデオキャプチャを開始する。
3. イメージング。
   1. 高倍率レンズ（100×1.4 NA）を使用します。
   2. 光退色を防止するために最大の10〜20％の励起光の強度を調整する。
   3. 100〜500ミリ秒の露出、2x2のビニングと100ゲインにカメラ（浜松ORCA ER、画素サイズ6.45μm）を設定します。
   4. 画像取得速度1フレーム毎に10秒に設定します。

7。 ImageJのとオートファゴソーム形成イベントのモンタージュを作成する

[これは、単に電子ためにマージされた映像をスキャンして非体系的な方法で行うことができる興味のある通気孔が、以下に概説するように、それはまた、体系化することができます。]

1. ImageJの/フィジーの3（または2）キャプチャチャネルのためのオープン画像スタック。
2. 対応するチャンネルに、赤、緑、青のLUT（ルックアップテーブル）を適用し、3色をマージし、保存します。
3. 分析]タブから、[ツール]> [ROIマネージャー]を選択します... >指定し、スタックの最初の画像で定義されたサイズのランダムな領域を選択します。
4. [イメージ]タブから、スタックの選択領域を複製するために、複製を選択します。
5. [イメージ]タブで、[スタック]を選択> [モンタージュを作る...キャプチャされたすべてのフレームを含む暫定的なモンタージュを作成します。完全なオートファゴソーム形成のイベントのモンタージュのすべてのフレームをスキャンし、イベントの最初と最後のフレームのノートを保つ。
6. 分析]タブから、[ツール]> [ROIマネージャー]を選択します...他の2色のためだけでなく、マージされた色のイメージと重複してスタックのスタックの最初の画像で同じ領域を選択します。
7. Tから彼はタブをファイル、[新規]> [イメージ]を選択し、高さに設定されたROIマネージャを使用して最初に選択されたピクセルの数に応じた幅に設定されて4回ROIマネージャで設定した高さに加え、3色との間のスペースのために3ピクセル各スタック内のフレーム数として合併し、設定スライス。
8. [イメージ]タブから、[スタック]> [ツール]> [挿入...、その後の間に1ピクセルのスペースを残して、別の上に各サブスタック1を挿入します。
9. [イメージ]タブで、[スタック]を選択> [モンタージュを作る...開始とキャプチャオートファゴソーム形成のイベントの最初と最後のフレームに仕上げモンタージュを作成します。

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結果

プロトコルは説明では、安定的にオートファジーを誘導する条件下では、GFPタグDFCP1を発現している細胞株におけるCFP-タグLC3の局在に従うことをタイムラプス顕微鏡を使用している。この実験の結果は、2シリーズまたはGFP-DFCP1とCFP-LC3に対応する画像、緑色から1と青のチャンネルから1つのスタックのキャプチャです。我々はさらに、プロトコルのセクションで説明したように、単一のオート...

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ディスカッション

このプロトコルに記載されている方法は、オートファゴソーム形成の間にタンパク質の局在を可視化することができます。我々は、ポイントスキャン共焦点、スピニングディスクを共焦点と全反射蛍光（TIRF）顕微鏡検査を含む説明イベントを可視化する様々な方法を試してみました。我々は、一般的な目的のために標準の広視野落射蛍光は感度と分解能との間の最良の妥協を提供することを...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	41965
OptiMEM I	Invitrogen	31985-062
MitoTracker Red FM	Invitrogen	M22425
LysoTracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent	Roche Applied Science	6365787001
22 mm coverslips	VWR	631-0159
35 mm plates	Fisher NUNC	153066
Silicon grease	RS Components Ltd.	RS 494-124
O-rings			Custom made
Attofluor Cell Chamber	Invitrogen	A-7816	Suggested alternative to custom-made O-rings
Microscope	Olympus	IX81	Inverted microscope
Objective	Olympus	UPLSAPO 100XO	N.A. 1.4, W.D. 0.13, FN 26.5
Camera	Hamamatsu	ORCA-R2 C10600 10B	Progressive scan interline CCD
Illuminator	TILL Photonics	Polychrome V	Ultrafast monochromator
Incubation chamber	Solent Scientific	Cell^R IX81
Software	Olympus	SIS xcellence